AFM tabanlı Kuvvet Spektroskopisi için Tek Moleküllerin Kovalent Eki

1980'lerde icadından bu yana^,1,atomik kuvvet mikroskobu (AFM) sub-nanometre mekansal çözünürlük, alt pikonewton kuvvet çözünürlüğü ve çeşitli çözücü ve sıcaklık^{koşullarında}ölçme imkanı 2 ,^3,4,5,,^6,7içeren doğa biliminin en önemli görüntüleme tekniklerinden biri haline gelmiştir .

Görüntüleme dışında^8,9, AFM tek molekül kuvvet spektroskopisi gerçekleştirmek için kullanılır (SMFS) tek bir polimer ve yüzeyler arasındaki yapışkan etkileşimleri içine fikir veren, tek polimerlerin fiziksel özellikleri ve proteinlerin gelişen mekanizmaları^{7,10,11,12,13,14,15,16}. Normal bir SMFS deneyinde, işlevselleştirilmiş kantilever ucu bir yüzeyle temas eder, böylece AFM'deki polimer bu yüzeye fizorbs uç. AFM kantilite ucunu yüzeyden geri çekerek, AFM kantilinin sapmasındaki bir değişiklik kuvvet uzatma eğrisine giden bir kuvvete dönüştürülür^4. Germe kuvveti, desorpsiyon kuvveti ve desorpsiyon uzunluğu gibi fiziksel parametreler çekme hızı, yüzeyde çalışma süresi, yüzeye girinti derinliği, sıcaklık, çözücü^17,,18 ve katı yüzeyler, polimer filmler veya desteklenen lipid bilayers^19,20,21,22gibi farklı parametrelere bağlı olarak belirlenebilir. Ayrıca, bir polimer farklı mekansal yönlerde incelenmiş olabilir, böylece polimer sürtünme özellikleri araştırarak^23,24,25,26.

Bu tür çalışmalar için araştırılan polimerin AFM kantilever ucuna kovalent bağlanması esastır. Böylece, bir AFM cantilever ucuna bağlı bir ve aynı polimer ile tek molekül olayların yüksek verim afm cantilever^27,,28,değişen ek noktaları²⁹ veya değişen polimerler (farklı kontur uzunlukları ile) nanobalıkçılık durumunda olduğu gibi kalibrasyon nedeniyle sonuçların herhangi bir önyargı önler^30,31,32. Ayrıca, diğer polimerler ile etkileşimleri yanı sıra ortalama etkileri yaygın olarak önlenebilir^18,28. AFM kantilever ucuna bir polimer kovalent eki için, kimyasal değişiklikler farklı uygulanabilir, birçoğu Hermanson tarafından kitapta özetlenebilir³³. Amin ve tiyol bazlı bağlama reaksiyonları yanı sıra tıklama kimyaa afm cantilever uç fonksiyonelizasyonunda en sık kullanılan yöntemleri temsil^{34,35,36,37,38,39,40,41,42}. Becke ve ark.⁴⁰ nasıl 1-etil-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid (EDC)/NHS kimya sı bir AFM kantilever ucuna bir protein eklemek için nasıl kullanılacağını göstermektedir. Ancak, dedi fonksiyonel gruplar çapraz bağlantı eğilimindedir, böylece işlevsellik kaybına yol açan^43,44. Ayrıca, karbodiimides^{çözeltisi 43}hızlı hidroliz eğilimi göstermektedir. Maleimid ve tiyol grupları genellikle daha kararlıdır ve çapraz bağlama reaksiyonları göstermezler. Sunulan protokol,^35,39.

Burada, kontur uzunluğu veya hidrofobiklik gibi özelliklere bakılmaksızın çok sayıda farklı polimere kolayca ayarlanabilen güvenilir bir işlevselleştirme protokolü sunulmaktadır. Hidrofilik polietilen glikol (PEG) ve poli(N-izopropilerilrilamid) (PNiPAM) ve yüksek molar kütleli hidrofobik polistiren (PS) olmak üzere üç farklı polimer seçilmiştir. Uygun bir bağlayıcı molekülü ile kovalent bağlama yeteneği sağlamak için, üç polimerfonksiyonel son grup olarak teleşitik tiyol moiety sahip için seçildi. Bağlayıcı molekülün kendisi tipik olarak iki aktif siteli kısa bir PEG polimeri, bir ucunda bir silane grubu ve diğer ucunda bir maleimid grubudur. Eski AFM cantilever ucuna kovalent bir eki sağlar ve ikinci işlevselleştirilmiş yüksek molar kitle polimer tiyol grubu ile bağlayıcı bir reaksiyon. Ayrıca, inaktif PEG bağlayıcı molekülleri prob polimeri ve AFM cantilever ucu ile AFM kantilever ucu ile altta yatan yüzey arasında istenmeyen etkileşimleri önlemek için bir pasifasyon tabakası görevi görebilirsiniz.

NOT: Şematik bir bakış için Şekil 1'e bakın.

1. Reaktif kurulumu

NOT: Bu protokol için kullanılan polimerler şunlardır: maleimide-polietilen glikol-triethoxysilane (silane-PEG-mal, 5 kDa), tiyol-polietilen glikol-tiol (HS-PEG-SH, 35 kDa), thiol terminated poli(N-izopropylarilamid) (PNiPAM-SH, 637 kDa) ve tiyol sonlandırılmış polistiren (PS-SH, 1.3 mDa).

1. Iyi tanımlanmış ve yüksek molar kitle PNiPAM-SH atom transferi radikal polimerizasyon yoluyla hazırlayın, dönüşüm ve bir tiol moiety giriş için fonksiyonel son grubun azaltılması takip, literatürde açıklandığı gibi¹⁸. Ayrıntılı yapılar için şekil 1'e bakın.
2. Kimyasalların saklanması için, atmosferik oksijen ve neme maruz kalmamak için azot atmosferli kuru bir torpido kutusu sistemi içinde daha küçük aliquotlar hazırlayın. PEG ve PNiPAM higroskopik^45,,46 ve PEG fonksiyonel son grupları, PNiPAM ve PS ortam koşullarında depolandığında kolayca okside olduğu bilinmektedir^33,47,48. Tüm kimyasallar -20 °C'de depolanmalıdır.
3. Analitik sınıf çözücüler veya daha yüksek kullanın. Ayrıca, afm kantilevers yongaları ve cam gereçleri durulamak için ultra saf su kullanın, çünkü tek molekül deneyleri tüm kontaminasyona karşı çok hassastır.

2. Ekipman Kurulumu

NOT: Paslanmaz çelik veya camdan yapılmış cımbız ve gagalar kullanın. Güvenli bir tutuş için ters cımbız kullanın (örn. düşük yay sabitine sahip model R3 SA).

1. Temiz cam ve cımbız için RCA (ultrasaf su, hidrojen peroksit ve amonyon (5:1:1)) çözeltisi hazırlayın.
2. Bir kabına damarları koyun ve cam veya cımbız tamamen kaplı olana kadar RCA ile doldurun.
3. Kabı adım 2.2'den 80 °C'de 1 saat e ısıtın.
4. Damarları daha sonra ultra saf suyla durulayın, ta ki keskin bir koku artık kesinlenene kadar (en az üç kez).
5. Fırında kuru cam eşyalar ve cımbız (120 °C).

3. İpucu işlevselleştirme

NOT: Organik buharların solunmasını önlemek için tüm adımlar duman kaputunda yapılmalıdır. Ayrıca eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruması gerekmektedir. Kontaminasyonu önlemek için her adımda nitril veya lateks eldiven kullanın. Tolüen kullanırken solvente dayanıklı eldivenler takın. Aksi belirtilmedikçe tüm adımlar RT'de yapılır.

1. AFM cantilever çipMLCT-Bio-DC oksijen plazma uygulayarak yüzey aktivasyonu gerçekleştirin.
   NOT: Daha fazla işlevselleştirme adımları için plazma tedavisinin etkinliği plazma odasındaki oksijen içeriği ile ölçeklenir.
   1. AFM kantilever yongalarını plazma haznesine (40 kHz, 600 W) yerleştirmek için taze temizlenmiş cımbız kullanın.
   2. Özel modifiye aktivasyon programı kullanın: tahliye (0.1 mbar) – bir basınç oksijen ile sel: 0.2 mbar (4 dk) - plazma süreci (güç: 40%, süre: 2 dk, proses basıncı: 0.2 mbar).
   3. Havadan AFM cantilever yongaları kirletici maddelerin herhangi bir adsorpsiyon önlemek için hemen adım 3.2.2 ile havalandırma ve devam edin.
2. Silanizasyon ve PEGiletion
   NOT: Zamanlama adımları arasında kritik bir parametredir. Bekleme süresince mümkün olduğunca taze çözümler hazırlayın. Maleimid grupları sulu ortamda hidrolize maruz kalır ve tiyoller^{çözeltisi 33,,47} afm uç fonksiyonelleştirme reaksiyonlarını engelleyen disülfürlere kolayca oksitlenirler.
   1. Çözücüye dayanıklı plastik veya cam tüplerde tolüen (1,25 mg/mL) bir silane-PEG-mal çözeltisi hazırlayın ve çözeltinin 6 mL'ini düz Petri kaplarında, her biri 3 mL dökün.
      NOT: SMFS deneyinde birden fazla probu polimerin infatif edilmesi gözlenirse, silane-PEG-mal ile fonksiyonel olmayan silane-PEG'in karıştırılması bağlantı noktalarının sayısını azaltabilir. Farklı kütleler (yani, kontur uzunlukları) ile passivation tabakası PEG ayarlama için^{kullanılabilir 27}.
   2. AFM cantilever yongalarını silane-PEG-mal çözeltisi (Petri kabı başına 10 fiş) 3 saat boyunca 60 °C^35'te3.1.3 adımdan hemen sonra inkübe edin.
   3. Petri tabaklarını fırından alın ve çözeltinin en az 10 dakika soğumasını bekleyin.
   4. Her AFM cantilever yongası dikkatle durula. Örneğin, çözeltiye daldırırken bu yongaları hafifçe yatırarak, hava-çözücü arayüzünü geçerken kılcal kuvvetlerin AFM kantili üzerindeki etkisini azaltın.
      1. PEG ve PS polimerleri için toluen ile üç kez durulayın.
      2. PNiPAM polimeri için bir kez tolüen ve iki kez etanol ile durula.
   5. Kontrol AFM cantilever yongaları olarak en az iki AFM cantilever yongaları seçin, adım atlayarak 3.3 ve çözücü polaritesini artırmak için aşağıdaki gibi durulayın:
      1. PEG ve PS polimerleri için, etanol ile iki kez ve ultra saf su ile bir kez durulayın.
      2. PNiPAM polimeri için ultra saf suyla iki kez durulayın.
         NOT: Kontrol AFM cantilever yongaları polimer eki (adım 3.3) hariç tüm işlevselleştirme adımlarından geçmiştir. İşlevselleştirme işleminin temizliğini, AFM cantilever talaş tutucu sistemini, Yüzeyleri ve SMFS deneyi için kullanılan çözücüleri kanıtlamaya hizmet ederler.
3. Kovalent polimer eki
   NOT: AFM kantilever ucu tamamen maleimid grupları ile kaplı olması bekleniyor olsa da, tek prob polimer için sadece birkaç bağlayıcı siteleri vardır, maleimid inaktif PEGs giden suda hidroliz uğrar çünkü⁴⁷. Bu inaktif PEGs bir pasif tabaka olarak hareket, yukarıda açıklandığı gibi.
   1. 3 mL Petri kaplarında aşağıdaki polimer çözeltilerinden birinde 3.2.5 adımdan sonra doğrudan inkütürün AFM cantilever yongaları. İlgili polimer düzgün bir şekilde çözülmezse, 40 °C'lik bir su banyosu kullanın ve çözeltiyi iyice karıştırın.
      NOT: Tiyol sonlandırılmış polimerlerin kullanımı silane-PEG-mal maleimid grupları ile reaksiyonu engelleyen disülfür bağlarının oluşumuna yol açabileceğinden, özellikle suda çözünen polimerler için sulu tamponlarda 3.3 adım uygulanıyorsa bir azaltıcı ajan önerilir³³.
      1. PEG ve PS polimerleri için 60 °C'de 1 saat tolüen de 1,25 mg/mL konsantrasyon kullanın.
      2. PNiPAM polimerleri için RT'de 3 saat boyunca etanolde 1.25 mg/mL konsantrasyon kullanın.
         NOT: SMFS deneyinde birden fazla probu polimerinin bağlanması gözlenirse, polimerkonsantrasyonu azaltılmalıdır.
   2. Her AFM cantilever yongası dikkatle durula.
      1. PEG ve PS polimerleri için toluen ile iki kez, etanol ile iki kez ve 10 dakika soğuduktan sonra bir kez ultra saf su ile durulayın.
      2. PNiPAM polimerler için, etanol ile iki kez, ultra saf su ile iki kez durulayın.
   3. Her AFM cantilever yongası, bir deneyde kullanıma kadar ultra saf su yla dolu küçük (1 mL) petri kabında 4 °C'de ayrı ayrı saklayın.

4. Yüzey hazırlama

1. Silikon oksit gofret
   NOT: Bu yüzey PEG ve PNiPAM ile SMFS için kullanılmıştır.
   1. Bir elmas bıçak kullanarak küçük parçalar halinde bir silikon oksit gofret kesin.
   2. Silikon oksit parçalarını ayrı ayrı mikrosantrifüj tüplere koyun ve bu tüpleri etanol ile doldurun.
   3. 10 dakika boyunca silikon oksit parçaları sonicate.
   4. Silikon oksit parçalarını iki kez etanol ile durulayın ve bir azot akışı altında dikkatlice kurulayın. Hemen silikon oksit parçaları kullanın.
2. Altın üzerinde hidrofobik alkan tiyol kendi kendine monte monolayer (SAM)
   NOT: Bu yüzey PS'li SMFS için kullanılmıştır. ^SAM'larhakkında daha fazla bilgi için literatür³⁹,^49'a bakın.
   1. 4.1.1 – 4.1.4 adımlarını gerçekleştirmek için altın kaplı silikon gofret (A [100], 5 nm titanyum, 100 nm altın) kullanın.
   2. Yüzey parçalarını 18 saat boyunca 1-dodecanthiol çözeltisi (2 mM) ile inküler.
   3. Taze hazırlanmış SAM'ları etanolle iki kez durula.
   4. Doğrudan kullanım için azot akışı na sahip kuru SAM'lar veya daha sonra kullanım için 4 güne kadar etanolde saklayın.

5. Veri toplama

NOT: Burada gösterilen tüm ölçümler, sıcaklık değişimi için ısıtma ve soğutma numunesi aşaması kullanılarak Cypher ES AFM ile ultra saf suda gerçekleştirilmiştir. Genellikle, sıvılarda ölçme özelliği sağlayan tüm AfM'ler kullanılabilir.

1. İşlevselleştirilmiş AFM cantilever çipini AFM'ye takın.
2. Hazırlanan yüzeyi sıvılarda ölçüm için uygun bir numune tutucuya yapıştırın (örn. Yüksek Çözünürlüklü Çoğaltıcı Bileşik 101RF veya UV kürlenebilir yapıştırıcı).
   NOT: Bu yapıştırMa ajanları son derece durağan ve çok sayıda polar çözücüye karşı dayanıklıdır. Yapıştırıcının polar olmayan çözücülere (örn. toluen veya hekzane) veya yüksek sıcaklıklara karşı direnci kullanılmadan önce kontrol edilmelidir.
3. AFM kantilever çipini ve sonda örneğini sıvıya batırın: ultra saf su.
   NOT: AFM kantilever talaş tutucusuna bir çözücü damlası (yaklaşık 100°L) yatırılabilir. AFM cantilever yongasının çözücü ile kaplanması kılcal kuvvetleri azaltır, aksi takdirde hava-çözücü arabiriminden geçen numune yüzeyine yaklaşırken AFM kantilüzerinde hareket eder.
4. Gerekirse, sıcaklığı ayarlayın ve sistemin dengelemesi için izin verin.
   NOT: Sıcaklık değişiklikleri alüminyum veya altın gibi yansıtıcı kaplamaile AFM cantilevers için bimetalik etkisi nedeniyle AFM cantilever bir sapma neden olabilir. Sapma sinyalinde daha fazla değişiklik gözlenmeyene kadar (MLCT-Bio-DC için 15 dakikaya kadar) yüzeyden (birkaç μm) uzak bir şekilde dengelenmelidir.
5. İşlevselleştirme yaşlanma herhangi bir etkisini dışlamak için rasgele sıcaklık değişir. Uygulanan sıcaklıkların AFM kantilinin geri dönüşü olmayan bükülmesine yol açmadığından emin olun.
   NOT: Çözücü özellikleri (buharlaşma veya viskozite değişiklikleri gibi) üzerindeki herhangi bir sıcaklık etkisi deneylerinizi engelleyebilir. Sunulan örneklerde sıcaklık, 10 K'lık basamaklarda 40 K'ye kadar bir aralıkta, çözücü olarak su alarak (örneğin, 278 K'den 318 K'ye) değişmekteydi.
6. Sert bir yüzeye (silikon oksit gibi) kuvvet uzatma eğrileri alarak InvOLS'i (ters optik kol hassasiyeti) belirlemek için yüzeye yaklaşın. Bunun için fotodedektörün (V' deki) piezo mesafesinin sapma sinyalini alın ve doğrusal bir fonksiyon kullanarak AFM kantilever ucunun alt takim yüzeyine (itici rejim) girintilatını temsil eden parçanın eğimini belirleyin. Hataları azaltmak için, son InvOLS değerini elde etmek için en az beş değerin ortalamasını alın. Daha fazla bilgi için, literatür^4,,³⁹bakın .
   NOT: InvOLS sadece sert yüzeylerde güvenilir bir şekilde belirlenebilir. Yumuşak yüzeyler veya arayüzler üzerinde yapılan deneylerde yumuşak yüzeylerinize yakın sert bir yüzey yerleştirdiğinizden emin olun. Daha sonra, InvOLS kalibrasyonu, AFM kurulumunu sökmeye gerek kalmadan yumuşak yüzey deneylerinizden önce veya sonra yapılabilir.
7. Yay sabit tayini için, AFM kantilever ucu ve yüzeyi (birkaç μm) arasında ne çekici ne de itici etkileşimler ile AFM cantilever yüksekliğe taşıyın. Daha sonra, güç spektral yoğunluğu (PSD) vs frekans çizilir bir termal gürültü spektrumu kaydedin. Aşağıdaki adımlar genellikle ticari AFM yazılımında otomatik dahili işlevler tarafından gerçekleştirilir: birincisi, elde edilen termal gürültü spektrumu PSD'ye bir fonksiyon takılarak analiz edilir, örneğin basit bir harmonik osilatör (SHO). Uyum, birinci ve ikinci rezonans arasında minimuma kadar yapılır. İkinci olarak, PSD vs frekans çiziminin donatılmış kısmının altındaki alan, AFM kantilinin dikey yönde ortalama kare deplasmanını temsil eden olarak belirlenir. Son olarak, denklik teoremi AFM cantilever kuvvet^{sabiti 28,50}elde etmek için kullanılır.
   NOT: AFM kantilinin ilk rezonans tepe noktasını içeren uygun bir frekans aralığı kullanılmalıdır. Tatmin edici bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için, mümkün olan en yüksek frekans çözünürlüğü ile en az 10 PSD birikmelidir.
8. Deneyi başlatın. Herhangi bir yerel yüzey etkisinden (örn. yabancı maddelerin, çıkıklar) ve ortalama farklı yüzey alanlarına karşı güç uzantısı eğrileri (örneğin, 20 x 20 μm^2'lik bir alan için 10 x 10 puan) alarak kuvvet haritalarını kaydedin.
   NOT: Tipik parametreler, yeterli çözünürlüğü sağlamak için 1 μm/s çekme hızı ve 5 kHz örnekleme hızıdır. Çekme hızı farklı olduğunda örnekleme hızı uyarlanmalıdır. Geri çekme mesafesi, ölçülen polimerin kontur veya desorpsiyon uzunluğuna (beklenen uzunluğun yaklaşık iki katı) uyarlanmalıdır.
9. Tek polimerin yüzeye yapışmasını sağlamak için çalışma süresini kullanın ve yüzeye doğru değiştirin (genellikle 0 - 5 s).
10. Sistemin tutarlılığını ve stabilitesini kontrol etmek için deneyin sonunda InvOLS ve yay sabitinin belirlenmesini tekrarlayın.
    NOT: Polimer ve yüzey arasında güçlü yapışma için, kalibrasyon işlevselleştirme korumak için gerçek deneyden sonra yapılabilir.

6. Veri değerlendirmesi

NOT: Veri değerlendirmesi için, aşağıdaki adımları gerçekleştirmek için Igor Pro'ya dayalı özel olarak yazılmış bir yazılım kullanılmıştır.

1. Ham sapma sinyalini (Volt cinsinden) kaydedilen InvOLS ve belirlenen yay sabiti ile çarpımıyla kuvvet değerlerine (Newtoncinsinden) dönüştürün.
2. Gerçek uzantısı (uç-yüzey^mesafesi)elde etmek için piezo elemanları tarafından dikey yönde sürülen mesafeden AFM kantilinin sapmasını (InvOLS ile ham sapma sinyalinin çarpımından sonra) çıkar.
3. Son olaydan sonra doğrusal bir işlevi taban çizgisine takarak ve kuvvet uzatma eğrisinden aynı sıyrık çıkararak sürüklenme için elde edilen kuvvet uzatma eğrilerini düzeltin. Monte edilen parça, AFM kantilever ucu ile altta yatan yüzey arasında ne çekici ne de itici etkileşimlerin gözlenmediği yüzeyden yeterli bir uzantıyı temsil etmelidir. Daha sonra, taban çizgisi sıfır eksenine ayarlanır.
   NOT: Altın gibi yüksek yansıtıcı yüzeylerde ölçümler olması durumunda parazitler ortaya çıkabilir. Bunlar lazer ışınının yüzeyden ve AFM kantilinin arkasından kısmi yansımasısonucuortaya çıkar. Yani, elde edilen kuvvet uzatma eğrileri dikey uzantısı boyunca bir sinüzoidal kuvvet sinyali artifakı gösterebilir. Bu son kuvvet değerlerini engelleyen bir obje. Bu kuvvet uzatma eğrilerini hala hesaba katabilmek için bir düzeltme mümkündür (Şekil 2).
4. Parazitler kuvvet uzatma eğrilerinde görünürse, spesifik olmayan yapışma ve aynı sinüsoidal artifak (yani genlik ve faz)(Şekil 2A)dışında başka olaylar gösteren temsili bir kuvvet uzatma eğrisi (geri çekme eğrisi) seçin.
   NOT: Parazitin düşük frekans deseni elde etmek için temsili kuvvet uzatma eğrisini düzleştirin.
5. Düzeltilmesi gereken bir kuvvet uzatma eğrisi seçin (Şekil 2B).
6. 6.4 adımlarından her iki kuvvet uzatma eğrisini de yerle bir edin. ve 6.5. her ikisinin de aynı sinüzoidal artifa (yani genlik ve faz) gösterdiğinden emin olmak için (Şekil 2C).
7. (Düzgünleştirilmiş) kuvvet uzatma eğrisini kuvvet uzatma eğrisinden çıkararak sinüzoidal taban çizgisi yerine düz bir anaçizgiye doğru düzeltilmelidir (Şekil 2D).
   NOT: Temsili eğrinin spesifik olmayan yapışma tepe noktasının eğrilerde görünen tek moleküllü olaylardan farklı olduğuna dikkat edin. Aslında, temsili eğriseçimi uygun bir düzeltme için çok önemlidir.

Aşağıdaki örnekler, PEG, PNiPAM ve PS polimerlerinin tek molekül germe ve desorpsiyon sonuçlarını göstermektedir. Tüm AFM cantilever ipuçları yukarıda verilen protokol ile işlevselleştirilmiştir. PEG ve PNiPAM sıcaklık değişimi ile SiOx üzerinde ölçüldü. PEG ve PNiPAM için ortaya çıkan ısıya bağlı germe eğrilerinin4,27ayrıntılı bir tartışması için,51,39bkz.

Örnek 1: PEG ve PNiPAM'ın suda gerilmesi
Sudaki ısıya bağlı germe davranışı, bir ucunda ki AFM kantilucuya kovalent olarak bağlanan tek PNiPAM ve PEG polimerleri kullanılarak ölçüldü ve diğer ucunda ki SiOx yüzeyinde fizyonhaline verildi. Kalibrasyon ve temiz kontrol deneylerinden sonra (kuvvet uzatma eğrilerinin %2'sinden azı tek molekül lüzumlu olayları gösterir), her AFM kantili için en az iki kuvvet eşlemi kaydedildi. Isıya bağlı deney, her sıcaklıkta en az bir kuvvet haritası kaydedilerek gerçekleştirildi. Sadece birkaç germe olayı ortaya çıktığında, ilgili AFM kantili atılır ve çipin bir sonraki AFM kantili alınmıştır (genellikle MLCT-Bio-DC'nin C, B, D ve E sırasına göre). PEG'in örnek verileri için, ölçülen 500 kuvvet uzatma eğrisinin 95'inde () tek bir germe olayı gözlendi. PNiPAM için, 600 kuvvet uzatma eğrisinin 252'si germe deseni (B) gösterdi. Kuvvet uzatma eğrilerinin daha iyi karşılaştırılması için her sıcaklık için tek bir ana eğri oluşturuldu. Bu amaçla, konformasyonel dalgalanmalar ve çözücü etkileri ihmal edilebilir olan en az 500 pN'ye kadar germe olayı olan eğriler52olarak seçilmiştir. Dikkate alınan son esneme sayısı 278 K'da 3, PEG için 318 K'da 7 ve PEG için 318 K'da 4, 278 K'da 3, PNiPAM18için 318 K'da 3.

Ana eğrileri oluşturma yordamı Şekil 3'teverilmiştir. Seçilen kuvvet uzatma eğrileri(Şekil 3A) L0 (500 pN kuvvetinde uzatma) uzunluğuna yeniden ölçeklendirilir, bkz.B Yapışma tepe yüzey ve AFM cantilever ucu arasında spesifik olmayan yapışma büyük bir varyasyon gösterir, ancak polimer germe davranışı etkilemez. Yeniden ölçeklendirildikleri kuvvet uzatma eğrileri birleştirdikten sonra Şekil 3C'desunulduğu gibi bir binominal yumuşatma ile ortalama olarak belirlenir. Bunun için, Bir Gauss filtresi verileri Pascal üçgeninden türetilen normalleştirilmiş katsayılarla, 2053parametresine eşit bir düzeyde kıvrıklar. Son olarak, Şekil 3D'deverilen her sıcaklık için bir ana eğri elde edilir. Yakınlaştırma, kuvvet uzatma davranışı üzerindeki sıcaklık etkisinin en belirgin olduğu aralığı gösterir.

PEG (A) ve PNiPAM(B)sıcaklık davranışlarının karşılaştırılması Şekil 4'tebulunabilir. PEG için artan sıcaklıkile germe kuvvetinde azalma gözlenmiştir. Sıcaklığı 278'den 318 K'ye çıkarken 100 pN'de yeniden ölçeklenen uzatmanın yaklaşık %5'inde bir artış gözlendi. PNiPAM için, zıt bir ısıya bağlı kayma ortaya çıkabilir. Sıcaklık 278'den 328 K'ye yükseltildiğinde 100 pN'de yeniden ölçeklenen uzatmanın yaklaşık %1'inde azalma gözlenmiştir. Bu moleküler dinamikleri (MD) simülasyonları18yardımı ile germe serbest enerji enerjik ve entropik katkıları ayıklamak için kullanılabilir.

Örnek 2: PS'nin suda sam yüzeyinden desorpsiyonu
PS'nin sudaki bir SAM yüzeyinden bozulması, desorpsiyon kuvvetini ve uzunluğunu belirlemek ve hidrofobik etkileşimi ölçmek için kullanılabilir. Kalibrasyondan sonra, yüzeyin iki farklı noktasında en az iki kuvvet haritası kaydedildi. Polimer eki başarılı olduğunda, kuvvet uzatma eğrileri karakteristik özelliği olarak sabit kuvvet platoları gösterdi, Şekil 5A ve Şekil 5Cbakın. Yayla benzeri desorpsiyon, problanan bağların dinamiği AFM kantilever ucunun (yarı-denge) çekme hızından çok daha hızlı olduğunda gözlenir. Plato benzeri kuvvet uzatma eğrilerinin desorpsiyon kuvvetleri, kuvvet uzatma izi54'üentegre ederek doğrudan yapışmaserbest enerji sağlar. Onlar sıvı ortamda yüzeylerde tek polimerlerin elektrostatik, dağılım ve hidrofobik etkileşimleri yanı sıra sürtünme özelliklerini belirlemek için kullanılmıştır2,4,23,51,54,55.

Sabit kuvvether plato daha sonra histogramlar çizilen desorpsiyon kuvveti ve desorpsiyon uzunluğu belirlemek için bir sigmoidal eğri ile donatılmıştır. Histogramlar maksimum değer ve standart sapma ayıklamak için bir Gaussian ile donatılmıştır. Daha iyi bir genel bakış için, desorpsiyon kuvveti ve uzunluk değerleri Şekil 5B ve Şekil 5D'deverildiği gibi bir dağılım çiziminde birlikte gösterilmiştir.

Suda SAM polistiren için, belirlenen desorpsiyon kuvvetleri daha önce elde edilen değerlere karşılık gelir19,23. Desorpsiyon uzunluğu polimer kontur uzunluğu51ile ilişkili olduğu için, desorpsiyon uzunluğu dağılımı fonksiyonel uç grubu aracılığıyla AFM cantilever ucuna ilgili polimerkovalent bağlama bir kanıtı olarak kullanılabilir. Böylece, desorption uzunluğu bir parmak izi olarak hizmet vermektedir.

AFM kantilever ucuna bağlı birden fazla polimer için, kuvvet uzatma eğrileri56platolar (ayrık adımlar) basamaklı görülebilir. Her plato farklı bir uzantıda bir polimerin desorpsiyontemsil eder. Şekil 5 Figure 5C ve Şekil 5D'de verilen deney, AFM kantilever ucuna aynı anda bağlı iki polimerin tipik bir durumunu göstermiştir. Son kopma takılarak, desorpsiyon uzunluğu için bimodal dağılımı bulunabilirken, desorpsiyon kuvveti dar bir dağılım gösterdi. Bu durumda, daha küçük desorpsiyon uzunluğu şekil 5C'de

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.