Method Article

Fare Kornea ve Konjonktiva Canlı Görüntüleme için Özel Multifoton Mikroskop platformu

DOI:

10.3791/60944

⸱

May 17th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, National Taiwan University, 2Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University, 3Molecular Imaging Center, National Taiwan University, 4Department of Dermatology, National Taiwan University Hospital, and College of Medicine, 5Research Center for Developmental Biology and Regenerative Medicine, National Taiwan University, 6Department of Ophthalmology, Chang Gung Memorial Hospital, 7College of Medicine, Chang Gung University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan canlı fare oküler yüzey görüntüleme için bir multifoton mikroskobik platformdur. Floresan transgenik fare hücre çekirdekleri, hücre zarları, sinir lifleri ve oküler yüzey içinde kılcal damarların görüntülenmesi sağlar. Kolaj nasyonal yapılardan elde edilen doğrusal olmayan ikinci harmonik nesil sinyalleri stromal mimariler için etiketsiz görüntüleme sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konvansiyonel histolojik analiz ve hücre kültürü sistemleri in vivo fizyolojik ve patolojik dinamikleri tamamen simüle etmek için yeterli değildir. Multifoton mikroskopi (MPM) in vivo hücresel düzeyde biyomedikal çalışma için en popüler görüntüleme yöntemlerinden biri haline gelmiştir, avantajları yüksek çözünürlük, derin doku penetrasyonu ve minimal fototoksisite içerir. Biz özelleştirilmiş fare göz tutucu ve in vivo oküler yüzey görüntüleme için stereotaksik bir sahne ile bir MPM görüntüleme platformu tasarladık. Çift floresan protein muhabiri fare hücre çekirdekleri görselleştirme sağlar, hücre zarları, sinir lifleri, ve oküler yüzey içinde kılcal damarlar. Multifoton floresan sinyallerine ek olarak, ikinci harmonik nesil (SHG) elde etmek aynı anda kolajnöz stromal mimarinin karakterizasyonuna olanak sağlar. Bu platform kornea ve konjonktiva da dahil olmak üzere tüm oküler yüzey, doğru konumlandırma ile intravital görüntüleme için kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kornea ve konjonktiva da dahil olmak üzere oküler yüzey yapıları, dış bozukluklar diğer derin oküler dokuları korumak. Gözün saydam ön kısmı olan kornea, ışığı göze yönlendirmek için hem kırılma lensi hem de koruyucu bariyer işlevi görür. Kornea epitelkorenin en dış tabakasıdır ve yüzeysel hücrelerin, kanat hücrelerinin ve bazal hücrelerin farklı katmanlarından oluşur. Kornea stroma keratositler ile gömülü sofistike paketlenmiş kolajnöz lamellae oluşur. Kornea endotel, düz altıgen hücrelerin tek bir tabaka, onun pompalama fonksiyonları ile nispeten susuz durumda kornea stroma tutarak kornea şeffaflığını korumak önemli bir role sahiptir1. Limbus kornea ve konjonktiva arasındaki sınırı oluşturur, ve kornea epitel kök hücrelerinin rezervuar2. Yüksek vaskülarize konjonktiva mukus ve gözyaşı üreterek gözleri yağlamak için yardımcı olur3.

Kornea yüzeyyapılarının hücre dinamiği geleneksel olarak histolojik analiz veya in vitro hücre kültürü ile incelenir ve bu dinamikler in vivo hücre dinamiklerini yeterince simüle etmeyebilir. Non-invaziv canlı görüntüleme yaklaşımı, bu nedenle, böyle bir boşluğu köprü olabilir. Yüksek çözünürlük, minimal fotohasar ve daha derin görüntüleme derinliği içeren avantajları nedeniyle, MPM biyolojik araştırma4,5,,6,,7,8çeşitli alanlarda güçlü bir modalite haline gelmiştir. Kornea görüntüleme için, MPM hücre içi NAD (P)H türetilen içsel otofloresan hücresel bilgi sağlar. Femtosecond lazer tarama altında non-centrosimetrik tip I kollajen liflerden elde edilen ikinci harmonik nesil (SHG) sinyalleri ek boyama prosedürleri olmadan kolajnöz stromal yapılar sağlar9. Daha önce, biz ve diğer gruplar hayvan ve insan kornea görüntüleme için MPM istismar var9,10,11,12,13,14,15.

Belirli hücre popülasyonlarında floresan proteinleri sergileyen transgenik fare hatları, hücre biyolojisi alanında gelişim, doku homeostazları, doku rejenerasyonu ve karsinogenez gibi çeşitli çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Biz kornea9,,10,saç folikülleri10 ve epidermis10 MPM tarafından in vivo görüntüleme için floresan proteinleri ile etiketlenmiş transgenik fare suşları kullanılır. TDTomato ve hücre çekirdeği ile etiketlenmiş hücre zarı ile çift floresan fare suşu iki fare suşlarından üretilir: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J, #021847)16 ve mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. R26R-GR transgenik fare hattı, Gt (ROSA)26Sor lokusuna yerleştirilen H2B-EGFP füzyon geni ve mCherry-GPI çapa sinyali füzyon geni de dahil olmak üzere çift floresan protein muhabiri yapısı içerir. mT-mG transgenik türü hücre zarı hedefli tdTomato ve EGFP floresan Cre-reporter farelerdir. Cre rekombinasyon dan önce, tdTomato floresan ekspresyonu ile hücre zarı proteini çeşitli hücrelerde yaygın olarak bulunur. Bu transgenik fare suşları, cre uyarma olmadan tdTomato ile çekirdek-EGFP ve membranı görselleştirmemizi sağlar. İki dişi (R26R-GR+/+) ve bir erkek (mT-mG+/+) transgenik fare deneyler için yeterli fare üretmek için birlikte yetiştirildi. Bu çalışmada r26R-GR+/-;mT-mG+/- genotip, çift floresan fare türü olan yavruları kullanıldı. Daha önce açıklandığı gibi bir floresan muhabir fare hattı ile karşılaştırıldığında9,10, Bu çift floresan muhabir fare suşu görüntüleme süresi% 50 azaltılmış edinme ile bize sağlar.

Bu çalışmada, görüntüleme platformumuz ve çift floresan transgenik farelerimizi kullanarak oküler yüzeyin in vivo görüntülemesi için ayrıntılı bir teknik protokolü adım adım açıklıyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri, Ulusal Tayvan Üniversitesi ve Chang Gung Memorial Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan prosedürlere uygun olarak yapılmıştır.

1. Multifoton mikroskopi kurulumu

  1. Su daldırma 20x 1.00 NA hedefi(Şekil 1A)ile dik bir mikroskobu temel alan bir sistem oluşturun.
  2. Uyarma kaynağı olarak Ti: Safir lazer (dalga boyunda) kullanın. Lazer çıkış dalga boyunu EGFP için 880 nm ve tdTomato için 940 nm olarak ayarlayın (Şekil 1A).
  3. SHG/EGFP ve EGFP/tdTomato(Şekil 1A)ayrımı için iki dikroik ayna (495 nm ve 580 nm) ekleyin. Spektronik ayrı SHG sinyalleri, EGFP ve tdTomato bandpass filtreleri 434/17nm, 510/84nm ve 585/40nm(Şekil 1A).
  4. Görüntü kalitesini optimize etmek ve fotobeyazrlama ve doku hasarını önlemek için lazer gücünü korneanın görüntülenmesi için yaklaşık 35 mW, limbus için 50 mW olarak ayarlayın. Lazer optik sistemi geçmeden önce lazer gücünü ölçün. Örneklerde tam lazer gücü yaklaşık 8-9 mW'dır. Tam mikroskobik tasarım Şekil 1A'dagösterilmiştir.
    NOT: Lazer gücünün üst sınırı, fotoğraf beyazlatma ve doku hasarını önlemek için 70 mW olarak ayarlanır.

2. Canlı görüntüleme için hayvan hazırlığı

  1. Deney için 8-12 haftalık fareler kullanın. Genel anestezi için 50-80 mg/kg kiremitamin HCl ve zolazepam HCl enjekte edin. Bir ayak çimdikleme tarafından çekilme refleks yanıt eksikliği olup olmadığını kontrol edin. Stabil solunum hızı nın izlenmesi için yeterli anestezi önemlidir.
    NOT: 8 haftalık ve üzeri fareler, göz bebekleri olgunlaştığı için önerilir.
  2. Fareyi ısıtılmış bir sahnede anestezi altına alın ve sıcaklık izleme probunu anüse yerleştirin.
    DİkKAT: Prob, ısıtıcının aşırı ısınmasını ve sıcak çarpmasının indüksiyonunu önlemek için havaya maruz kalmadan anal kaviteye tam olarak yerleştirilmelidir.

3. Göz yüzeyinin canlı görüntülemesi için göz tutma

  1. Oküler yüzeyin canlı görüntülemesi için, iki bölümden oluşan özel olarak tasarlanmış stereotaksik fare tutucuyu kullanın: baş tutucuyu stabilize etmek için bir kafa tutucu ve göz kapaklarını geri çekmek ve tüm oküler yüzeyi ortaya çıkarmak için bir göz tutucu(Şekil 1B-D).
  2. Dış işitsel meatus içine kulak çubukları yerleştirin ve baş tutucunun üç noktalı fiksasyon korumak(Şekil 1B,D).
  3. Topikal salin% 0.4 oksibuprokain hidroklorür bir çözüm uygulayın ve oküler yüzeyanestezik için 3 dakika bekletin.
  4. Göz küresinin uygun manuel göz kapağı geri çekilmesi ile çıkıntılı olduğundan emin olun. Aksi takdirde, iskemi ve göz küresi kanaması oluşabilir.
  5. Dikkatle göz kapağı nın polietilen tüp göz kapağı marjı boyunca oküler yüzeyi ortaya çıkarmak için bir döngü yerleştirin. Polietilen tüp(Şekil 1C,D)döngü ile kaplı uçları ile bir No 5 Dumont forceps oluşan göz tutucusu ile göz küresi stabilize.
  6. Göz tutucunun distal forceps bir topun kullanarak Vida forceps göz küresi kararlı tutmak için(Şekil 1D).
  7. Oküler yüzeyin nemini her saat korumak için kornea yüzeyine 1.338 kırılma indisi ile bir göz jeli uygulayın. Buna ek olarak, görüntüleme sırasında her saat göz jeli düzenli uygulama kornea da bulutlama önlemek.
  8. Merkezi korneadan çevre bölgeye tüm kornea yüzeyinde görüntüleme için step motorlu sahnede kilitli tutucu ile göz küresini döndürün(Şekil 1C,D).
    DİkKAT: Göz jeli hem fazla hem de yetersiz miktarda görüntüleme sırasında görüntülerin kalitesini etkileyebilir. Bu nedenle, düzenli olarak yüzeynemli tutmak için her saat göz jeli takviyesi görüntüleme için önemlidir.

4. Z-seri görüntü edinimi

NOT: Bırakma hareketi yapıtlarını azaltmak için her yığındaki ilk ve son slaytı ayarlayın.

  1. Görüntüleri çekmeden önce, bir cıva ışık kaynağı ile hedefleme alanı görüntü.
  2. Yazılımı açmak için mikroskop yazılımının simgesini tıklatın.
  3. Oküler yüzeydeki hücresel yapıyı görselleştirmek için uygun PMT kazancını ve dijital kazancı seçin.
  4. Bir yığın elde etmek için ilk slaydı ve son slaydı ayarlayın.
  5. Görüntü çözünürlüğü ve z adımı için sayısal değerleri girin, örneğin 512 x 512 ve 1 μm z adımı olarak.
  6. Z-seri görüntüleri toplamak için Başlat düğmesine tıklayın.
  7. Aynı bölgede iki kez canlı görüntü elde edin, ilki SHG/EGFP sinyalleri için 880 nm uyarma ve EGFP/tdTomato sinyalleri toplama için 940 nm uyarma da ikinci.
    NOT: İki yığının birleşimi 3 kanal görüntüsü sağlar. Görüntü çözünürlüğü ve tbmkün boyutu sırasıyla 512 x 512 piksel ve 157 μm x157 m idi.

5. Görüntü işleme ve 3D rekonstrüksiyon

  1. Fiji yazılım18içine z-seri görüntüleri yükleyin.
  2. Arka plan gürültülerini azaltmak için Fiji'deki eklenti Median 3D filtresini seçin.
  3. Görüntüleri keskinleştirmek için Fiji'deki Paket Keskinliği Olmayan Maske filtresini seçin.
  4. Görüntülerin kalitesini otomatik olarak optimize etmek için parlaklık/kontrast olarak "Otomatik" seçeneğini tıklayın.
  5. Z-seri görüntüleri dışa aktarabilmek için görüntüleri görüntü dizileri olarak kaydedin.
  6. Z-seri görüntüleri, hacim oluşturma yı kullanarak 3D yeniden yapılandırma için ticari yazılımlara (örn. Avizo lite) yükleyin.
  7. Tüm MPM görüntülerinde sırasıyla egfp, tdTomato ve SHG sinyalleri sırasıyla sözde yeşil, kırmızı ve sesiz renktedir.
  8. Anlık görüntüye göre 3B yapı resimleri yakalayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu canlı görüntüleme platformu kullanılarak, fare oküler yüzey hücresel düzeyde görselleştirilmiş olabilir. Oküler yüzeydeki tek hücreleri görselleştirmek için, hücre zarında ifade edilen çekirdek ve tdTomato ile egfp ile çift floresan transgenik fareler kullandık. Kollajen açısından zengin kornea stroma SHG sinyalleri ile vurgulandı.

Kornea epitelinde yüzeyel hücreler, kanat hücreleri ve bazal hücreler(Şekil 2)görselleştirildi. Çift floresan transgenik farelerde,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir kontrol yazılımı ile bu özel inşa MPM görüntüleme platformu fare epitel organlarının intravital görüntüleme için kullanılmıştır, deri dahil10, saç folikülü10 ve göz yüzeyi9,10 (Şekil 1A). Özel olarak üretilen sistem, projemizin başlangıcından bu yana çeşitli deneyler için optik bileşenleri değiştirme esnekliği için kullanılmıştır. Bu görüntüleme metodolojisi ticari MPM ürünleri için...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bilim ve Teknoloji Bakanlığı, Tayvan (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), Ulusal Tayvan Üniversitesi Hastanesi (NTUH108-T17) ve Chang Gung Memorial Hastanesi, Tayvan (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMR3PG1623).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AVIZO Lite yazılımıThermo Fisher BilimselSürüm: 2019.3.0
Bant geçiren filtrelerSemrockFF01-434/17
FF01-500/24
FF01-585/40
Dikroik aynalarSemrockFF495-Di01-25x36
FF580-Di01-25x36
GalvanoThorlabsGVS002
Jade BIO kontrol yazılımıSouthPort ŞirketiYeşim BIO
Oksibuprokain hidroklorürSigmaO0270000
PMTHamamatsuH7422A-40
Poliestiren TüpBECTON DICKINSON427401
Stereotaksik fare tutucuStep Technology Co., Ltd000111
Ti: Safir lazerSpektrumları-FizikMai-Tai DeepSee
Dik mikroskopiOlympusBX51WI
Vidis JelDr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbHD13581
ZoletilVirbacVR-2831

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, Pt 2 101-108 (1989).
  3. Hodges, R. R., Dartt, D. A. Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins. Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).
  4. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5251-5259 (2006).
  5. Konig, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200, Pt 2 83-104 (2000).
  6. Rompolas, P., et al. Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis. Science. 352 (6292), 1471-1474 (2016).
  7. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
  8. Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle. Nature Cell Biology. 20 (12), 1361-1369 (2018).
  9. Wu, Y. F., et al. Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging. Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).
  10. Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  11. Lo, W., et al. Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3501-3507 (2012).
  12. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis. Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024013(2007).
  13. Jester, J. V., et al. Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging. Oculur Surface. 2 (1), 10-20 (2004).
  14. Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1087-1094 (2007).
  15. Hao, M., et al. In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope. Experimental Eye Research. 91 (2), 308-314 (2010).
  16. Chen, Y. T., et al. R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse. PLoS One. 7 (9), 46171(2012).
  17. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye. Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).
  20. Zhang, H., et al. Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6526-6536 (2013).
  21. Lee, J. H., et al. Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo. Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).
  22. Ehmke, T., et al. In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice. Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).
  23. Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration. Cell Stem Cell. 18 (2), 243-252 (2016).
  24. Mesa, K. R., et al. Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
  25. Goh, C. C., et al. Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury. Journal of Investigative Dermatology. 135 (4), 1181-1184 (2015).
  26. Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22 (5), 643-654 (2005).
  27. Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of Immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).
  28. Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiphoton MicroscopyOcular Surface ImagingMouse Cornea ImagingSecond Harmonic GenerationDual Fluorescent ReporterCustom Eye HolderStereotaxic StageZ Serial ImagingFluorescent Protein VisualizationCorneal Stroma Analysis

Related Articles