Elastin benzeri Proteinlerin tanımlanmış Supramoleküler Yapılara Yönlendirilmiş Montajı ve Tüp Bebek Tespülasyonu

Özet

Organik ve sulu çözücülerin arayüzünde, özel ampifilik elastin benzeri proteinler veziküller, lifler ve çevresel parametrelertarafından tetiklenen koaksivatlar gibi karmaşık supramoleküler yapılarda bir araya getirilir. Açıklanan montaj protokolleri, çeşitli kargoların kapsüllemesini sağlayan, tunable özelliklere sahip Protein Membran Tabanlı Bölmeler (PMBCs) verir.

Özet

Özel proteinaceous yapı taşları minimal hücreler, ilaç dağıtım araçları ve enzim iskeleleri gibi supramoleküler yapıların montajı için çok yönlü adaylardır. Genetik düzeyde ki biyouyumluluk ve ayarı nedeniyle, Elastin benzeri proteinler (ELP) biyoteknolojik ve biyomedikal uygulamalar için ideal yapı taşlarıdır. Bununla birlikte, farklı fizyokimyasal özellikleri ve iyi kapsülleme potansiyeli ile protein bazlı supramoleküler yapıların montajı zor olmaya devam etmektedir.

Burada küresel koaservatlar, lifler ve kararlı veziküller gibi supramoleküler protein mimarileri içine ampifilik ELP'lerin güdümlü kendi kendine montajı için iki etkili protokol salıyoruz. Sunulan montaj protokolleri, uyarlanabilir fizyokimyasal özelliklere sahip ELP'lere dayalı Protein Membran Tabanlı Bölmeler (PMBCs) oluşturur. PMBC'ler faz ayırma davranışını gösterir ler ve yönteme bağımlı membran füzyonlarını ortaya çıkarırlar ve kimyasal olarak çeşitli floresan kargo moleküllerini kapsülleyebilmektedirler. Ortaya çıkan PMBCs bir ilaç formülasyonu ve dağıtım platformu, yapay hücre ve bölümlü reaksiyon alanı olarak yüksek bir uygulama potansiyeline sahip.

Giriş

Biyoteknolojik uygulamalar için supramoleküler yapıların montajı giderek daha önemli hale geliyor^1,2,3,4,5. Koaservates, veziküller ve lifler gibi fonksiyonel mimarilerin istenilen fizikokimyasal özelliklere sahip bir araya toplanması için bileşenlerin fizikokimyasal ve konformasyonel özelliklerini anlamak ve kontrol etmek önemlidir. Doğada bulunan moleküllerin moleküler hassasiyeti nedeniyle, supramoleküler yapıların yapı taşları giderek lipidlere, nükleik asitlere veya proteinlere dayanmaktadır. Sentetik polimerlerle karşılaştırıldığında, proteinaceous yapı taşları genetik düzeyde acil supramoleküler yapılar⁶ üzerinde hassas kontrol sağlar. Bireysel protein yapı taşlarının birincil amino asit (aa) dizisi, molekülerden makroskopik düzeye kadar olan montaj potansiyeline yönelik bilgileri ve son supramoleküler yapının üç boyutlu şekli ve fiziksel özelliklerini özünde kodlar⁷.

Farklı supramoleküler yapıların biraraya toplanması için bildirilen yöntemler genellikle ısıya duyarlı elastin benzeri proteinler (ELP) gibi amfilik proteinleri içerir.^5,8,9, rekombinant oleosin¹⁰ve yapay protein amphiphiles¹¹. Sıcaklık tetiklenen yöntemler misellerin montajına yol açmıştır^4,10,12Lif¹³Yaprak¹⁴ve veziküller^9,15,16. Dinamik protein bazlı veziküllerin oluşumu için organik çözücüler içeren yöntemler uygulanmıştır.^8,11,14. Şimdiye kadar, vezikül oluşumu için uygulanan protokoller genellikle mikrometre büyüklüğündeki montajlar üzerinde montaj kontrolü eksikliği^16,17veya sınırlı montaj verime sahip⁵. Buna ek olarak, rapor edilen bazı ELP bazlı veziküller kapsülleme potansiyelini bozmuş¹²veya zaman içinde sınırlı stabilite⁹. Sunulan protokoller, bu sakıncaları ele alarak, farklı fizyokimyasal özelliklere, iyi kapsülleme potansiyeline ve uzun süreli stabiliteye sahip mikrometre ve alt mikrometre boyutunda supramoleküler yapıların kendi kendine biraraya getirilmesini sağlar. Özel ampifilik ELP'ler, uygulanan protokol ve ilgili çevre koşullarına bağlı olarak küresel koaservatlar ve yüksek derecede sıralanmış bükümlü lif demetlerinden unilamellar veziküllere kadar geniş bir yelpazeyi kapsayan supramoleküler yapılarda bir araya getirilir. Büyük vesiküler Protein Membran Esaslı Bölmeler (PMBC) membran füzyonu ve faz ayırma davranışı gibi tüm ana fenotipleri lipozomlara benzer olarak ortaya koymaktadır. PMBC'ler, basit epifloresan mikroskobu kullanılarak izlenebilen kimyasal olarak çeşitli floresan kargo moleküllerini etkin bir şekilde kapsüllerler. Bu çalışmada kullanılan tekrarlayan ELP alanları protein bazlı supramoleküler mimariler için çekici yapı taşlarıdır.¹⁸. ELP pentapeptid tekrar ünitesi (VPGVG) yapısal ve fonksiyonel özelliklerini korurken, dördüncü pozisyonda proline (valine, V) dışında farklı aa tolere bilinmektedir¹⁹. Farklı hidrofilik ve hidrofobik etki alanları içeren amfilik ELP'lerin tasarımı, VPGXG'ye farklı hidrofobiklik, polarite ve şarj ile aa konuk kalıntıları (X) yerleştirilerek gerçekleştirildi.²⁰. Hidrofilik etki alanı misafir kalıntısı olarak yüklü glutamik asit (E) veya arginin (R) içererken, hidrofobik fenilalanin (F) veya izolösin (I) ile donatılmış amfilik ELP etki alanları. Uygun amfilik ELP yapıları ve ilgili aa dizileri listesi ek bilgi ve referanslar bulunabilir^8,21. Floresan mikroskopisi ile görselleştirme için küçük floresan boyalar veya floresan proteinler ile donatılmış tüm yapı taşları. mEGFP ve diğer floresan proteinler N-terminalel ELP amphiphiles hidrofilik etki alanlarında erimiş edildi. Organik boyalar bakıriçermeyen suşu ile alkine-azid sikloaddition (SPAAC) ile eş-çeviriile doğal olmayan amino asit (UAA) ile konjuge edildi. UAA'nın ortak çevirisipara-azidophenylalanine (pAzF)²²hidrofilik ELP etki alanının N-terminal modifikasyonuna izin verir. Bu şekilde yeşil floresan boya BDP-FL-PEG₄-DBCO (BDP) veya süzme siklotine sahip herhangi bir küçük floresan molekül floresan prob olarak kullanılabilir. UAA pAzF'in başarılı bir şekilde eklenmesi ve boyanın SPAAC ile sikloeklenmesi, ilgili triptik peptidlerin verimli iyonizasyonu nedeniyle LC-MS/MS ile kolayca doğrulanabilir.⁸. Floresan proteinler çoğu organik çözücüile uyumsuz olduğundan, bu küçük organik boya montaj protokolleri için çözücü seçimini genişletmek için uygulanmıştır. Laboratuarımızda geliştirilen supramoleküler yapılar için en verimli iki montaj protokolü aşağıda açıklanmıştır. THF şişme yöntemi sadece organik boya modifiye amfilik ELP ile uyumludur. Buna karşılık, 1-butanol (BuOH) ekstrüzyon yöntemi floresan prob gibi birçok protein ile uyumludur, örneğin mEGFP, açıklanan yöntem bu füzyon proteinlerinin floresansını tamamen koruduğundan. Buna ek olarak, küçük moleküllerin kapsülleme ve vesiküler füzyon davranışı En iyi BuOH ekstrüzyon yöntemi istihdam çalışır.

Protokol

1. Amfilik elastin benzeri proteinlerin (ELP) tasarımı ve klonlanması

1. Klon ve başka bir yerde^{açıklandığı}gibi yapıları tasarım 8^,20. Plazmidler istek üzerine mevcuttur.

2. Protein ekspresyonu, arınma ve hazırlama

1. F20E20-mEGFP ve F20E20-mCherry ekspresyonu
   1. Ana ifade kültürünü bir gecede ön kültürden 0,3'ün OD_600'üne bağla. 37 °C'de kuluçka, steril 400 mL LB ortamda 2 L'lik bir şişede uygun antibiyotiklerle desteklenerek 200 rpm.
   2. IpTG stok çözeltisini (1 M) ultra saf suda ifade kültürünün indüksiyonu için hazırlayın.
   3. OD₆₀₀ 0.5-0.8'e ulaşıldığında, ifade kültürüne IPTG'yi 1 mM'lik son konsantrasyona ekleyin ve kuluçka sıcaklığını 20 °C'ye düşürün. 200 rpm'de yaklaşık 20 saat boyunca 20 °C'de ifadeye izin verin.
2. UAA pAzF içeren amfilik ELP ekspresyonu
   1. İki plazmid pEVOL pAzF ve örneğin pET28-NMBL-(TAG)R40F20-onun 0.3'ün OD_600'ünü içeren gecee ait E. coli ön kültürden ana ifade kültürünü aşılamak (amino asit dizileri için ek bilgilere bakın). 37 °C'de kuluçka, steril 400 mL LB orta kanamisin ve kloramfenikol ile desteklenen 2 L şişede 200 rpm.
   2. Ultra saf suda 100 mM pAzF stok çözeltisi hazırlayın. 10 mL pAzF stok çözeltisi için 206,2 mg pAzF ağırlığında ve 8 mL ultra saf suda yeniden askıya alın. pAzF'ı eritmek için çözeltinin pH'ını 3 M NaOH ile yükseltin ve şiddetle karıştırın. pAzF çözündüğünde, pH'ı dikkatlice 10,5'e düşürün ve 10 mL'lik son hacmine ultra saf su ekleyin. Steril filtre (0,22 μm) kullanın ve çözeltiyi 2 mL reaksiyon tüpünde aliquot kullanın.
   3. Ultra saf suda 1 M IPTG stok çözeltisi ve ultra saf suda %20 arabinose stok çözeltisi hazırlayın.
   4. OD₆₀₀ 0.5-0.8'e ulaşıldığında, ifade kültürüne 2 mM'lik son konsantrasyona pAzF ekleyin. PAzF alımı için izin vermek için 10 dakika, 37 °C, 200 rpm için kuluçka kültürü.
   5. IpTG (1 mM) ve arabinose 'un eşzamanlı ilavesi ile hedef proteinin ekspresyonu ve gerekli tRNA/t-RNA sentezinin ekspresyonu (%2) kuluçka sıcaklığını 20 °C'ye düşürün.
   6. 200 rpm'de yaklaşık 20 saat boyunca 20 °C'de ifadeye izin verin. 4 °C, 4000 x g,40 dk.
3. Hücre lisisi ve protein arınması
   1. Lysis tamponundaki E. coli peletini (kültür litresi 10 mL; 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 4 M üre, %0,25 Triton X-100) lizozym (0.1 mg/mL) ve PMSF (0.1 mM) içeren yeniden askıya alın. Buz üzerinde 30 dakika kuluçka ve dondurma ve iki kez daha sonra sıvı azot içinde örnek batırarak çözülme.
   2. Süspansiyonu sonicate (30%, 15 kez, 30 s: 10 s) ve santrifüj (4 °C, 40.000 x g için 40 dk) ile lysate temizleyin.
   3. Afinite kromatografisi kullanarak proteini arındırın (örn. bir kesir kolektöre bağlı bir FPLC sistemi kullanarak 1 mL nikel kolonda; bkz. Elüsyon tamponu (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 4 M üre, 250-500 mM imidazol) ile proteini yakınlaştırın ve 4 °C'de ilave edilene kadar saklayın.
   4. Arınma verimliliğini SDS-PAGE üzerinden analiz edin.

3. SPAAC ile ELP'lerin boya-modifikasyonu

1. Kabaca ELP çözeltisinin konsantrasyonu tahmin.  PAzF-R40F20 dizisi UV aralığında emici amino asitler eksik olduğundan konsantrasyon değerlendirmesi için₂₈₀ emilimi değerli değildir. Bu nedenle, daha önce lyophilized ve ağırlıklı ELP amphipileS PAGE bant karşılaştırma için bir referans olarak kullanılabilir. ElP çözeltilerinden sds page bantlarının toplam gri değer intesitesinin bilinen konsantrasyonlarla karşılaştırılması ve numunenizin kaba konsantrasyonu tahmin edilebilir.
2. 500 μL ELP çözeltisine (~20 μM) 1 000 adet floresan boya BDP-FL-PEG4-DBCO (10 mM stok çözeltisi; 20 μM son konsantrasyon) ekleyin. 15 °C'de yaklaşık 10 saat boyunca reaksiyon uyguluyor, titreyerek ve ışıktan korunarak.
3. Daha fazla kullanım için aşırı BDP'yi kaldırmak için reaksiyonu diyalize sin.
   1. Diyaliz membranını (örn. 12 kDa kesme) ultra saf suda 10 dakika boyunca dengeleyin. Açılışta diyaliz membranı düzeltmek için, böylece tüp kapatarak, açılış üzerine delikli çekirdek ile bir reaksiyon tüpü kapağı yerleştirin.
   2. Reaksiyon tüpünü seçilen arabelleğe ters yerleştirin. Her seferinde en az 3 saat diyalizden sonra tamponu (2-5 L) iki kez değiştirin. Başarılı diyaliz sağlamak için diyaliz membran ve tampon arasında sıkışmış herhangi bir hava kabarcıkları çıkarın.

4. THF şişme protokolü

1. Fosfat veya tris tampon (10 mM) kararlı pH 7.5 tuzları ve onun etiketi saflaştırma kalan bileşikleri kaldırmak için karşı homojen ELP çözeltisi diyaliz.
2. Lyophilizer hazırlayın ve dondurularak kurutma için başlangıç sıcaklığına kadar soğutun.
3. Aliquot diyaliz protein çözeltisi 1.5 mL reaksiyon tüpleri (tüp başına 50-500 μL) ve şok dondurma sıvı nitrojen. Donma-kurutma sırasında farklı protein çözeltilerinin istenmeyen şekilde karıştırılmasını önlemek için, reaksiyon tüpünün üzerine küçük bir delik olan kapaklar konulabilir ve kısmen kapatılabilir.
4. Dondurulmuş protein örneklerini sıvı nitrojenden alın ve dondurularak kurumaya başlamak için hemen lyophilizer'a yerleştirin. Numune tamamen kuruduğunda (yaklaşık 24-48 saat) dondurularak kurutulma işlemi tamamlanır. Daha sonra, kuru N₂ile liyofilize amfilik ELP'leri havalandırın, ardından hava nemi ile temas tan kaçınmak için reaksiyon tüpkapaklarını hemen kapatın.
5. Lyophilized örnekleri (ELP, 5-10 μM) saf THF ekleyin ve THF ELP şişmesine izin vermek için 15 dakika boyunca buzlu su içeren bir su banyosu sonicator çözüm yerleştirin.
6. Vezikül oluşumu için 30-60 °C'ye kadar veya lif oluşumu için 90 °C'ye kadar bir termocycler önceden ısıtın ve ultra saf su veya tampon içeren yeni reaksiyon tüpleri hazırlayın (50 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 50 mM NaCl, pH 5–13). Küresel koacervatlar pH 9-13 içinde ağırlıklı olarak 20 °C'de toplanır. Vezikül oluşumu pH 7 ve 9 arasında 50-60 °C'de tercih edilir. Lif oluşumu pH 5 ve 12 arasında 60 °C'nin üzerinde ön kaynaklıdır.
7. Sonication adım sonra, termocycler hazırlanan ultrasaf su veya tampon çözeltisi yanı sıra ELP / THF çözeltisi yerleştirin ve 5 dakika boyunca istenilen sıcaklığa kadar ısıtın. Sıcaklık elde edildiğinde önceden ısıtılmış ELP/THF çözeltisi önceden ısıtılmış ultra saf su veya tampon çözeltisinin üzerine dikkatlice tabakalaştırılmalıdır. İki aşamanın ayrı bir arabirimi ile net bir ayrımı görünür olmalıdır.
8. Karışımı tekrar termocycler'a yerleştirin ve arayüze vezikül veya lif oluşumuna izin vermek için 20 dk kuluçkaya yatırın. Daha sonra, floresan mikroskopi veya diyaliz yoluyla analiz önce 10 dakika oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
9. Ultra saf su veya tampona karşı supramoleküler yapıları içeren diyaliz çözeltisi (50 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO_4,50 mM NaCl, pH 7-10).

5. BuOH ekstrüzyon protokolü

1. Ultra saf su veya tamponda 1-50 μM ELP çözeltisi hazırlayın (50 mM PB pH 7.5, 100 mM NaCl, 4 M üre içerebilir). Amfilik ELP F20R20-mEGFP ve F20R20-mCherry çözeltisinin konsantrasyonu molar yok olma katsayıları (F20R20-mEGFP A₂₈₀ = 22015 M^-1 cm^-1 ve F20R20-mCherry A₂₈₀ = 34380 M^-1 cm^-1) (ek bir dizi için bkz.
2. %10-20 (v/v) 1-butanol ekleyin ve hemen yukarı ve aşağı boru lama veya bir şırınga ile birden fazla kez çizerek çözeltikarıştırın. 0,25 x 25 mm iğne ile donatılmış ortak bir 100 μL pipet veya Hamilton şırınga uygulanabilir. Karıştırma sırasında çözeltinin bulanıklığı artmalıdır, vezikül oluşumunu gösteren. 1-oktanol %5-15% (v/v) 1-butanol yerine vezikül ekstrüzyonu için de kullanılabilir.
3. Dar bir boyut dağılımı elde etmek için, oda sıcaklığında 1 μm gözenek boyutuna sahip bir membran aracılığıyla mini ekstrüzyon kullanarak vezikülleri ekstrüzyon. Ekstrüzyon için kullanılan membran boyutu veziküllerin üst boy kesme belirler.
4. Diyaliz veziküller yukarıda açıklandığı gibi (adım 3.3) kalıntı 1-butanol kaldırmak için.

6. BuOH ekstrüzyon protokolü ile boyama kapsülleme

1. 10 mM Tris-HCl'de yaklaşık 40 μL ELP çözeltisi, 1 μL Dextran Texas Red (0.0025 mg/mL son konsantrasyon) ile pH 8'i karıştırın.
2. Çözeltiye 10 μL BuOH ekleyin ve 0,25 x 25 mm iğne ile donatılmış bir şırınga ile 5-10 kez dışarı çıkar.

7. Floresan mikroskopi ile supramoleküler yapıların analizi

1. Bir cam slayt üzerine bir takviye halkası yerleştirin ve sıkıca cam yapışkan tarafı basın.
2. Takviye halkasının içine numunenin 5 μL'sini ekleyin ve üzerine bir kapak fişi yerleştirin.
3. Analiz sırasında numunenin buharlaşmasını önlemek için numuneyi kapak kapağındaki kenarlara oje ile kapatın.
4. Daha önce açıklandığı gibi floresan mikroskobu yürütmek⁸.

Sonuçlar

Vezikül üretimi için protokol geliştirme
Şekil 1 iki farklı vezikül hazırlama yöntemleri özetliyor. Sol taraftaki THF şişme yöntemi art arda üç adımdan oluşur ve sıcaklığa bağlı olarak ELP'nin farklı supramoleküler montajları ile sonuçlanır. Şekil 1A epifloresan mikroskopi görüntülerinde BDP-R20F20'den birleştirilmiş veziküller ve BDP-R40F20'den monte edilen fibrillary yapılar gösterilmektedir. Sağ tarafta gösteri...

Tartışma

Tanımlanan supramoleküler yapıların montajı için açıklanan protokolleri takip eden bir hata, esas olarak spesifik olmayan agregaların(Şekil 2, IV) oluşumuna ya da homojen olarak dağıtılan ELP-amphipilelerin oluşumuna yol açar. Protokolün kritik adımları aşağıda ele alınmıştır:

Amfilik ELP'nin yüksek ekspresyon verimi için 20°C'lik nispeten düşük bir sıcaklık en uygun uyruktur. Amfilik ELP'nin başarılı afinite dayalı saflaşması için lysis tamponundaki 4 M'lik üre k...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 ve mikro; m ve 0.2 &mikro; m Steril Filtre	VWR
1,4-Dithiothreitol	Merck
1-bütanol. >99,5% yıllık	Roth
2log DNA merdiveni	NEB
2-Merkaptoetanol	Roth
50 mL Şahin tüpleri	VWR
79249 Alkin Mega Stokes boya	Sigma Aldrich
Asetik asit buzul	VWR
Asetonitril, susuz, %99,8	Sigma-Aldrich
Ampisilin sodyum tuzu, %99	Roth
BDP-FL-PEG4-DBCO	Jena Bioscience
Biofuge	Heraeus
PES membranlı Şişe Üstü Filtre (45 & mikro; M, 22 ve mikro; m)	Termo Bilimsel Brillant
Mavi G250 (Coomassie)	Roth
BspQI	NEB
Kamera DS Qi1	Nikon
Santrifüj 5417r	Eppendorf
Santrifüj 5810r	Eppendorf
CF-400-Cu kare örgü bakır ızgara	EMS
Kloramfenikol	Roth
CompactStar CS 4	VWR
Dekstran, Teksas Kırmızısı, 3000 MW, nötr	Yaşam Teknolojileri
Dijital sonifiye Branson
Dimetilsülfoksit (DMSO)	Aplikit
Dnase I	Aplikit
Kulak I	NEB
EcoRI-HF	NEB
Çevresel çalkalayıcı inkübatör ES-20	Biosan
Etanol mutlak	Roth
Etidyum bromür çözeltisi	Roth
Filtre,	Avanti
Cam plakaları	Bio-Rad'ı
desteklerGliserol Proteomik Sınıf	Amresco
Glisin	Aplikit
H4-Azido-Phe-OH	Bachhem
Isı plakası MR HeiTec	Heidolph
HindIII	NEB
HisTrap FF ham sütun	GE Yaşam Bilimleri		Nikel sütunu
Hidroklorür asit dumanı, %37, pa	Merck
Aydınlatıcı ix 20	INTAS
Aydınlatıcı LAS-4000	Fujifilm
İmidazol	Merck
Daldırma yağı mikroskopi	için Merck
İnkübatörler çalkalayıcılar Unimax 1010	Heidolph
Mürekkep Oluşturucu 1000	Heidolph
IPTG, %>99	Roth
Kanamisinsülfat	Roth
L (+) - Arabinoz	Roth
Laboratuvar terazileri Genişletilmiş ed2202s/224s-OCE	Sartorius
LB-Orta	Roth
Liyofilizatör Alfa 2-4 LSC	Mesih
Lizozim, 20000 U/mg	Roth
Mikroskop CM 100	Philips
Mikroskop Eclipse TS 100	Nikon Mikroskopi
kapak camları (15 x 15 mm)	VWR
Mikroskopi slaytları	VWR
Mikrodalga	Stüdyosu
Mini Ekstruder Seti	Avanti Polar Lipidler
NaCl, %>99,5, p.a.	Roth
Natriumhidroksit peletleri	Roth
Ni-NTA Agaroz, PerfectPro	5 Prime
Nucleopore Track-Etch Membran	Avanti
PH metre 766 kalimatik	Knick
Fenilmetilsülfonilflorid (PMSF)	Roth Polipropilen
Sütunlar (1 mL)	Qiagen
PowerPac basic	BioRad
Propanol-2-ol	Emplura
Protein merdiveni 10-250 kDa	NEB
Devridaim soğutucusu F12	Julabo
Takviye halkaları	Herma
SacI HF	NEB
SDS Peletler	Roth
Sodyum fosfat dihidrat, NaH2PO4	VWR
Steril şırınga filtresi 0,2 mm Selüloz Asetat	VWR
T4 DNA Ligaz	NEB
TEMED	Roth
TexasRed Dekstran-Konjuge	Moleküler Problar
Thermomix konfor	Eppendorf
THF, yıllık %>99,5	Kazein Roth'tan Acros
Triton X 100	Roth
Tripton			/Pepton
Ultrasonik temizleyici	VWR
Üre pa	Roth
Vakum pompası 2.5	Vacuubrand
XbaI	NEB
XhoI	NEB
ZelluTrans rejenere selüloz boru şeklindeki membran (12.0 S / 3.5 S / 1.0 V)	Roth