Yöntem makalesi

Elastin benzeri Proteinlerin tanımlanmış Supramoleküler Yapılara Yönlendirilmiş Montajı ve Tüp Bebek Tespülasyonu

DOI:

10.3791/60935

⸱

8 Nisan 2020

 ,  ,  ,  , 
1Center for Biological Systems Analysis, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg, 3Freiburg Institute for Advanced Studies (FRIAS), University of Freiburg, 4BIOSS Centre for Biological Signalling Studies, University of Freiburg, 5IMTEK Department of Microsystems Engineering, University of Freiburg, 6Cluster of Excellence livMatS at FIT - Freiburg Center for Interactive Materials and Bioinspired Technologies, University of Freiburg

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organik ve sulu çözücülerin arayüzünde, özel ampifilik elastin benzeri proteinler veziküller, lifler ve çevresel parametrelertarafından tetiklenen koaksivatlar gibi karmaşık supramoleküler yapılarda bir araya getirilir. Açıklanan montaj protokolleri, çeşitli kargoların kapsüllemesini sağlayan, tunable özelliklere sahip Protein Membran Tabanlı Bölmeler (PMBCs) verir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Özel proteinaceous yapı taşları minimal hücreler, ilaç dağıtım araçları ve enzim iskeleleri gibi supramoleküler yapıların montajı için çok yönlü adaylardır. Genetik düzeyde ki biyouyumluluk ve ayarı nedeniyle, Elastin benzeri proteinler (ELP) biyoteknolojik ve biyomedikal uygulamalar için ideal yapı taşlarıdır. Bununla birlikte, farklı fizyokimyasal özellikleri ve iyi kapsülleme potansiyeli ile protein bazlı supramoleküler yapıların montajı zor olmaya devam etmektedir.

Burada küresel koaservatlar, lifler ve kararlı veziküller gibi supramoleküler protein mimarileri içine ampifilik ELP'lerin güdümlü kendi kendine montajı için iki etkili protokol salıyoruz. Sunulan montaj protokolleri, uyarlanabilir fizyokimyasal özelliklere sahip ELP'lere dayalı Protein Membran Tabanlı Bölmeler (PMBCs) oluşturur. PMBC'ler faz ayırma davranışını gösterir ler ve yönteme bağımlı membran füzyonlarını ortaya çıkarırlar ve kimyasal olarak çeşitli floresan kargo moleküllerini kapsülleyebilmektedirler. Ortaya çıkan PMBCs bir ilaç formülasyonu ve dağıtım platformu, yapay hücre ve bölümlü reaksiyon alanı olarak yüksek bir uygulama potansiyeline sahip.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyoteknolojik uygulamalar için supramoleküler yapıların montajı giderek daha önemli hale geliyor1,2,3,4,5. Koaservates, veziküller ve lifler gibi fonksiyonel mimarilerin istenilen fizikokimyasal özelliklere sahip bir araya toplanması için bileşenlerin fizikokimyasal ve konformasyonel özelliklerini anlamak ve kontrol etmek önemlidir. Doğada bulunan moleküllerin moleküler hassasiyeti nedeniyle, supramoleküler yapıların yapı taşları giderek lipidlere, nükleik asitlere veya proteinlere dayanmaktadır. Sentetik ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Amfilik elastin benzeri proteinlerin (ELP) tasarımı ve klonlanması

  1. Klon ve başka bir yerdeaçıklandığıgibi yapıları tasarım 8,20. Plazmidler istek üzerine mevcuttur.

2. Protein ekspresyonu, arınma ve hazırlama

  1. F20E20-mEGFP ve F20E20-mCherry ekspresyonu
    1. Ana ifade kültürünü bir gecede ön kültürden 0,3'ün OD600'üne bağla. 37 °C'de kuluçka, steril 400 mL LB ortamda 2 L'lik bir şişede uygun antibiyotiklerle desteklenerek 200 rpm.
    2. IpTG stok çözeltisini (1 M) ultra saf suda ifade kültürünün indüksiyonu için hazırlayın.
    3. OD....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vezikül üretimi için protokol geliştirme
Şekil 1 iki farklı vezikül hazırlama yöntemleri özetliyor. Sol taraftaki THF şişme yöntemi art arda üç adımdan oluşur ve sıcaklığa bağlı olarak ELP'nin farklı supramoleküler montajları ile sonuçlanır. Şekil 1A epifloresan mikroskopi görüntülerinde BDP-R20F20'den birleştirilmiş veziküller ve BDP-R40F20'den monte edilen fibrillary yapılar gösterilmektedir. Sağ tarafta gösteri.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tanımlanan supramoleküler yapıların montajı için açıklanan protokolleri takip eden bir hata, esas olarak spesifik olmayan agregaların(Şekil 2, IV) oluşumuna ya da homojen olarak dağıtılan ELP-amphipilelerin oluşumuna yol açar. Protokolün kritik adımları aşağıda ele alınmıştır:

Amfilik ELP'nin yüksek ekspresyon verimi için 20°C'lik nispeten düşük bir sıcaklık en uygun uyruktur. Amfilik ELP'nin başarılı afinite dayalı saflaşması için lysis tamponundaki 4 M'lik üre k.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar mali destek için BMBF ve Biyolojik Sistemler Analizi Merkezi (ZBSA) araştırma tesisi sağlamak için teşekkür ederiz. Biz Plazmid pEVOL-pAzF sağlamak için P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, California, ABD müteşekkiriz. Albert-Ludwigs-University Freiburg Biyolojik Sistem Analizi Merkezi'ndeki (ZBSA) Yaşam Görüntüleme Merkezi (LIC) personeline konfokal mikroskopi kaynakları ve görüntü kaydındaki mükemmel destek için teşekkür ederiz.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 ve mikro; m ve 0.2 &mikro; m Steril FiltreVWR
1,4-DithiothreitolMerck
1-bütanol. >99,5% yıllıkRoth
2log DNA merdiveniNEB
2-MerkaptoetanolRoth
50 mL Şahin tüpleriVWR
79249 Alkin Mega Stokes boyaSigma Aldrich
Asetik asit buzulVWR
Asetonitril, susuz, %99,8Sigma-Aldrich
Ampisilin sodyum tuzu, %99Roth
BDP-FL-PEG4-DBCOJena Bioscience
BiofugeHeraeus
PES membranlı Şişe Üstü Filtre (45 & mikro; M, 22 ve mikro; m)Termo Bilimsel Brillant
Mavi G250 (Coomassie)Roth
BspQINEB
Kamera DS Qi1Nikon
Santrifüj 5417rEppendorf
Santrifüj 5810rEppendorf
CF-400-Cu kare örgü bakır ızgaraEMS
KloramfenikolRoth
CompactStar CS 4VWR
Dekstran, Teksas Kırmızısı, 3000 MW, nötrYaşam Teknolojileri
Dijital sonifiye Branson
Dimetilsülfoksit (DMSO)Aplikit
Dnase IAplikit
Kulak INEB
EcoRI-HFNEB
Çevresel çalkalayıcı inkübatör ES-20Biosan
Etanol mutlakRoth
Etidyum bromür çözeltisiRoth
Filtre,Avanti
Cam plakalarıBio-Rad'ı
desteklerGliserol Proteomik SınıfAmresco
GlisinAplikit
H4-Azido-Phe-OHBachhem
Isı plakası MR HeiTecHeidolph
HindIIINEB
HisTrap FF ham sütunGE Yaşam BilimleriNikel sütunu
Hidroklorür asit dumanı, %37, pa Merck
Aydınlatıcı ix 20INTAS
Aydınlatıcı LAS-4000Fujifilm
İmidazolMerck
Daldırma yağı mikroskopiiçin Merck
İnkübatörler çalkalayıcılar Unimax 1010Heidolph
Mürekkep Oluşturucu 1000Heidolph
IPTG, %>99Roth
KanamisinsülfatRoth
L (+) - ArabinozRoth
Laboratuvar terazileri Genişletilmiş ed2202s/224s-OCESartorius
LB-OrtaRoth
Liyofilizatör Alfa 2-4 LSCMesih
Lizozim, 20000 U/mgRoth
Mikroskop CM 100Philips
Mikroskop Eclipse TS 100Nikon Mikroskopi
kapak camları (15 x 15 mm)VWR
Mikroskopi slaytlarıVWR
MikrodalgaStüdyosu
Mini Ekstruder SetiAvanti Polar Lipidler
NaCl, %>99,5, p.a.Roth
Natriumhidroksit peletleriRoth
Ni-NTA Agaroz, PerfectPro5 Prime
Nucleopore Track-Etch MembranAvanti
PH metre 766 kalimatikKnick
Fenilmetilsülfonilflorid (PMSF)Roth Polipropilen
Sütunlar (1 mL)Qiagen
PowerPac basicBioRad
Propanol-2-olEmplura
Protein merdiveni 10-250 kDaNEB
Devridaim soğutucusu F12Julabo
Takviye halkalarıHerma
SacI HFNEB
SDS PeletlerRoth
Sodyum fosfat dihidrat, NaH2PO4VWR
Steril şırınga filtresi 0,2 mm Selüloz AsetatVWR
T4 DNA LigazNEB
TEMEDRoth
TexasRed Dekstran-KonjugeMoleküler Problar
Thermomix konforEppendorf
THF, yıllık %>99,5Kazein Roth'tan Acros
Triton X 100Roth
Tripton/Pepton
Ultrasonik temizleyiciVWR
Üre paRoth
Vakum pompası 2.5Vacuubrand
XbaINEB
XhoINEB
ZelluTrans rejenere selüloz boru şeklindeki membran (12.0 S / 3.5 S / 1.0 V)Roth

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems. Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).
  2. Jang, Y., Champion, J. A. Self-Assembled Materials Made from Functional Reco....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Elastin like ProteinsProtein AssemblyVesicle FormationFiber FormationCoacervate FormationProtein PurificationFluorescent Cargo EncapsulationDialysis MethodExtrusion TechniqueConfocal Microscopy

İlgili makaleler