Zebrabalığı İnternöromast Hücrelerinde Konfokal Mikroskop Tabanlı Lazer Ablasyon ve Rejenerasyon Tonu

Özet

Lazer ablasyon biyolojik sistemlerde rejenerasyon eğitimi için yaygın olarak uygulanan bir teknolojidir. Sunulan protokol, lazer ablasyon için standart bir lazer tarama konfokal mikroskobu ve zebrabalığı lateral hattında ki internöromast hücrelerinin yenilenmesinin daha sonra zaman atlamalı görüntülemesini açıklar.

Özet

Saç hücreleri işitme duyusuna aracılık eden mechanosensory hücrelerdir. Bu hücreler insanlarda hasar sonra yenilenmez, ancak doğal olarak zebra balığı gibi memeli olmayan omurgalılarda yenilenir. Zebra balığı lateral çizgi sistemi duyusal saç hücresi rejenerasyonu karakterize etmek için yararlı bir modeldir. Lateral çizgi nöromastlar denilen saç hücresi içeren organlardan oluşur, internöromast hücrelerinin bir dizi ile birbirine bağlı olan (INMCs). INMCs geliştirme sırasında yeni nöromastlar neden progenitor hücreleri olarak hareket. INMC'ler hücre ölümü yle oluşturulan lateral hat sistemindeki boşlukları onarabilir. İnM'lerde yeşil floresan proteini ifade eden geleneksel lazer taramalı konfokal mikroskop ve transgenik balık kullanılarak selektif INMC ablasyon için bir yöntem tanımlanmıştır. Daha sonra INMC rejenerasyonunun izlenmesi ve boşluk kapatma oranının belirlenmesi için hızlandırılmış mikroskopi kullanılır. Bu, yüksek güçlü darbeli ultraviyole lazer gibi özel ekipman gerektirmeyen hücre ablasyon için erişilebilir bir protokolü temsil eder. Ablasyon protokolü, birçok kullanıcı tarafından zaten kullanılabilen bir araç kümesini çalıştırarak ek hücre türlerinin ablasyonu için yararlı olabileceğinden, daha geniş ilgi alanlarına hizmet edebilir. Bu teknik, inmc rejenerasyonunun farklı koşullar altında ve farklı genetik geçmişlere sahip karakterizasyonunun daha da olanak sağlayacaktır, bu da duyusal progenitor hücre yenilenmesi nin anlaşılmasını sağlayacaktır.

Giriş

En ilerici işitme kaybı özünde duyusal saç hücrelerinin imha yatıyor, hangi sinir uyarıları içine dışsal işitsel uyaranları beyin tarafından tespit transduce. Koklear saç hücresi ölümü kalıcı işitme kaybına neden olur, yetişkin memeliler hasar sonrasında bu hücreleri yeniden yeteneği yoksun olarak. Tersine, zebra balığı gibi memeli olmayan omurgalılar akustik travma veya ototoksik hakaret kayıp saç hücrelerini yenileyebilir. Zebrabalığı mekanosensory lateral line saç hücresi rejenerasyon çalışması için kullanılabilecek basit ve kolay manipüle organ sistemi^1,2,3.

Lateral çizgi nöromastlar denilen küçük duyusal yamalar oluşur, internöromast hücreleri olarak bilinen uzatılmış hücrelerin bir dizi ile geliştirme sırasında bağlı olan (INMCs). Yeni saç hücre içeren organlara yol açan görünür kök hücreler olarak proliferatif kapasitegöz önüne alındığında, INMCs davranışı toplum için büyük ilgi olduğunu^4,5. INMCs ile ilgili araştırmaların çoğu lateral line sinir etrafında sarmak yakındaki Schwann hücreleri tarafından proliferasyon bastırma karakterize dir, Wnt bir inhibitörü ile büyük olasılıkla / β-catenin sinyal. ^6,7,8. INMC proliferasyonunun düzenlenmesi ve yeni nöromastlara farklılaşma iyi tanımlanmış olsa da, ablasyon sonrası INMC'nin yeniden büyümesini yöneten mekanizmalar açıklığa kavuşturulamamıştır. Bu protokol, bireysel INMC'leri ablating ve sonraki rejeneratif davranışlarını analiz bir araç olarak hizmet vermektedir.

Saç hücrelerini yok etmek için çeşitli yöntemler, hücreleri destekleyen, ve tüm nöromastlar, kurtarma izleme metodolojileri ile birlikte yayınlanmıştır. Kimyasal ablasyon saç hücreleri için iyi çalışır, ancak_CuSO gibi toksik kimyasalların dozları 4 önemli ölçüde diğer lateral hat hücre tipleri kaldırmak için artırılmalıdır⁹. Floresan mikroskopi altında elektroablasyon rejenerasyon çalışma INMCs yok etkili ve basit bir araç olmakla birlikte, dar hedef zordur ve bu nedenle, önemli teminat hasar üretmek olasıdır. Sonuç olarak, bu INMC'ye özgü davranışların yönlerini maskeleyebilir^10,11. Lazer ablasyon protokolleri istihdam edilmiştir, ancak mutlaka ortalama laboratuvar veya görüntüleme tesisinde mevcut özel ekipman kullanımını gerektirir (yani, yüksek güçlü darbeli UV lazerler^12). Burada açıklanan yöntem, genellikle DAPI ve diğer mavi floroforların görüntülenmesinde kullanılan ortak 405 nm lazer ile donatılmış herhangi bir lazer tarama lı konfokal mikroskop ile yapılabilir. Bu yöntemin bir avantajı, ek lazer kontrol sistemleri ne olursa olsun veya darbeli lazer ile donatılmış başka bir mikroskoba aktarılmadan hücre hasarından hemen önce ve sonra konfokal görüntüleme nin yapAbilmeleridir.

Benzer bir yöntem zebrabalığı omurilik¹³nörting nöronlar için tarif edilmiştir. Ancak, önceki yöntem hücre ablasyon için bir FRAP modülü gerektirir, bu protokol için bir gereklilik değildir. Ayrıca, farklı hücre tiplerinin farklı özellikleri (yani transgen floresansının parlaklığı, vücut içindeki derinlik ve hücre şekli) göz önüne alındığında, kullanılan hücre tipine bağlı olarak önemli değişikliklere ihtiyaç duyulması olasıdır. Burada ayrıntılı protokol daha yüzeysel hücreler için etkili olması muhtemeldir, aynı yöntemi kullanarak duyusal saç hücresi ablasyon bir gösteri tarafından desteklenen gibi. Ayrıca ablasyon sonrası INMC kurtarma oranlarını değerlendirmek için bir rejenerasyon tofman, yukarıda belirtilen çalışmanın bir özelliği değildi.

Burada ayrıntılı olarak yer alan lazer tabanlı hücre ablasyon protokolü, lazer koşullarının optimizasyonu, ablasyon öncesi ve sonrası görüntüleme ve hızlandırılmış mikroskopi yoluyla INMC'lerin rejeneratif kapasitesini yakalar. Bu unsurlar, INMC'nin yeniden büyümesini ve boşluğu tamamen kapatmayı kapsamlı bir şekilde tasvir etmek için bir araya gelirler. Bu protokol burada INMC'leri yok etmek için kullanılırken, hücresel ablasyonun güvenilir ve etkili bir şekilde değerlendirilmesi gerektiren diğer işlere de uygulanabilir. 405 nm lazer ile donatılmış herhangi bir konfokal mikroskop üzerinde yapılabilir, çünkü aynı zamanda erişilebilir bir teknolojidir.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları Pace Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından 2018-1 protokolü kapsamında onaylandı.

1. Zebra balığı larvalarının hazırlanması

1. Deneyi gerçekleştirmeden 3-5 gün önce, larvaların lazer ablasyon için monte edildiğinde 4 yaş ait 4 dpf yaşa kadar 2 gün döllenme sonrası (dpf) olacak şekilde uzlaşın.
   NOT: Et(krt4:EGFP)sqEt20 (ET20 olarak kısaltılır) artırıcı tuzak hattı, hangi internöromast hücreleri açıkça gelişmiş yeşil floresan protein (eGFP) ile etiketlenir, nispeten kolay hücre tanımlama ve ablasyon^{sağlar 11,14}. Lazer ablasyon özgüllüğü ve esnekliğinin teyidi için ET20 balıkları, lateral çizgi sinirinin kırmızı floresan proteinle etiketlendiği Tg (neuroD:tdTomato)balıkveya GFP^15,16ile duyusal saç hücrelerini etiketlemek için Tg (myo6b:βactin-GFP) ile yetiştirilir.
2. Ertesi gün embriyo tokarta alındıktan sonra embriyoları E3'te 28.5 °C'de %0.0001 metilen mavisi içeren kuluçkaya yatırın ve anesteziye hazır hale gelene kadar yerleştirin.

2. Düşük jelling agarose ve triain çözeltilerinin hazırlanması

1. 250 mL cam Erlenmeyer şişesine 48 mL 1x E3 orta, 2 mL 15 mM trikotine stok çözeltisi ve 0,5 g düşük eriyen agarose ekleyin.
2. Mikrodalga 30 s ve girdap (ısı koruyucu eldiven giyen) agarose çözmek için yüksek çözüm. Agarose tamamen eriyene kadar 30 s ısıtma döngülerini tekrarlayın.
3. Agarose'u kullanıma hazır olana kadar 42 °C'ye ısıtılan bir kuvözde saklayın.

3. Zebra balığı larvalarının anestezisi

1. 50 mL konik bir tüpe 24 mL 1x E3 orta ve 1 mL trikal stok çözeltisi (15 mM) ilave edin ve 600 μM'lik son konsantrasyonu karıştırın.
2. 600 μM triain içeren 8 mL E3 ile düz dipli hücre kültür plakasının altı kuyudan birini yükleyin.
3. Zebrabalığı larvalarını 74 μm mesh dipli aktarım ucuna taşımak için transfer pipetini kullanın.
4. Mesh dipli kesici ucu E3 + tricaine çözeltisi içeren altı kuyulu plakanın kuyusu içine aktarın. Larvaların en az 3 dakika veya tamamen anestezi yapılana kadar kuyuda kalmasına izin verin. Kesici uça dokunarak anesteziyi test edin. Larvalar musluğa karşılık olarak ürkmemeli ve yüzmemelidir.

4. Anestezik zebra balığı larvalarının floresan taraması

1. Pipet bir iyi başına anestezi larva üzerine 12 iyi hidrofobik kaplı slaytlar tarama için. Tarama yaparken optik bozulmayı azaltmak için kaydıranın her bir kuyusunda oluşan menisküseğrisinin minimum eğrilik olduğundan emin olun. Bu larva yerleştirdikten sonra her kuyudan E3 küçük bir hacim kaldırarak yapılabilir.
2. Dik bir mikroskop üzerinde 10x hedefi altında (cıva ark lambası ile donatılmış, metal-halide lamba, veya LED ışık kaynağı ve uygun bir filtre küpü), nöromastlar ve lateral hat sisteminin internöromast hücreleri eGFP ifade larvalar için ekran.
   1. Muhtemelen transjen için homozigot olan daha parlak eGFP ile sonuçlanan daha güçlü ifade ye sahip larvaları seçin.
      NOT: ET20 hattında, eGFP her nöromast çevreleyen manto hücrelerinin bir halka yanı sıra bu organları bağlayan internöromast hücrelerinin dar şerit ifade edilir. Daha güçlü eGFP ekspresyonu (daha parlak floresan) daha etkili ablasyona katkıda bulunur.
   2. Ablasyonun özgüllüğünü incelemek için ET20 ve Tg(nöroD:tdTomato) transgenleri ile çift transgenik larva kullanın. Tg(neuroD:tdTomato) taşıyıcıları için tarama varsa, arka lateral çizgi ganglion temsil eden kulak sadece posterior parlak kırmızı bir yama tanımlamak için RFP filtre küpü seti kullanın.
   3. Lateral line nöromastlarda saç hücrelerini ablate için, her nöromast merkezinde GFP lokalizasyonu için Tg (myo6b:βactin-GFP) transgenik çizgi ve ekran kullanın.
3. Nöromastların basmakalıp aralıkları ile larva seçin. Nöromastlar arasındaki aralıktaki farklılıklar gelişim sırasında anormal nöromast birikimini gösterebilir, lateral hat primordium¹⁷kusurlu göç davranışı veya hücre çoğalması düşündürmektedir. Bu tür kusurlar ablasyon sonrası INMC'lerin göçmen veya rejeneratif davranışını da etkileyebilir.
   NOT: Aralıktaki yaygın kusurlar arasında, ilk göç eden primordium (prim1L1) tarafından yatırılan anterior-en nöromast ile aynı primordium (prim1L2) tarafından yatırılan ikinci nöromast arasındaki alışılmadık derecede büyük bir mesafe yer almakta olup, genellikle daha arka nöromastların kalabalıkla ilişkili olduğu görülür.

5. Lazer ablasyon ve görüntüleme için larva montajı

1. Pipet 3 - 4 anesteziedilmiş larva, kapak lı dipli çanak (14 mm numara 1,5 kapaklı 35 mm çanak) ortasında E3/tricaine çözeltisi küçük bir damlacık içine. Larvalar küçük bir damlacık kalır, sadece onları içerecek kadar büyük böylece aşırı çözelti kaldırın.
2. Yemeği dürbün stereo mikroskobu aşamasına aktarın ve tüm larvaların görüş alanında olması için zum ve odağı manipüle edin.
3. Isıtmalı kuvözden düşük erime noktası agarose içeren Erlenmeyer şişesini çıkarın. Agarose çözeltisini kapak slaytına aktarmak ve ince bir tabaka oluşturmak için transfer pipetini kullanın. Sıvı sadece çanak altındaki kuyu doldurur kadar aşırı agarose çekin, herhangi bir larva aspire değil dikkat.
4. Hızlı bir saç bıçağı veya saç döngüsü kullanarak agarose çözeltisi larvaları düzenlemek böylece birbirleri ile hizalanmış ve sola rostral ile yönlendirilir.
5. Larvaları saç bıçağıyla cama doğru hafifçe bastırın, sağ tarafları aşağıda olacak şekilde. Larvalar 3 dpf daha büyük onların şişirilmiş yüzme mesaneleri nedeniyle yüzen eğilimindedir, bu yüzden agarose jel başlayana kadar tekrar tekrar cama karşı bastırılması gerekebilir.
6. Yaklaşık 60 s sonra agarose katılaşmaya başlayacak ve larvalar yeniden yönlendirilemeyecek. Kapak taki agarose'un tamamen katılaşması için oda sıcaklığında yaklaşık 5 dakika bekleyin. Agarose katıladıktan sonra, 1x tricaine içeren E3 ile yemeği yarı yarıya doldurmak için bir transfer pipet kullanın.

6. Prospektif hedeflerin ve ablasyon öncesi görüntülemenin bulunması

1. Lazer tarama lı konfokal mikroskopi sisteminin gücünü açın ve entegre görüntüleme yazılımı aracılığıyla başlangıç. 63x Plan-Apochromat yağ daldırma hedefi (sayısal diyafram 1.40) veya benzeri seçin. Daldırma yağı uygulayın ve dairesel bir aşamada çanak güvenli gibi sola onların rostral yönü ile larva yüz.
2. Parlak alan veya diferansiyel girişim kontrast aydınlatması altında, görüntüleme için monte edilmiş larvalardan birini seçin. Odak noktasını, kapak kaymasına en yakın balığın tarafındaki derinin, periderm hücrelerinin parmak izi benzeri deseni yle tanınabilen odaknoktası olacak şekilde ayarlayın.
3. Odaklandıktan sonra, GFP kanalında epifloresan aydınlatmaya geçin. Yatay miyoseptum boyunca GFP ifadesi ile posterior lateral çizgiyi bulun. Floresan hücrelerin halkaları nöromast manto hücrelerini gösterir, ve hücrelerin uzamış iplikçikleri internöromast hücreleridir.
4. PrimIL1 nöromast ile başlayarak, genellikle sarısı sadece dorsal bulunan, yatay miyoseptum boyunca caudally caudally tmak için sahne kontrol joystick veya diğer sahne hareketi kontrolü kullanın.
   1. PrimIL3 ve primIL4 (L3 ve L4) nöromastlar arasındaki bölgeye ulaşana kadar internöromast hücrelerinin dizeizleyin(Şekil 1A).
      NOT: Diğer bölgeler de hedeflenebilir, ancak gövde ve kuyruğun bu bölümü kapak camına en yakın olma eğilimindedir ve bu nedenle ablasyona en uygun olan da görülür.
   2. Birkaç larva görüntülenin, ilk aşama konumunu ayarlayın ve ardından uygun onay kutusunu seçerek birden çok aşamalı konum seçeneğini devre dışı bırakın.
   3. Adımları 6.4.1-6.4.2'yi yineleyin. istenilen her sahne pozisyonu (her larva) için.
5. L3-L4 bölgesindeki hücre gövdeleri tanımlandıktan sonra, edinme moduna geçin.
   1. 488 nm veya 491 nm lazerkullanarak bir GFP görüntüleme parçasını etkinleştirin.
   2. "Imaging Setup" açılır menü altında T-PMT onay kutusunu etkinleştirerek aktif 488 nm lazer izine iletilen bir ışık (iletilen ışık fotoçarpan tüpü veya T-PMT) kanalı ekleyin.
   3. Lazer gücünü %6'ya, iğne deliği boyutunu 1 Havadar ünite eşdeğerine ve dijital kazancı 750'ye, görüntüleme ET20 larvalarına ayarlayın. Tam kazanç ve lazer gücü herhangi bir larva için değişebilir, onlar monte kapak kayma ne kadar yakın ve floresan parlaklığı bağlı olarak. Hücre organları aksi loş projeksiyonlar ve filipodia yakalamak için doymuş olduğu gibi kazanç ayarlayın.
   4. Parametreleri 1024 piksel x 1024 piksel kare boyutuna, 0,7 dijital yakınlaştırmaya (145,2 μm x 145,2 m görüntü boyutu) ayarlayın. Görüntü kalitesini artırmak için ortalama 2'ye ayarlayın.
6. z-pozisyon açılır menüsünü getirmek için z yığını kutusunu işaretleyin. Hızlı tarama sırasında, internöromast hücreleri sadece odak dışında olana kadar dışarı odaklanın. İlk dilimi ayarlayın, sonra internöromast hücreleri bir kez daha odak dışında olana kadar örnek aracılığıyla odak. Son dilimi ayarlayın. Yaklaşık 25 μm'lik bir z destesini kapsadığından emin olun. Görüntüleme aralığını 1 μm olarak ayarlayın.
7. Ablasyon öncesi z yığınını yakalamak için denemeyi başlatın (Şekil 1B). Sahne konumları eklendiyse, yalnızca geçerli konumun görüntülenebilmeleri için konumseçeneğini etkinleştirin. Yakalandıktan sonra dosyayı kaydedin.

7. Hücre organlarının lazer ablasyon

1. "Tüm Araçları Göster" üzerine tıklayın. Bu seçenek, edinme arabiriminin üst kısmında yer alır.
2. "Görüntüleme Kurulumu" için açılan menüye tıklayın. "Imaging Set up"'da , "Yeni parça ekle" ("+"olarak temsil edilir) üzerine tıklayın.
3. "Imaging Set Up"da "Boya" için açılan menüye tıklayın. Boya olarak DAPI'yi seçin.
4. "Kanallar" için açılan menüyü tıklatın ve ilgili onay kutularını tıklatarak diğer tüm parçaların select'ini kaldırın. Yalnızca DAPI parçasının seçildiğinden emin olun.
5. DAPI pistinde , "Lazer ayarı" için 405'e tıklayın. Lazer gücünü %75'e yükseltin. Ablasyon için aday hücre gövdelerini tararken lazeri kapatmak için DAPI kanalına tıklamayı açın.
6. Görüş alanında ortalanmış bir internöromast hücresinin gövdesi ile tarama çerçevesini 20x-22x'e yakınlaştırın. Yakınlaştırma uygulandığında, hücre gövdesini merkezde tutmak için çerçeve konumunun ayarlanması gerekebilir. Hücre gövdesi görüş alanını doldurur doldurmaz canlı taramayı durdurun.
   NOT: Hücre gövdesi tüm görüş alanını kaplamalıdır. Bu zum düzeyinde, GFP hızla ağartAcaktır. Hızlı çalışarak lazer maruz kalma süresini en aza indirin. Küçük bir alan üzerinde lazer güç dağılımını artırmak için ilgi alanı seçmek yerine yakınlaştırma kullanın.
7. Parçayı etkinleştirmek için 405 nm lazer deklanşör kutusunu kontrol edin. Lazer gücünü %75'e ayarlayın. 45 s için bir zamanlayıcı ayarlayın. Sürekli taramayı etkinleştirin ve zamanlayıcıyı çalıştırın. 45 s'de taramayı hemen durdurun.

8. Rejenerasyon uyrusasyonunu incelemek için ablasyon sonrası görüntüleme ve hızlandırılmış mikroskopi

1. "Kanallar" için açılan menüye tıklayın. Kanallarda, ablasyon lazerini etkinleştirmek için "DAPI" parçasına tıklamayı açın. "Edinme modu" için açılır menüye tıklayın.
2. Satın alma modunda "Yakınlaştırma"'a tıklayın.
3. Kaydırıcıyı kullanarak veya "0,7"yazarak yakınlaştırmayı 0,7'ye düşürün.
   1. Başarılı hücre ablasyonunu sağlamak için kazancı 900'e yükseltin ve görüş alanını hızlı bir şekilde tarayıp tartışın.
      NOT: Hedeflenen hücre veya hücrelerde GFP görünmemelidir. Floresan hala gözlenirse, 7.1-7.3 adımlarına geri dönün.
   2. Ablasyon öncesi görüntüleme için açıklananlarla aynı veya benzer ayarları kullanarak, ablasyon sonrası görüntüyü yakalayın ve kaydedin(Şekil 1C). Görüntü floresan hücrelerin kalıntıları veya kaldırılması gereken ek hücre organları nın kalıntılarını ortaya çıkarırsa, internöromast hücrelerinin dizesinde görünür bir boşluk oluşturmak için lazer ablasyon adımlarını tekrarlayın.
   3. Hücresel hasarı daha fazla doğrulamak için T-PMT kanal görüntüsünü inceleyin. Hasarlı hücreler tanecikli bir görünüme sahip olacak ve sık sık çekirdekler şişecek veya şekil düzensiz hale gelecektir(Şekil 2).
4. Ablasyon öncesi bir görüntü yakaladıktan, hücreleri gerektiği gibi azarladıktan ve her bir sahne pozisyonu için ablasyon sonrası görüntü yakaladıktan sonra, görüntü yakalama için hem sahne konumunu hem de zaman seçeneklerini etkinleştirerek hızlandırılmış mikroskobu ayarlayın. Zaman parametrelerini 24 saat veya istenen başka bir bitiş noktası ve 15 dk aralıklarla ayarlayın. Resim elde etmek için denemeyi başlatın ve tamamlandığında (ertesi gün) ortaya çıkan dosyayı kaydedin.
5. Larvalar daha fazla çalışılacak veya yükseltilecekse, ince forsepsler kullanarak agarose'dan dikkatlice çıkarın, sonra iyileşmek için trikalin olmadan E3 ortamına aktarın. Daha fazla kullanılmaması halinde, onaylanan hayvan protokolüne göre ötenazi yapmak (buz banyosuna hızlı ve sürekli daldırma yaygın bir yöntemdir) ve kurumun gerektirdiği şekilde bertaraf etmek.

9. Görüntü analizi

1. Tercih edilen görüntü işleme yazılımında(Malzeme Tablosu)ablasyon sonrası z yığını dosyasını açın. Kanalları, her kanalın ayrı bir görüntüleme bölmesinde olacak şekilde bölün.
2. GFP kanal penceresinde, kalan INMC'lerin uçları arasında düz bir çizgi çizmek için çizgi aracını kullanın. Bu, z yığını boyunca yukarı ve aşağı kaydırma veya çizgi çizim önce maksimum yoğunluklu projeksiyon gerçekleştirerek yardımcı olabilir.
3. X- ve y-düzlemlerinde INMC uçları arasındaki mesafeyi elde etmek için "Ölçü" aracını kullanın.
4. Z düzlemindeki INMC'ler arasındaki mesafeyi belirlemek için orijinal z yığınındaki z dilimleri arasında ilerleyin.
5. Pisagor teoremi (a 2 + b² = c²⁾ kullanarak INMC uçları arasındaki toplam mesafeyi hesaplayın. Hipotenüs toplam mesafedir (veya boşluk boyutu).
6. Veri analizi için bir elektronik tablo uygulamasına elde edilen mesafe ölçümlerini girin.
7. 8.2-8.3 adımlarında toplanan hızlandırılmış mikroskopi dosyalarını konfokal sistemdeki entegre görüntüleme yazılımını veya serbestçe kullanılabilen görüntü analiz yazılımını kullanarak gözden geçirin. İnternöromast hücreleri arasındaki boşluğun hücre projeksiyonları ile doldurulduğu zaman noktasını belirleyin. Bu, tüm boyutlardaki boşluğun kapatılmasını onaylamak için birden fazla z diliminin incelenmesi ile desteklenebilir.
8. Boşluk kapatma zamanının en doğru ölçümunu elde etmek için, ablasyon sonrası görüntü zaman damgasını (Finder veya File Explorer'da görünür) sıfır zaman noktası olarak kullanın; zaman atlamalı görüntü yığınının başlangıcından itibaren ölçüm süresi, ek sahne pozisyonları, vb ablating sırasında ne kadar zaman geçti bağlı olarak, kapatma için zaman hafife neden olabilir.
9. Orijinal boşluk boyutunu (μm) tam boşluk kapatma için gereken saat veya dakikaya bölerek kapatma oranını türetin.

Sonuçlar

INMC'leri ablate ve kayıt rejenerasyonu için, ET20 transgenik hattın gfp ifade eden zebra balığı larvaları adım 5.4'te açıklandığı gibi döllenme sonrası 2 veya 3 gün sonra monte edildi. Birden fazla zaman atlamaları tek bir deneyde yakalanabilir, böylece birkaç balık aynı anda monte edilebilir. PrimIL3 ve primIL4 nöromastlar arasında yer alan lateral çizginin bölgesi tespit edildi ve 6.5-6.7(Şekil 1A,B)adımlarında açıklandığı gibi ablasyon öncesi görüntüler yakalandı.

Lazer ablasyon için üç hücre gövdesi hedeflenince INMC dizesinde yaklaşık 40 μm'lik bir boşluk oluşturdu. Yüksek kazanç ve sonraki görüntüleme ile ablasyon sonrası tarama, komşu INMC'lerin uzatılmış projeksiyonları arasında boşluk bırakarak, ablated bölgede hiçbir hücre gövdesi kaldığını doğruladı(Şekil 1C). Hücre ölümü ablasyon sonrası T-PMT kanalı incelenerek daha da gösterilmiştir. Hasarlı ve ölmekte olan hücreler şişmiş ve düzensiz şekilli çekirdeklerin yanı sıra taneli görünümle işaretlenmiştir(Şekil 2,özetlenmiştir). Bazı durumlarda, hızlandırılmış görüntüleme de büyük amipoid hücrelerin işe muhtemel makrofajlar(Şekil 2, yıldız) olduğunu ortaya koymuştur. Ablated INMCs çevreleyen karanlık alanlarda üstteki periderm hücrelerinde fotobeyazrlama gösterdi. Bu deneylerde lazer ışınlama ile bu hücreler zarar görmüş veya yok görünmüyordu; bunun yerine, floresanları geçici olarak azaltıldı. Hızlandırılmış mikroskopi, bu hücrelerin normalde ablasyon dan sonra iyileştiğini ve şekil değiştirmediğini veya başka bir şekilde hasarlı görünmediğini ortaya koymaktadır (yayınlanmamış sonuçlar, Volpe vd.).

INMC yıkımının özgüllüğünü desteklemek için, ablasyonlar çift transgenik ET20 ve Tg (nörod:tdTomato) larvalarında yapıldı ve lateral line sinir (internöromast hücrelerinin altında sadece mikronlar ile çalışan) kırmızı floresan protein ile etiketlendi. INMC dizesinde büyük boşluklar yaratan çeşitli hücrelerin ablasyonlarının kırmızı floresan dayalı lateral çizgi siniri üzerinde çok az veya hiç etkisi yoktur(Şekil 3). Yüzeysel lokalize hücreleri ablating için tekniğin esnekliği lateral çizginöromasts içinde bireysel duyusal saç hücrelerinin seçici imha ile gösterilmiştir. Yukarıda ayrıntılı olarak açıklanan aynı protokol (bölüm 7 ve 8), transgenik Tg(myo6b:βactin-GFP) larvalarında tek saç hücreleri komşu hücrelere belirgin bir zarar vermeden tahrip edildi(Şekil 4). Ablated saç hücreleri zaman atlamalı mikroskopsonrası floresan kurtarmadı, ve çekirdekleri belirgin granüler ve lazer maruziyeti sonrası şekilsiz edildi(Şekil 4B). INMC ablasyonlarına benzer şekilde, görünür makrofajlar sıklıkla lazer maruziyet bölgesine alındı (yayınlanmamış sonuçlar, Volpe vd.).

Lazer ablasyon ve ablasyon sonrası görüntü yakalama sonrasında, boşluk boyutu serbestçe kullanılabilir görüntü analizi yazılımı kullanılarak ölçüldü. Ölçüm aracı, tek tek INMC'lerin genişliğine ve ablasyon için kaç hücre nin seçildiğine bağlı olarak, sadece birkaç mikrondan 100 mikrona kadar değişen boşluk boyutlarını göstermiştir(Şekil 5). Rejenerasyon sırasında INMC davranışlarını kaydetmek için timelapse mikroskobu kullanıldı. 50 denemede, 15 boşluk (0) 24 saat içinde rejenerasyon ile kapatılmıştır. Çoğu durumda, kurtarma başardık INMCs görüntüleme ilk birkaç saat içinde bunu yaptı. Kurtarma, komşu hücrelerden gelen projeksiyonların temas ettiği ve ablasyondan sonra yaklaşık 40 μm'lik bir boşluk için 16 saat olarak meydana gelen zaman noktası olarak tanımlanmıştır(Film 1). Z-yığınları, hücre-hücre temasının tek bir z düzlemi içinde meydana geldiğinden emin olmak için dikkatle incelenmiş ve z-projeksiyonları nedeniyle olası yapılardan kaçınılmalıdır. Lojistik regresyon analizi, boşluk kapatma olasılığının boşluk büyüklüğüyle (p = 0,0453) ilişkili olduğunu ve daha küçük boşlukların iyileşme olasılığının daha yüksek olduğunu ortaya koymuştur. 55,5 μm'lik bir boşluk P'lik bir kapanış olasılığı ortaya çıktı(Şekil 5).

Vakaların p'inde, INMC'ler ablasyonun yarattığı boşluğu tamamen kapatamadılar. Ancak, bu gibi durumlarda bile komşu INMCs uzun projeksiyonların oluşumunu izlemek başardık, hangi nöronal büyüme konileri uzanan bazı açılardan benzer(Film 2). Böylece, bu deneyler de hasar sonrası INMCs davranışları hakkında fikir sağlayabilir.

Şekil 1: Lazer ışınlama ile internöromast hücrelerinin selektif ablasyon. (A) Nöromastlar primIL3 ve primIL4 arasındaki internöromast hücreleri ablasyon için seçildi. Bu hücreler, bitişik hücre gövdeleri örtüşen uzun projeksiyonlar ile karakteristik bir mil şekli görüntüler. (B) Ablasyon öncesi görüntüleme, bir boşluk oluşturmak için ablated olabilir hücre organları tespit. (C) Ablasyon sonrası görüntüleme, boşluk bölgesinde hücre cisimlerinin yokluğunda belirtildiği gibi başarılı ablasyon doğrular. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Ablasyon sonrası görüntüleme gfp etiketli internöromast hücrelerinde lazer maruziyetine yanıt olarak hücre ölümünü göstermektedir. Aktarılan ışık fotoçarpan görüntüleme (T-PMT) granüler görünüme sahip bir nekrotik hücrenin varlığını gösterir (çevrelenmiş) yanı sıra büyük olasılıkla makrofajlar düzensiz şekilli hücrelerin işe (*). GFP ve T-PMT kanallarının birleştirilmesi, hücre ölümü ve makrofaj aktivitesinin ablasyon yerinde meydana geldiğini doğrular. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: İnternöromast ablasyonözgülüğü. (A)Çift transgenik Tg(ET20) içinde pre-ablasyon GFP etiketli internöromast hücreleri (yeşil) ve tdTomato etiketli lateral line sinir (kırmızı); NöroD:tdTomato) larva. Lateral hat sinirine yakın olan hücre organları ablasyon için hedef alındı. (B) Ablasyon sonrası görüntüleme, lateral line siniri bozulmamış hedefli hücre organlarının ablasyonunu göstermektedir. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Konfokal mikroskopi ile duyusal saç hücrelerinin ablasyon. (A) Ablasyon öncesi görüntüleme, çift transgenik Tg(ET20; myo6b:βactin-GFP) zebra balığında ablasyon için hedeflenen gfp etiketli duyusal saç hücresi (*) saptandı. İletilen ışık fotoçarpan tüpü (T-PMT) görüntüleme, yuvarlak bir kesitile normal saç hücresi morfolojisini açıklar. (B) Ablasyon sonrası görüntüleme, hedeflenen saç hücresinin başarılı ablasyonunu doğrular. T-PMT görüntüsü, saç hücresi şeklindedüzensizlik ve lazer maruziyetinden sonra granüleritliğin arttığını gösterir, bu da fotobeyazrlama yerine hücre ölümünü düşündürür. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Lojistik regresyon boşluk genişliğinin bir fonksiyonu olarak boşluk kapatma olasılığını (μm içinde) modeller. 0'lık bir puan tam boşluk kapatmayı temsil ederken, 1 puan eksik boşluğun kapatılmasını temsil eder. Sonuçlar, boşluk genişliğinin internöromast hücrelerinin ilgili boşlukları kapatma yeteneği üzerindeki etkisinin istatistiksel olarak anlamlı olduğunu göstermektedir (p = 0.0453, n = 24 toplam; n = 12 kapalı boşluklar, n = 12 eksik kapalı boşluklar). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Film 1: 16 saat sonra boşluk kapatma (~40 μm) gösteren hızlandırılmış mikroskopi. Görüntüler her 15 dakikada bir çekildi ve tüm zaman dilimleri için maksimum yoğunluklu z-projeksiyonu yapıldı. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Film 2: Kapanmayan bir INMC açığının hızlandırılmış mikroskopisi. Kalan INMC'lerin uzatılmış ve dallanmış projeksiyonları gösterilir. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Protokol, yakın ultraviyole lazer (405 nm dalga boyu) ile donatılmış herhangi bir konfokal mikroskobun üzerinde yapIlebilen lazer hücre ablasyon için çok yönlü bir yöntemi açıklamaktadır. Bu protokol, elektroablasyon (daha yaygın hasara neden olan¹¹⁾ve darbeli UV-lazer ablasyon (ek özel ekipman¹²gerektirir) gibi daha önce kullanılan yöntemlerin sınırlamalarını gideriyor. Ablasyon öncesi ve sonrası konfokal görüntüleme, deneyin başarısı ile ilgili hızlı geri bildirim sağlar. Sonraki hızlandırılmış mikroskopi duyusal sistem gelişimi için kritik bir hücre tipinde rejenerasyon için basit bir tarar sunuyor.

Nöromastlarda ve INMC'lerde GFP'yi güçlü bir şekilde ifade eden transgenik zebra balıklarının ön ekran alabilmeleri hayati önem taşımaktadır. Parlak floresan ve primI kaynaklı nöromastların yaklaşık olarak eşit aralıklı larvaları lazer ablasyon için ideal adaylardır. Bu balıklarda bile, ilk tespitten kaçabilecek dimmer INMC'ler vardır. Bu hücreler lazer ablasyon dan sonra geride kalabilir, INMC'ler arasında gerçek bir boşluk oluşumunu engelleyerek. Dijital kazanç, 405 nm lazer (adım 8.2) ile de hedeflenebilir şekilde ablasyon öncesi görüntüleme sırasında bu dimmer hücreleri ortaya çıkarmak için ayarlanmalıdır.

Benzer şekilde, lazer hedefleme bazen tamamen bir hücre yok olmaz; bunun yerine, gerçek bir boşluk oluşturmak için bir başarısızlık ile sonuçlanan, floresan ağartmak olacaktır. Bu hücreler genellikle timelapse mikroskopi sırasında floresan artacaktır. T-PMT görüntüleme(Şekil 2)ile birlikte ablasyon sonrası görüntüleme adımında kazanım ayarlaması, hedeflenen tüm hücrelerin etkin bir şekilde çıkarılmasını sağlamaya yardımcı olur. INMC dizesinde bir boşluk oluşturmak için sık sık iki veya üç ayrı hücre ablasyonları gerektirir. Hücre ölümü, hedeflenen hücrelerde kanama veya tanecikgörünümü ile saptamak olabilir; rağmen, bu lazer hedefleme sonra kısa bir bekleme süresi gerektirebilir (ve bazı durumlarda, belirgin apoptotik veya nekrotik rakamlar kısa bir süre sonra gözlenir).

Bu prosedürün bir sınırlama lazer koşulları optimize edilmeden ve INMC rejenerasyon başarılı önce birden fazla deneysel çalışmalar gerektirebilir olmasıdır. Lazer gücü ve lazerin toplam çalışma süresi, her biri farklı numuneler için hafif bir ayarlama gerektirebilir. Bu aşırı lazer uygulaması kendini onarmak için lateral hattın yeteneğini bozabilir bulunmuştur. Bu hem içerir 1) lazer ışınlama için bireysel hücrelerin aşırı pozlama, muhtemelen çevre dokulara ek hasara neden, yanı sıra 2) dize çok fazla hücre ablasyon, daha büyük bir boşluk yol açan. Kullanıcılar, yıkımlarını sağlamak için yeterli derecede ışınlanan hücreler arasında bir denge sağlamalıdır ve hücreleri aşırı maruz bırakmamalıdır, bu da yenilenmeyi yavaşlatabilir veya önleyebilir. Uygun ayarlarla, INMC'lerin arka lateral line sinirde gözle görülür bir hasar olmadan çıkarılabildiği tespit edilmiştir, bu da elektroablasyonun aksine bu protokol ile ikincil hasarın en aza indirildiğini gösterir¹¹. Hiçbir durumda gözlenen boşluk ta yeni nöromastlar oluşan vardı, muhtemelen lateral çizgi sinir bozulmadan kalır ve altta yatan glial hücreler kalır ve INMCs yayılmasını inhibe çünkü^6,7,8,11.

Bu konfokal lazer ablasyon yönteminin diğer hücre tiplerine de uygulanabileceği gösterilmiştir, özellikle de duyusal saç hücreleri de dahil olmak üzere hayvanın içinde yüzeysel olarak bulunanlarda(Şekil 4). Benzer bir protokol daha önce açıklandığı gibi, yara onarım veya aksonal rejenerasyon çalışmaları için nöronlar incelemek için cilt hücreleri ablate için kullanılabilir¹³. Bu tekniğin konfokal mikroskoba sahip ancak lazer ablasyon için başka özel ekipman alabilen laboratuvarların deneysel repertoisine yararlı bir katkı olacağı tahmin edilmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
12 kuyulu PTFE Baskılı Slaytlar	Elektron Mikroskobu Bilimleri	63425-05
15 mM Trikain stok çözeltisi	Sigma	E10521	15 mM Trikain ters ozmoz suyunda
1X E3 + 600 &mikro; M Trikain			15 mM Trikain stoğunu 25X 1X E3 ortamında
seyreltin 1X E3 ortamı			60X E3 ortamını ters ozmoz suyunda (16,7 ml/L) 1X'e seyreltin60
X E3 ortamı	Sigma-Aldrich'ten		34,4 g Nacl, 1,52 g Kcl, 5,8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4< / sub>.7H2< / sub>0 1 litre ters ozmoz suda
Bx60 Cıva ark lambalı floresan bileşik mikroskop	405
LSM 700 konfokal mikroskop	Carl Zeiss Microscopy, LLC		Ablasyon için 5 mW 405 nm lazer kullanıldı; Ablasyonlar ve görüntüleme, 1.40 FIJI/ImageJ NA ile 63x Plan-Apochromat objektif aracılığıyla gerçekleştirildi
Görüntü işleme yazılımı	Birden fazla katkıda bulunan:		https://fiji.sc/ adresinden indirilebilir
Saç bıçağına modifiye edilmiş diseksiyon iğnesi	Fisher Scientific	19010	Ahşap saplı bir diseksiyon iğnesinin ucuna bir kirpik yapıştırıldı
Microsoft Excel yazılımı	Microsoft Corp.		Google sayfaları, Microsoft Excel'e ücretsiz bir alternatiftir
Cam tabanlı 35 mm tabaklar, 1.5 no'lu lamel, 20 mm pencere	Mattek Corporation	P35G-1.5-20-C	35 mm petri kabı, 20 mm cam pencere
Immersol 518F Daldırma Yağı	Fisher Scientific	12-624-66A
Düşük Jelleşen Agaroz	Sigma Yaşam Bilimleri	A9414-256
74 um Polyester Fileli Corning Netwell Uç, 24 mm Uç	Millipore Sigma	CLS3479-48EA
Rstudio yazılımı	Rstudio PBC		https://rstudio.com/
SMX-168-BL Stereo mikroskop	Motic
Transfer Pipeti	Fisher Scientific	13-711-7M
ZEN yazılımı	Carl Zeiss Microscopy, LLC