Yöntem makalesi

Drosophila Kullanan Heterokromatin-Teşvik Edici İlaçların Tanımlanması nda Bir Tarama Yöntemi

5.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/60917

⸱

12 Mart 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of California San Diego

Bu makalede

Özet

Drosophila kanser tedavisi için potansiyel uygulamaları ile tarama ilaçları için uygun yaygın olarak kullanılan deneysel bir modeldir. Burada, Heterokromatin oluşumunu teşvik küçük moleküllü bileşiklertarama için bir yöntem olarak Drosophila alacalı göz rengi fenotiplerin kullanımını açıklar.

Özet

Drosophila kanser tedavisi için yararlı olabilir bileşikleri taramak için kullanılabilir mükemmel bir model organizmadır. Burada açıklanan yöntem Drosophilakullanarak heterokromatin teşvik bileşikleri tanımlamak için bir maliyet-etkin in vivo yöntemidir. Drosophila's DX1 suşu, heterokromatin oluşumunun derecelerini yansıtan bir alacalı göz rengi fenotip sahip, böylece bir heterokromatin teşvik ilaç ekranı için bir araç sağlayan. Bu tarama yönteminde, göz variegasyonu gözün yüzey alanına göre ölçülür ve 1 ile 5 arasında bir ölçekte puanlandırılır. Tarama yöntemi basit ve hassastır ve bileşiklerin in vivo test edilmesine olanak tanır. Bu yöntemi kullanarak ilaç tarama kanser terapötik yararlı etkileri olabilir heterokromatin teşvik ilaçların belirlenmesi için hızlı ve ucuz bir yol sağlar. Heterokromatin oluşumunu teşvik bileşiklerin belirlenmesi de kanser gelişiminin epigenetik mekanizmaların keşfine yol açabilir.

Giriş

Heterokromatin gen ekspresyonunda merkezi bir rol oynayan, hücre bölünmesi sırasında kromozom ayrımını düzenleyen ve genom instabilitesi1'ekarşı korumada yoğunlaşmış bir DNA şeklidir. Heterokromatin bir gen baskı düzenleyicisi olarak kabul edilmiştir ve hücre mitoz sırasında kromozom bütünlüğünü korumak için2,3. Bu soy taahhüdü 4 sırasında histon H3 lizin 9 (H3K9me) di- ve tri-metilasyon ile ilişkilidir4,5. Ayrıca Heterokromatin Protein 1 (HP1) kromoetkialanı proteinlerinin işe alınmasının da heterokromatin ve gen ekspresyonunun epigenetik baskısı ile ilişkili olduğu kabul edilir6. Bu proteinler heterokromatin oluşumunun temel bileşenleri ve belirteçleridir.

Genomik istikrarsızlık kanserogenezteşvik genetik değişiklikler elde etmek için hücreleri sağlar yana, heterokromatin kanser gelişiminde daha tanınan hale geliyor ve kanser tedavisi için hedeflenebilir7,8. Şu anda heterokromatin oluşumuna yardımcı olmak için iyi kurulmuş hiçbir ilaç bulunmamaktadır. Burada heterokromatin oluşumunu teşvik eden küçük moleküllü bileşiklerin taranması için basit ve hızlı ama etkili bir yöntem salıyoruz. Tarama küçük moleküllü ilaçların bir kütüphane ile Drosophila tedavi ederek yapılır. Bu yöntem, heterokromatin düzeylerinden etkilenen DX1Drosophila suşundaki alacalı göz rengi fenotipinden yararlanır. DX1 sinekleri, heterokromatinizasyona bağlı olarak alacalı ekspresyonu/depresyonuna sahip yedi P[lac-w] transgeniiçeren bir tandem dizisi içerir, bu nedenle göz rengindeki variegasyonun derecesi heterokromatin seviyesini yansıtır. Özellikle, artan heterokromatin alacalı göz rengi (beyaz göz) artan oranda tespit edilebilir. Aksine, azalan heterokromatin P[lac-w] transgen ekspresyonu (kırmızı göz)9,10,11,12artan oranı ile tespit edilecektir.

Bu nedenle, ekspresyonu mevcut heterokromatin miktarıyla doğrudan ilişkili olduğundan, alacalı göz rengi fenotipüreten bu Drosophila transgen sisteminden yararlanıyoruz. Heterokromatin oluşumunu teşvik ettiğinden şüphelenilen bileşiklerin bulunması üzerine, batı lekesi gibi diğer yöntemler le bu şüpheyi doğrulayabiliriz. Bu heterokromatin teşvik edici maddeler ileride hastalarda klinik çalışmalar için daha da geliştirilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. İlaç kütüphanesi nin hazırlanması

  1. İstenilen konsantrasyonda uygun çözücü kullanılarak taranacak bir ilaç kütüphanesi belirleyin ve hazırlayın (örneğin, DMSO'da 10 mM).
    NOT: Bir ilaç kütüphanesi için özel bir örnek Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI) Gelişimsel Tedavi Programı (DTP) Onkoloji Seti III olduğunu. Bu setteki bileşikler 10 mM'de 10 mM'de %100 DMSO'da 96 kuyulu iki PP U-alt plakada 20 μL olarak sağlanır ve -20 °C'de saklanır. NCI Plate haritaları ve her ilacın temel kimyasal verileri aşağıdaki web sitelerinde bulunabilir:
    NCI plaka numarası 4740
    NCI plaka numarası 4741

2. Drosophila kullanarak heterokromatin teşvik edici ilaçlar için ekran

  1. Drosophila Üreme stratejisi (Şekil 1A)
    1. 1. Gün: Çapraz üç w1118/Y; DX1/CyO erkek sinekler ve üç veya daha fazla bakire w1118 dişi sinekler 25 mm x 95 mm gıda şişesi standart Drosophila gıda medya 9 mL (Bloomington tarifi). Her ilaç için üç şişe ve ekran için bir kontrol çoğaltmak ayarlayın.
      NOT: DX1 sinekler nazik James Birchler (Missouri Üniversitesi)9,13tarafından sağlanmıştır.
    2. 2. Gün ve Gün 3: Sineklerin oda sıcaklığında (22 °C) 2 gün boyunca yumurtlamalarına izin verin.
    3. 4. Gün: Ebeveyn sineklerini canlandırmak için kısa bir CO2 gazı patlaması kullanın ve ebeveyn sineklerini "sinek morgunda" (%70 alkol içeren bir şişe) atın.
  2. Tarama için Drosophila'ya ilaç yedirin.
    1. Her ilaç bileşiğini orijinal stoktan seyreltin (96 kuyulu PP U-alt plakalarda %100 DMSO'da 10 mM'de 20 μL) suda %33 DMSO ile 10 μM son konsantrasyona kadar seyreltin. Kontrol olarak herhangi bir ilaç olmadan suda% 33 DMSO kullanın.
      NOT: Bazı ilaçlar suda kötü çözünür ve DMSO'da çözünmüştür. %100 DMSO sinekler için zehirlidir. %33'ü tolere edilebilir.
    2. 4. Gün: Pipet 60 μL 10 μM uyuşturucu çözeltisi veya kontrol sinek gıda üstüne. Bu noktada, ebeveyn sinekler kaldırılmış olduğundan emin olun ve sinek yumurta ve gıda üzerinde ilk instar larvaları sürünerek vardır.
    3. 6. Gün: Aynı 10 μM ilaç çözeltisinin 60 μL'lik kısmını gıda şişesine tekrarlayın.
      NOT: Sinekli gıdaya ilaçlar eklenmiştir, üst yüzey gıdayaklaşık 10 μM konsantrasyon içerir ve alt gıda tam olarak nüfuz edilemez. Tüm sinekler gıda üstüne yumurta bırakır ve üst yüzey gıda yemek.
  3. Göz rengi değişikliklerini gözlemleyin ve puanleyin.
    1. F1 sinekleri ortaya çıktıktan iki gün sonra (yaklaşık 14. günde), sinekleri inceleyin. F1 sineklerini anestezik için kısa bir CO2 patlaması kullanın ve sinekleri şişelerinden bir filtre kağıdının altından geçerken CO2 yudumlarken gözenekli bir diseksiyon pedine çıkarın.
    2. Bu pedteki sinekleri bir diseksiyon mikroskobu altında inceleyin. Tüm sineği inceleyin ve w1118/Y'nin tamamınıtanımlayın; DX1/+ heterozigot erkeklerde CyO dominant kıvırcık kanat fenotipi nden yoksun olarak görülürler.
    3. W1118/Y'nin her birinin göz renginipuanla; DX1/+ heterozigot erkek 1 ile 5 arasında bir ölçekte uçar (Şekil 1B). Beyaz göz rengi yüzdesi aşağıdaki gibi derecelendirildi:
      1. <%5 kırmızı dağınık göz toplam yüzey alanı
      2. 6% - 25% kırmızı lekeler göz toplam yüzey alanı
      3. 26% - 50% kırmızı lekeler göz toplam yüzey alanı
      4. 51% - 75% kırmızı lekeler göz toplam yüzey alanı
      5. >%75 kırmızı lekeler göz toplam yüzey alanı
      NOT: Alternatif olarak, homojenize sinek kafaları 100% metanol ve OD 450 nm göz pigmentasyon ölçmek için bir spektrometre kullanın. PEV DX1 erkeklerde daha pronouced çünkü sadece erkek seçin. Her şişede 10'dan fazla erkek puan.
    4. Puanlanmış her şişedeki tüm erkeklerin ortalama renk indeksi hesaplayın. Her bileşik için triplicates gerçekleştirin (Şekil 1C).
      NOT: Göz rengi yaşa göre değiştiğinden, bu zamana duyarlı bir adımdır. Göz rengi aynı yaşta hesaplanmalıdır - 2 gün eski. Genellikle >10 sinekler her şişede puanlanmalıdır.
    5. Bileşiklerin heterokromatin oluşumunu gerçekten desteklediğini doğrulamak için, doğrulamak için batı lekeleme gibi farklı bir teknik kullanın (Şekil 1G).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokol, drosophilaheterokromatin oluşumunu teşvik bileşikleri taramabaşarıyla kullanılmıştır , hangi ilaç gelişimi için vivo sistemi etkili ve düşük maliyetli(Şekil 1). Drosophila melanogasterinin DX1 türünü kullanarak 97 FDA yetkili onkoloji ilacından oluşan onkoloji seti III adlı küçük moleküllü bir ilaç kütüphanesini taradık (Şekil 1B). Önemli bir ilacın sonuçları bir çubuk grafikte gösterilmiştir

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Heterokromatin gen ekspresyonunu düzenleyen merkezi bir rol oynayan yoğun bir DNA şeklidir. Bu kanser giderek daha fazla tanınan hale geliyor ve kanser tedavisi için potansiyel bir hedef olarak hizmet verebilir15,16,17,18. Küçük moleküllü bileşikler, insan vücudunda üretim, koruma ve metabolizmadaki avantajlar nedeniyle ilaç geliştirmede yaygın olarak kullanılmaktadır. Heterokromatin teşvik ede...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.

Teşekkürler

Biz J. Birchler, E. Bach ve Bloomington Drosophila Stok Merkezi çeşitli Drosophila suşları için teşekkür ederiz; Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI) Onkoloji Seti küçük moleküllü ilaç kütüphanesi için Gelişimsel Terapötik Programı; Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza ve Alex Chavez dahil UCSD lisans öğrencileri. Bu yayında bildirilen araştırma, American Thoracic Society'den J.L.'ye yapılan bir araştırma bursu ve NIH:R01GM131044'ten W.X.L'ye kadar fonla desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Drosophila DX1 < / em> suş DX1< / em> sinekleri, James Birchler (Missouri Üniversitesi) tarafından nazikçe sağlandı
Drosophila< / em> Gıda MedyasıUCSD sinek mutfağı
MetotreksatNCI ilaç kütüphanesi
Dimetil sülfoksit (DMSO)SigmaD2650
Etil alkolSigmaE7023-500ML

Kaynaklar

  1. Morgan, M. A., Shilatifard, A. Chromatin signatures of cancer. Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).
  2. Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals. Epigenetics Chromatin. 8, 3(2015).
  3. Allshire, R. C., Madhani, H. D. Ten principles of heterochromatin formation and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).
  4. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  5. Grewal, S. I., Moazed, D. Heterochromatin and epigenetic control of gene expression. Science. 301 (5634), 798-802 (2003).
  6. Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics & Development. 15 (5), 482-489 (2005).
  7. Ci, X., et al. Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (10), 2691-2704 (2018).
  8. Zhu, Q., et al. Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer. Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).
  9. Dorer, D. R., Henikoff, S. Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila. Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).
  10. Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S. Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays. Chromosoma. 107 (5), 286-292 (1998).
  11. Shi, S., et al. JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing. Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).
  12. Shi, S., et al. Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability. Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).
  13. Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes. Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).
  14. Loyola, A. C., et al. Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug. Scientific Reports. 9 (1), 11673(2019).
  15. Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression. Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).
  16. Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H. Heterochromatin: Guardian of the Genome. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 265-288 (2018).
  17. Zhu, Q., et al. BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing. Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).
  18. Hu, X., et al. Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Drosophila TaramasG z Varigasyonu SkorlamasDX1 Su uMetotreksat Tan mlamaWestern Blot Do rulamasHeterokromatin Olu umuKanser TedavileriIn Vivo Taramala K t phanesi Testi

İlgili makaleler