Method Article

Fare Kornea ve Konjonktiva Canlı Görüntüleme için Özel Multifoton Mikroskop platformu

DOI:

10.3791/60944

⸱

May 17th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, National Taiwan University, 2Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University, 3Molecular Imaging Center, National Taiwan University, 4Department of Dermatology, National Taiwan University Hospital, and College of Medicine, 5Research Center for Developmental Biology and Regenerative Medicine, National Taiwan University, 6Department of Ophthalmology, Chang Gung Memorial Hospital, 7College of Medicine, Chang Gung University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan canlı fare oküler yüzey görüntüleme için bir multifoton mikroskobik platformdur. Floresan transgenik fare hücre çekirdekleri, hücre zarları, sinir lifleri ve oküler yüzey içinde kılcal damarların görüntülenmesi sağlar. Kolaj nasyonal yapılardan elde edilen doğrusal olmayan ikinci harmonik nesil sinyalleri stromal mimariler için etiketsiz görüntüleme sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konvansiyonel histolojik analiz ve hücre kültürü sistemleri in vivo fizyolojik ve patolojik dinamikleri tamamen simüle etmek için yeterli değildir. Multifoton mikroskopi (MPM) in vivo hücresel düzeyde biyomedikal çalışma için en popüler görüntüleme yöntemlerinden biri haline gelmiştir, avantajları yüksek çözünürlük, derin doku penetrasyonu ve minimal fototoksisite içerir. Biz özelleştirilmiş fare göz tutucu ve in vivo oküler yüzey görüntüleme için stereotaksik bir sahne ile bir MPM görüntüleme platformu tasarladık. Çift floresan protein muhabiri fare hücre çekirdekleri görselleştirme sağlar, hücre zarları, sinir lifleri, ve oküler yüzey içinde kılcal damarlar. Multifoton floresan sinyallerine ek olarak, ikinci harmonik nesil (SHG) elde etmek aynı anda kolajnöz stromal mimarinin karakterizasyonuna olanak sağlar. Bu platform kornea ve konjonktiva da dahil olmak üzere tüm oküler yüzey, doğru konumlandırma ile intravital görüntüleme için kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kornea ve konjonktiva da dahil olmak üzere oküler yüzey yapıları, dış bozukluklar diğer derin oküler dokuları korumak. Gözün saydam ön kısmı olan kornea, ışığı göze yönlendirmek için hem kırılma lensi hem de koruyucu bariyer işlevi görür. Kornea epitelkorenin en dış tabakasıdır ve yüzeysel hücrelerin, kanat hücrelerinin ve bazal hücrelerin farklı katmanlarından oluşur. Kornea stroma keratositler ile gömülü sofistike paketlenmiş kolajnöz lamellae oluşur. Kornea endotel, düz altıgen hücrelerin tek bir tabaka, onun pompalama fonksiyonları ile nispeten susuz durumda kornea stroma tutarak kornea şeffaflığını korumak önemli bir role sahiptir1. Limbus....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri, Ulusal Tayvan Üniversitesi ve Chang Gung Memorial Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan prosedürlere uygun olarak yapılmıştır.

1. Multifoton mikroskopi kurulumu

  1. Su daldırma 20x 1.00 NA hedefi(Şekil 1A)ile dik bir mikroskobu temel alan bir sistem oluşturun.
  2. Uyarma kaynağı olarak Ti: Safir lazer (dalga boyunda) kullanın. Lazer çıkış dalga boyunu EGFP için 880 nm ve tdTomato için 940 nm olarak ayarlayın (Şekil 1A).
  3. SHG/EGFP ve EGFP/tdTomato(Şekil 1A)ayrımı için....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu canlı görüntüleme platformu kullanılarak, fare oküler yüzey hücresel düzeyde görselleştirilmiş olabilir. Oküler yüzeydeki tek hücreleri görselleştirmek için, hücre zarında ifade edilen çekirdek ve tdTomato ile egfp ile çift floresan transgenik fareler kullandık. Kollajen açısından zengin kornea stroma SHG sinyalleri ile vurgulandı.

Kornea epitelinde yüzeyel hücreler, kanat hücreleri ve bazal hücreler(Şekil 2)görselleştirildi. Çift floresan transgenik farelerde,.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir kontrol yazılımı ile bu özel inşa MPM görüntüleme platformu fare epitel organlarının intravital görüntüleme için kullanılmıştır, deri dahil10, saç folikülü10 ve göz yüzeyi9,10 (Şekil 1A). Özel olarak üretilen sistem, projemizin başlangıcından bu yana çeşitli deneyler için optik bileşenleri değiştirme esnekliği için kullanılmıştır. Bu görüntüleme metodolojisi ticari MPM ürünleri için.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bilim ve Teknoloji Bakanlığı, Tayvan (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), Ulusal Tayvan Üniversitesi Hastanesi (NTUH108-T17) ve Chang Gung Memorial Hastanesi, Tayvan (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMR3PG1623).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AVIZO Lite yazılımıThermo Fisher BilimselSürüm: 2019.3.0
Bant geçiren filtrelerSemrockFF01-434/17
FF01-500/24
FF01-585/40
Dikroik aynalarSemrockFF495-Di01-25x36
FF580-Di01-25x36
GalvanoThorlabsGVS002
Jade BIO kontrol yazılımıSouthPort ŞirketiYeşim BIO
Oksibuprokain hidroklorürSigmaO0270000
PMTHamamatsuH7422A-40
Poliestiren TüpBECTON DICKINSON427401
Stereotaksik fare tutucuStep Technology Co., Ltd000111
Ti: Safir lazerSpektrumları-FizikMai-Tai DeepSee
Dik mikroskopiOlympusBX51WI
Vidis JelDr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbHD13581
ZoletilVirbacVR-2831

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, Pt 2 101-108 (1989).
  3. Hodges, R. R., Dartt, D. A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiphoton MicroscopyOcular Surface ImagingMouse Cornea ImagingSecond Harmonic GenerationDual Fluorescent ReporterCustom Eye HolderStereotaxic StageZ Serial ImagingFluorescent Protein VisualizationCorneal Stroma Analysis

Related Articles