Fare Kornea ve Konjonktiva Canlı Görüntüleme için Özel Multifoton Mikroskop platformu

Kornea ve konjonktiva da dahil olmak üzere oküler yüzey yapıları, dış bozukluklar diğer derin oküler dokuları korumak. Gözün saydam ön kısmı olan kornea, ışığı göze yönlendirmek için hem kırılma lensi hem de koruyucu bariyer işlevi görür. Kornea epitelkorenin en dış tabakasıdır ve yüzeysel hücrelerin, kanat hücrelerinin ve bazal hücrelerin farklı katmanlarından oluşur. Kornea stroma keratositler ile gömülü sofistike paketlenmiş kolajnöz lamellae oluşur. Kornea endotel, düz altıgen hücrelerin tek bir tabaka, onun pompalama fonksiyonları ile nispeten susuz durumda kornea stroma tutarak kornea şeffaflığını korumak önemli bir role sahiptir¹. Limbus kornea ve konjonktiva arasındaki sınırı oluşturur, ve kornea epitel kök hücrelerinin rezervuar². Yüksek vaskülarize konjonktiva mukus ve gözyaşı üreterek gözleri yağlamak için yardımcı olur³.

Kornea yüzeyyapılarının hücre dinamiği geleneksel olarak histolojik analiz veya in vitro hücre kültürü ile incelenir ve bu dinamikler in vivo hücre dinamiklerini yeterince simüle etmeyebilir. Non-invaziv canlı görüntüleme yaklaşımı, bu nedenle, böyle bir boşluğu köprü olabilir. Yüksek çözünürlük, minimal fotohasar ve daha derin görüntüleme derinliği içeren avantajları nedeniyle, MPM biyolojik araştırma^4,5,,^6,,7,8çeşitli alanlarda güçlü bir modalite haline gelmiştir. Kornea görüntüleme için, MPM hücre içi NAD (P)H türetilen içsel otofloresan hücresel bilgi sağlar. Femtosecond lazer tarama altında non-centrosimetrik tip I kollajen liflerden elde edilen ikinci harmonik nesil (SHG) sinyalleri ek boyama prosedürleri olmadan kolajnöz stromal yapılar sağlar⁹. Daha önce, biz ve diğer gruplar hayvan ve insan kornea görüntüleme için MPM istismar var^{9,10,11,12,13,14,15}.

Belirli hücre popülasyonlarında floresan proteinleri sergileyen transgenik fare hatları, hücre biyolojisi alanında gelişim, doku homeostazları, doku rejenerasyonu ve karsinogenez gibi çeşitli çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Biz kornea^9,,10,saç folikülleri¹⁰ ve epidermis¹⁰ MPM tarafından in vivo görüntüleme için floresan proteinleri ile etiketlenmiş transgenik fare suşları kullanılır. TDTomato ve hücre çekirdeği ile etiketlenmiş hücre zarı ile çift floresan fare suşu iki fare suşlarından üretilir: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sor^tm1Ytchn/J, #021847)¹⁶ ve mT-mG (Gt(ROSA26)^{ACTB-tdTomato-EGFP}, #007676)¹⁷. R26R-GR transgenik fare hattı, Gt (ROSA)26Sor lokusuna yerleştirilen H2B-EGFP füzyon geni ve mCherry-GPI çapa sinyali füzyon geni de dahil olmak üzere çift floresan protein muhabiri yapısı içerir. mT-mG transgenik türü hücre zarı hedefli tdTomato ve EGFP floresan Cre-reporter farelerdir. Cre rekombinasyon dan önce, tdTomato floresan ekspresyonu ile hücre zarı proteini çeşitli hücrelerde yaygın olarak bulunur. Bu transgenik fare suşları, cre uyarma olmadan tdTomato ile çekirdek-EGFP ve membranı görselleştirmemizi sağlar. İki dişi (R26R-GR^+/+) ve bir erkek (mT-mG^+/+) transgenik fare deneyler için yeterli fare üretmek için birlikte yetiştirildi. Bu çalışmada r26R-GR^+/-;mT-mG^+/- genotip, çift floresan fare türü olan yavruları kullanıldı. Daha önce açıklandığı gibi bir floresan muhabir fare hattı ile karşılaştırıldığında^9,10, Bu çift floresan muhabir fare suşu görüntüleme süresi% 50 azaltılmış edinme ile bize sağlar.

Bu çalışmada, görüntüleme platformumuz ve çift floresan transgenik farelerimizi kullanarak oküler yüzeyin in vivo görüntülemesi için ayrıntılı bir teknik protokolü adım adım açıklıyoruz.

Tüm hayvan deneyleri, Ulusal Tayvan Üniversitesi ve Chang Gung Memorial Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan prosedürlere uygun olarak yapılmıştır.

1. Multifoton mikroskopi kurulumu

1. Su daldırma 20x 1.00 NA hedefi(Şekil 1A)ile dik bir mikroskobu temel alan bir sistem oluşturun.
2. Uyarma kaynağı olarak Ti: Safir lazer (dalga boyunda) kullanın. Lazer çıkış dalga boyunu EGFP için 880 nm ve tdTomato için 940 nm olarak ayarlayın (Şekil 1A).
3. SHG/EGFP ve EGFP/tdTomato(Şekil 1A)ayrımı için iki dikroik ayna (495 nm ve 580 nm) ekleyin. Spektronik ayrı SHG sinyalleri, EGFP ve tdTomato bandpass filtreleri 434/17nm, 510/84nm ve 585/40nm(Şekil 1A).
4. Görüntü kalitesini optimize etmek ve fotobeyazrlama ve doku hasarını önlemek için lazer gücünü korneanın görüntülenmesi için yaklaşık 35 mW, limbus için 50 mW olarak ayarlayın. Lazer optik sistemi geçmeden önce lazer gücünü ölçün. Örneklerde tam lazer gücü yaklaşık 8-9 mW'dır. Tam mikroskobik tasarım Şekil 1A'dagösterilmiştir.
   NOT: Lazer gücünün üst sınırı, fotoğraf beyazlatma ve doku hasarını önlemek için 70 mW olarak ayarlanır.

2. Canlı görüntüleme için hayvan hazırlığı

1. Deney için 8-12 haftalık fareler kullanın. Genel anestezi için 50-80 mg/kg kiremitamin HCl ve zolazepam HCl enjekte edin. Bir ayak çimdikleme tarafından çekilme refleks yanıt eksikliği olup olmadığını kontrol edin. Stabil solunum hızı nın izlenmesi için yeterli anestezi önemlidir.
   NOT: 8 haftalık ve üzeri fareler, göz bebekleri olgunlaştığı için önerilir.
2. Fareyi ısıtılmış bir sahnede anestezi altına alın ve sıcaklık izleme probunu anüse yerleştirin.
   DİkKAT: Prob, ısıtıcının aşırı ısınmasını ve sıcak çarpmasının indüksiyonunu önlemek için havaya maruz kalmadan anal kaviteye tam olarak yerleştirilmelidir.

3. Göz yüzeyinin canlı görüntülemesi için göz tutma

1. Oküler yüzeyin canlı görüntülemesi için, iki bölümden oluşan özel olarak tasarlanmış stereotaksik fare tutucuyu kullanın: baş tutucuyu stabilize etmek için bir kafa tutucu ve göz kapaklarını geri çekmek ve tüm oküler yüzeyi ortaya çıkarmak için bir göz tutucu(Şekil 1B-D).
2. Dış işitsel meatus içine kulak çubukları yerleştirin ve baş tutucunun üç noktalı fiksasyon korumak(Şekil 1B,D).
3. Topikal salin% 0.4 oksibuprokain hidroklorür bir çözüm uygulayın ve oküler yüzeyanestezik için 3 dakika bekletin.
4. Göz küresinin uygun manuel göz kapağı geri çekilmesi ile çıkıntılı olduğundan emin olun. Aksi takdirde, iskemi ve göz küresi kanaması oluşabilir.
5. Dikkatle göz kapağı nın polietilen tüp göz kapağı marjı boyunca oküler yüzeyi ortaya çıkarmak için bir döngü yerleştirin. Polietilen tüp(Şekil 1C,D)döngü ile kaplı uçları ile bir No 5 Dumont forceps oluşan göz tutucusu ile göz küresi stabilize.
6. Göz tutucunun distal forceps bir topun kullanarak Vida forceps göz küresi kararlı tutmak için(Şekil 1D).
7. Oküler yüzeyin nemini her saat korumak için kornea yüzeyine 1.338 kırılma indisi ile bir göz jeli uygulayın. Buna ek olarak, görüntüleme sırasında her saat göz jeli düzenli uygulama kornea da bulutlama önlemek.
8. Merkezi korneadan çevre bölgeye tüm kornea yüzeyinde görüntüleme için step motorlu sahnede kilitli tutucu ile göz küresini döndürün(Şekil 1C,D).
   DİkKAT: Göz jeli hem fazla hem de yetersiz miktarda görüntüleme sırasında görüntülerin kalitesini etkileyebilir. Bu nedenle, düzenli olarak yüzeynemli tutmak için her saat göz jeli takviyesi görüntüleme için önemlidir.

4. Z-seri görüntü edinimi

NOT: Bırakma hareketi yapıtlarını azaltmak için her yığındaki ilk ve son slaytı ayarlayın.

1. Görüntüleri çekmeden önce, bir cıva ışık kaynağı ile hedefleme alanı görüntü.
2. Yazılımı açmak için mikroskop yazılımının simgesini tıklatın.
3. Oküler yüzeydeki hücresel yapıyı görselleştirmek için uygun PMT kazancını ve dijital kazancı seçin.
4. Bir yığın elde etmek için ilk slaydı ve son slaydı ayarlayın.
5. Görüntü çözünürlüğü ve z adımı için sayısal değerleri girin, örneğin 512 x 512 ve 1 μm z adımı olarak.
6. Z-seri görüntüleri toplamak için Başlat düğmesine tıklayın.
7. Aynı bölgede iki kez canlı görüntü elde edin, ilki SHG/EGFP sinyalleri için 880 nm uyarma ve EGFP/tdTomato sinyalleri toplama için 940 nm uyarma da ikinci.
   NOT: İki yığının birleşimi 3 kanal görüntüsü sağlar. Görüntü çözünürlüğü ve tbmkün boyutu sırasıyla 512 x 512 piksel ve 157 μm x157 m idi.

5. Görüntü işleme ve 3D rekonstrüksiyon

1. Fiji yazılım¹⁸içine z-seri görüntüleri yükleyin.
2. Arka plan gürültülerini azaltmak için Fiji'deki eklenti Median 3D filtresini seçin.
3. Görüntüleri keskinleştirmek için Fiji'deki Paket Keskinliği Olmayan Maske filtresini seçin.
4. Görüntülerin kalitesini otomatik olarak optimize etmek için parlaklık/kontrast olarak "Otomatik" seçeneğini tıklayın.
5. Z-seri görüntüleri dışa aktarabilmek için görüntüleri görüntü dizileri olarak kaydedin.
6. Z-seri görüntüleri, hacim oluşturma yı kullanarak 3D yeniden yapılandırma için ticari yazılımlara (örn. Avizo lite) yükleyin.
7. Tüm MPM görüntülerinde sırasıyla egfp, tdTomato ve SHG sinyalleri sırasıyla sözde yeşil, kırmızı ve sesiz renktedir.
8. Anlık görüntüye göre 3B yapı resimleri yakalayın.

Bu canlı görüntüleme platformu kullanılarak, fare oküler yüzey hücresel düzeyde görselleştirilmiş olabilir. Oküler yüzeydeki tek hücreleri görselleştirmek için, hücre zarında ifade edilen çekirdek ve tdTomato ile egfp ile çift floresan transgenik fareler kullandık. Kollajen açısından zengin kornea stroma SHG sinyalleri ile vurgulandı.

Kornea epitelinde yüzeyel hücreler, kanat hücreleri ve bazal hücreler(Şekil 2)görselleştirildi. Çift floresan transgenik farelerde, bazal tabakadan hem kornea hem de limbal epiteldeki yüzeysel tabakalara kadar tek hücreharitasınıçıkarabildik ( Şekil 2 ). Altıgen yüzeysel hücreler gözlendi (Şekil 2'debeyaz ok ucu). Hem nükleer boyut hem de bazal tabakadan dış tabakalara doğru nükleer aralıklar kornea epitelinde artmıştır (Şekil 2). TdTomato floresans sitoplazmik sinyalleri, Golgi aparatı, endoplazmik retikulum da dahil olmak üzere membran protein açısından zengin hücre içi vesiküler sistemin kanat hücrelerine dağıldığını göstermiştir(Şekil 2).

Kollajen stroma içinde, stellat şekilli keratositler çift floresan transgenik farelerde membran hedeflemeli tdTomato floresan tarafından özetlenmiştir (Şekil 3 ve Şekil 4'tesarı ok ucu). Kollajen stroma gömülü keratositler daha gevşek endotel hücrelerinden daha aralıklı edildi. Buna ek olarak, kornea stromaince dallanma sinirler de membran hedefleme tdTomato sinyalleri (Şekil 3beyaz ok ucu) ile görselleştirilmiş edildi. Kornea endotel hücrelerinin monotabakası, petekli bir desene bağlı nispeten homojen bir altıgen şekil gösterdi (Şekil 4'tebeyaz ok ucu). Limbal epitel 1-2 epitel hücrelerinin katmanlarından oluşuyordu(Şekil 5). Çift floresan muhabir transgenik fare suşu da konjonktiva içindeki kılcal damarları görüntülememizi sağladı (Şekil 6A). Kılcal damarların 3Boyutlu mimarisi vasküler endotel ana hatlarıyla yeniden inşa edilmiştir (Şekil 6B,6C).

Şekil 1: MPM ve dönen fare tutucunun kurulumu.
(A) MPM'nin kurulumu. (B) Fare tutucunun tasarımı. Fare tutucu, dönen bir kafa tutucu su ve göz tutucudan oluşur. (C) Fare göz tutucunun tasarımı. Göz tutucu kornea ve konjonktiva ortaya çıkarmak için plastik bir döngü ile göz kapakları geri çeker. Baş tutucu ve göz tutucu, oküler yüzeyin hassas ve kontrol edilebilir rotasyonve görüntülemesini sağlamak için sahnede (B) birbirine vidalanır. (D) Göz tutucu ile kornea görüntüleme için canlı fare fotoğrafı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Çift floresan transgenik farelerde kornea epitelinin canlı görüntülemesi.
Kornea epiteli yüzeysel hücreleri, kanat hücreleri ve bazal hücreleri içerecek şekilde katman katman görüntülendi. Yüzeysel hücreler beyaz bir ok ucu ile işaretlenir. Ölçek çubuğu = 50 μm. (Z = epitelüst yüzeyinden derinlik (μm)). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kornea stromasının canlı görüntülemesi.
Kornea stromaiçinde, keratositler (sarı ok ucu) ve sinir lifleri (beyaz ok ucu) kollajen stroma (sözde mavi renkte) gömülüidi. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Orta korneada kornea endotel canlı görüntüleme.
Altıgen kornea endotel hücrelerinin monolayer (beyaz ok başı). Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Limbal epitelin canlı görüntülemesi.
Çift floresan transgenik farelerde limbal epitelcanlı görüntüleri vakuolated çekirdekleri gösterdi. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Canlı görüntüleme ve konjonktivavasküler ağın üç boyutlu rekonstrüksiyonu.
(A) Konjonktiva stromasında kılcal damarlar görselleştirildi. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) Ticari bir yazılım kullanılarak yapılan kılcal ağların 3Boyutlu rekonstrüksiyonu. Ölçek çubuğu = 50 μm. (C,D) Panel b. Floresan vasküler endotel hücrelerinde gösterilen görüntünün büyütülmüş 3D görünümleri kılcal damarları (beyaz ve sarı ok başları) özetledi. C paneli = 6,26 μm ve D paneli için ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.