Farelerin Motor Korteksinde LazerE Bağlı Beyin Hasarı

Küresel olarak, inme ölüm ikinci önde gelen nedeni ve sakatlık üçüncü önde gelen nedeni¹. İnme de ağır sakatlık yol açar, genellikle tıbbi personel ve akrabalarıekstra bakım gerektiren. Bu nedenle, bozukluk ile ilişkili komplikasyonları anlamak ve daha olumlu sonuçlar için potansiyelini artırmak için bir ihtiyaç vardır.

Hayvan modellerinin kullanımı hastalıkları anlamak için ilk adımdır. En iyi araştırma sonuçlarını sağlamak için, tipik bir model basit bir teknik, karşılanabilirlik, yüksek tekrarlanabilirlik ve minimum değişkenlik içerecektir. İskemik inme modellerinde belirleyiciler beyin ödemi hacmi, infarkt boyutu, kan-beyin bariyeri ölçüde (BBB) arıza, ve fonksiyonel bozukluk genellikle nörolojik şiddet^puanı2 ile değerlendirilir .

Kemirgen modellerinde en yaygın olarak kullanılan inme indüksiyon tekniği orta serebral arteri (MCA) geçici veya kalıcı olarak^3. Bu teknik insanlarda olanlara benzer bir inme modeli üretir: bu konturlu alanı çevreleyen bir penumbra vardır, son derece tekrarlanabilir, ve iskemi süresi ve reperfüzyon düzenler⁴. Bununla birlikte, MCAO yöntemi bazı komplikasyonlar vardır. Teknik intrakranial kanama ve görme korteks ve sık sık ek sonuçlara yol ortak hipertermi bir disfonksiyon ile ipsilateral retina yaralanması eğilimli^5,6,7. Diğer sınırlamalar indüklenen inme yüksek varyasyonları dahil (istenmeyen bölgelere iskemi olası uzantısı kaynaklanan, dış karotis arter bölgesi gibi), MCA yetersiz oklüzyon, ve erken reperfüzyon. Ayrıca, farklı suş ve boyutlarda sıçanlar çeşitli enfarktüs hacimleri⁸sergilerler. Bahsedilen tüm dezavantajlara ek olarak, MCAO modeli derin beyin bölgelerinde küçük izole inmeler neden olamaz, kateterizasyon için minimum damar boyutu gereksinimi açısından teknik olarak sınırlı olduğundan. Bu alternatif bir model için ihtiyaç daha kritik hale getirir. Başka bir yöntem, fototromboz, MCAO prosedürleri için olası bir alternatif sağlar ama verimliliği geliştirmek değildir⁹. Bu teknik ışıkla inme hedefleyen ve önceki modellerde bazı iyileştirmeler sunuyor. Ancak, fototromboz ikincil kombinasyonları ile ilişkili bir invaziv kraniyotomi gerektirir⁹.

Özetlenen eksikliklerin ışığında, burada sunulan protokol kemirgenlerde beyin hasarına neden olmak için yetenekli bir alternatif lazer tekniği sağlar. Lazer tekniğinin etki mekanizması, lazerin canlı dokular üzerinde verilen fototermal etkilerine dayanır ve bu da vücut dokuları tarafından ışık ışınlarının emilimine ve ısıya dönüştürülmesine yol açar. Lazer tekniği kullanmanın avantajları güvenliği ve manipülasyon kolaylığıdır. Bir lazerin kanamayı durdurmak için ısı üretme yeteneği tıpta çok önemli hale getirirken, belirli bir buluşma noktasında farklı ışınları yükseltebilme yeteneği lazerlerin hedef nokta^10'unönünde duran sağlıklı dokuları yok etmekten kaçınmasını sağlar. Bu protokolde kullanılan lazer ışını, kemik gibi düşük sıvı bir ortamdan, enerjisini yaymadan ve/veya herhangi bir tahribata neden olmadan geçebilir. Beyin dokuları gibi yüksek sıvı bir ortama ulaştığında, enerjisini hedef dokuları yok etmek için kullanır. Teknik, bu nedenle, beynin uygun alanda sadece beyin hasarı neden olabilir.

Burada sunulan teknik, ışınlama düzeylerini düzenleme yeteneğinin muazzam bir miktar gösterdi, başından itibaren amaçlanan beyin hasarı seçilen varyasyonları üreten. Hem korteks hem de striatumu etkileyen orijinal MCAO'nun aksine, lazer tekniği beyin hasarının etkisini düzenlemeyi başardı ve sadece amaçlanan motor korteksüzerinde yaralanmaya neden oldu. Burada, lazer kaynaklı beyin hasarı protokolü ve sıçanların serebral korteks üzerinde yapılan işlem için temsili sonuçların bir özeti sağlanır.

Aşağıdaki prosedür Avrupa Topluluğu'nun Deneysel Hayvanların Kullanımı Yönergeleri'ne göre yürütülmüştür. Deneyler, Negev'deki Ben-Gurion Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından da onaylandı.

1. Hayvan seçimi ve hazırlanması

1. Bu işlem için hiçbir overt patoloji ile 300 ila 350 g ağırlığında 65 erkek Sprague-Dawley sıçan seçin. Küçük boyutu MCAO prosedürü için teknik zorluklar teşkil.
2. Kafes başına 3 sıçan atayın ve en az 3 gün uyum sağlar.

2. MCAO prosedürü

1. MCAO için 25 sıçan seçin ve prosedür¹¹ile ilişkili -20 mortaliteye izin verin.
2. McAO'yı standart bir teknik kullanarak gerçekleştirin, daha önce ayrıntılı olarak açıklandığı gibi^12.

3. Lazer kaynaklı beyin hasarı deneysel prosedür

1. Lazer grubu olarak işaretlenmiş bir gruba 20, başka bir kontrol grubuna (sahte işletilen) 20 fare atayın.
2. Lazer grubu sıçanları 50J X 10 noktada lazer ışınlama ile aşağıdaki şekilde takın:
   1. Spontan havalandırma için izin oksijen% 2 izofluran karışımı ile anestezi sıçan. Çekilme refleksinin yokluğunu görmek için kuyruğu forsepslerle sıkıştırarak yeterli anestezi derinliği olup olmadığını kontrol edin.
   2. Rektal sıcaklık teredirısıtma yastığı kullanarak deneysel prosedür boyunca farenin temel vücut sıcaklığını 37 °C'de koruyun.
   3. Bir tıraş makinesi ile yerel saç çıkarın ve% 70 alkol ve% 0.5 klorheksidin glukonat ile dezenfekte. Dezenfeksiyon adımını iki kez daha tekrarlayın.
      NOT: Cerrahi kesi büyüklüğü yaklaşık 3 cm olmalıdır. Kesi bölgesi etrafında en az 2 cm saç çıkarın.
   4. Sıçanı stereotaksik bir baş tutucuya yatkın bir pozisyonda yerleştirin ve kafa derisini yanal olarak yansıtmak ve Bregma ile Lambda arasındaki alanı ortaya çıkarmak için 3 cm'lik bir kesi yapın.
   5. Burun konisi ile anestezi yi koruyun.
   6. 50J X 10 noktalarıyönetmek için Neodimyum-YAG (Nd-YAG) lazer (Nd-YAG) lazer (pik dalga boyu 1064 nm) kullanın, 1 s darbe süresi ile, sağ yarımküreüzerinde kafatasının maruz kalan alana.
   7. Lazer ışını üretmek için cihazın lazer üreten kısmının maruz kalan bölgeden 2 mm uzaklıkta olduğundan emin olun. Farklı enerji/yüzey kombinasyonlarının dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi nden sonra 50J X 10 puan seçilmiştir. Bu kombinasyon verimlidir ve ikinci^{bir 10'dan}daha az bir süre için uygulamadan sonra kafatasıkemik yıkımına neden olmaz.
      NOT: 2 mm lazer ışınının terminali (geçtiği optik kablodan) ile kafatası kemiği arasındaki mesafedir. Bir odaklama lens kullanılması durumunda, mesafe, merceğin istenilen hasar alanına odaklama eğim açısı dikkate alınarak hesaplanmalıdır. Uygun eğitim ve göz koruması da dahil olmak üzere bir lazer cihazı kullanırken uygun güvenliği sağlayın.
   8. Cihazdan sıçan çıkarın ve 3-0 ipek cerrahi dikiş ile kafa derisi kapatın.
   9. Anesteziyi durdurun ve tedavi için fareyi kafesine geri getirin. Ameliyat sonrası ağrıyı hemen azaltmak için lokal olarak 0.1 mL 0.1 mL bupivacaine uygulayın.
      NOT: Doğru yapılırsa işlemin tamamı 5 dakikadan az sürmelidir.
3. Anestezi sonrası iyileşme sırasında herhangi bir sıkıntı belirtisi için sıçanı gözlemleyin. Anesteziortaya çıkmadan önce, postoperatif analjezi için 0.01mg/kg intramüsküler buprenorfin verin ve en az 48 saat boyunca her 12 saatte bir tekrarlanan dozlarla devam edin.
4. Lazere maruz kalmadan kontrol fareleri aynı koşullara tabi türün.

4. Nörolojik şiddet skoru (NSS)

1. Lazer kaynaklı beyin hasarından sonra nörolojik şiddet skoru 24 saat 43 puan¹³kullanarak değerlendirin. Daha önce ayrıntılı^{olarak 13,}nörolojik açıkları, davranış bozuklukları, ışın dengeleme görevi ve refleksleri için hayvanlar test edin.

5. Yaralanma sonrası manipülasyonlar

Kontrol veya deney gruplarında ölüm veya SAH kaydı bulunmamaktadır(Tablo 1). MCAO grubunda hem mortalite hem de SAH oranı idi.

Her iki grubun sıçanlarında göreceli vücut ısısı değişiklikleri de benzerdi, her iki grubun değişkenlik farkı rağmen(Tablo 1).

Hem lazer (16 ± 1.1) hem de MCAO (20 ± 1.5) modellerinde, sham-operated kontrol grubuna göre anlamlı olarak daha kötü NSS vardı (1 ± 0.3; Tablo 1; p<0.01).

Lazere bağlı beyin hasarı da hedef yarımkürede enfarktüs hacminde önemli bir artışa neden olmuş, şam tarafından işletilen kontrol grubuna göre (2.4% ± 0.3 vs 0.5% 0.1; Tablo 2 ve Şekil 1A; p<0.01), Mann-Whitney U testine göre. Ancak lazer modelinin enfarktüs hacmi MCAO tekniğine göre daha küçüktü (%2.4 ± 0.3 vs % 9.9 ± 2.9).

Beyin hasarı sonrası 24 saat saptanan beyin ödemi Şekil 1B ve Tablo 2'degösterilmiştir. Lazerkaynaklı beyin hasarı modeli ile sahte ameliyatlı kontrol grubu arasında beyin ödemi arasında fark yoktu (%3.4 ± 0.6 vs %0.7 ± 1.2). Lazer modeli ile MCAO tekniği arasında beyin ödeminde anlamlı fark vardı (3.4 ± 0.6 vs 7 ± 2.6†). Veriler ortalama ± SEM olarak sunulur.

Şam tarafından işletilen kontrol grubuile karşılaştırıldığında, lazerkaynaklı beyin hasarı ve MCAO tekniği, yaralanmamış hemisferde BBB kırılmasında önemli bir artışa neden oldu (sırasıyla 563 ng/g ± 66 ve 1176 ng/g ± 168, vs 141 ng/g ± 14; Şekil 2A ve Tablo 2; p<0.01) ve hedef hemisfer (2204 ng/g ± 280 ve 2764 ng/g ± 256, vs 134 ng/g ± 11; Şekil 2B ve Tablo 2; p<0.01).

Sıçan beyinlerinin histolojik incelemesi Şekil 3'tegösterilmiştir.

Tablo 1: NSS, vücut ısısı, subaraknoid kanama ve mortalite nin değerlendirilmesi. * = p < 0.01

Tablo 2: BBB disması, enfarktüs zonu ve beyin ödeminin değerlendirilmesi. * = p < 0,01

Şekil 1: McAO modeli ve sham-operated kontrolü ile karşılaştırıldığında yaralanma dan sonra 24 saat lazer modelinde beyin hasarının değerlendirilmesi. (A) Enfarkt hacminin değerlendirilmesi. Lazer modelinde enfarktüs hacminde, sahte işletilen kontrole (*p<0.01) göre artış oldu. Ancak lazer modelindeki enfarktüs hacmi MCAO modeline göre daha küçüktü (*p<0.01). (B) Total beyin ödeminin değerlendirilmesi. MCAO modelinde beyin ödeminde lazer modeli ne de sahte kontrol ile karşılaştırıldığında bir artış vardı. Beyin ödeminde lazer modeli ile sahte ameliyatlı kontrol arasında fark yoktu. Veriler kontralateral yarımküreye % olarak ölçülür ve ortalama ± SEM olarak ifade edilir.

Şekil 2: BBB arıza sının kapsamı sahte kontrollere göre dir. (A) Kontralateral (yaralanmamış) yarımküre. Hem lazer hem de MCAO modelleri, şam-işletilen kontrol grubuna (*p<0.01) göre yaralanmamış hemisferde BBB kırılmasında önemli bir artışa yol açmıştır. (B) Ipsilateral (yaralı) hemisfer. Lazer ve MCAO modellerinde ipsilateral BBB arızası, sham ile çalışan kontrole göre farklılık (*p<0.01) idi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Sıçanların beyinlerinin sahte, lazer ve MCAO gruplarından histolojik incelemesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.