Yöntem makalesi

Proteomik Tesis Gönderimi ve Müteakip Veri Analizi için TMT Örnek Hazırlama

DOI:

10.3791/60970

⸱

8 Haziran 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of Florida

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıdaki adımların her biri için ayrıntılı bilgi içeren optimize edilmiş bir tandem kütle etiketi (TMT) etiketleme protokolü salıyoruz: protein ekstraksiyonu, nicelikselleştirme, yağış, sindirim, etiketleme, proteomik bir tesise teslim ve veri analizleri.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteomik teknolojiler, bir hastalığın, tedavinin veya diğer durumun bir bütün olarak proteom üzerindeki etkisinin küresel bir görünümünü sağlayarak biyolojik sistemlerdeki etki mekanizmalarını anlamamıza yardımcı olabilecek güçlü metodolojilerdir. Bu rapor, protein örneklerinin ayıklanması, niceleme, yağış, sindirim, etiketleme ve sonraki veri analizi için ayrıntılı bir protokol sağlar. Optimize edilmiş TMT etiketleme protokolümüz daha düşük etiket konsantrasyonu gerektirir ve sürekli olarak güvenilir veriler elde eder. Bu protokolü, çeşitli fare dokularında (kalp, iskelet kası ve beyin) ve in vitro olarak kültürlenmiş hücrelerdeki protein ekspresyonu profillerini değerlendirmek için kullandık. Buna ek olarak, ortaya çıkan veri kümesinden binlerce proteinin nasıl değerlendirileceklerini gösteriyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Proteomik" terimi ilk olarak bir hücrenin, dokunun veyaorganizmanın 1.tümprotein komplemanının büyük ölçekli karakterizasyonu olarak tanımlanmıştır. Proteomik analizler, hastalık gelişimi, terapötik yollar ve sağlıklı sistemlerin protein ekspresyonu düzeylerinin göreceli niceliğini gerçekleştirmek için teknikler kullanarak mekanizmaların ve hücresel süreçlerin araştırılmasını sağlar2. Bu tür çalışmaların ilk açıklamaları 1975 yılında yayınlanmış ve bu amaçla iki boyutlu poliakrilamid jel elektroforez (2D-PAGE) kullanımını gösterdi1,3. 2D yöntemi, proteinleri yüke (izoelektrik odaklama, IEF) ve moleküler kütleye (sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforezi veya SDS-PAGE) göre ayırır4. Yıllar boyunca, her jel bileşeni üzerinde yapılan 2D-PAGE ve sonraki tandem kütle spektrometresi kombinasyonu yapılan en yaygın hedefsiz protein ekspresyonu analiz tekniği yapıldı ve çok sayıda daha önce bilinmeyen protein ekspresyonu profilleri tespit5,6. 2D-PAGE yaklaşımının genel dezavantajları, zaman alıcı olması, hidrofobik proteinler için iyi çalışmaması ve düşük duyarlılık nedeniyle değerlendirilen toplam protein sayısında sınırlamalar olmasıdır7,8.

Hücre kültüründe amino asitler tarafından kararlı izotop etiketleme (SILAC) yöntemi örneklerinde protein bolluğunu belirlemek ve ölçmek için bir sonraki popüler yaklaşım oldu9. Bu standart bir esansiyel amino asit yoksun orta kuluçka ve bu özel amino asit bir izotop etiketli versiyonu ile desteklenen hücrelerin metabolik etiketleme oluşur10. Bu tekniğin avantajı verimliliği ve hassas etiketleme9. SILAC yaklaşımının ana sınırlaması öncelikle izotop etiket incorporation neden azaltılmış hücre büyüme oranı, özellikle nispeten hassas hücre hatları insan hastalıkları modelleme zor olabilir11.

2003 yılında, tandem kitle etiketi (TMT) isobarik etiketleriçeren yeni ve sağlam proteomik tekniği12. TMT etiketleme, bağıl protein ekspresyonu düzeylerini ve çeviri sonrası modifikasyonları saptamak için artan duyarlılığı nedeniyle güçlü bir yöntemdir13. Bu yayın tarihi itibariyle, aynı anda 6, 10, 11 veya 16 örneği etiketleyebilen TMT kitleri geliştirilmiştir. Sonuç olarak, aynı anda biyolojik çoğaltmalar ile birden fazla koşullarda peptit bolluğunu ölçmek mümkündür14,15,16. Biz son zamanlarda Barth Sendromu (BTHS)17bir fare modelinin kardiyak proteomik profili karakterize TMT kullanılır. Bunu yaparken, gen tedavisi ile tedavi edilen BTHS farelerinin kardiyak profillerinde yaygın bir iyileşme gösterdik ve kardiyomiyopatilerde yeni tedavi yollarını ortaya koyan BTHS'den etkilenen yeni proteinleri tespit edebildik.

Burada doku örnekleri veya hücre peletleri kullanılarak çok katlı TMT kantitatif proteomik analizleri yapmak için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. Etiketli triptik peptidler ham dondurulmuş numunelerden daha kararlı olduğundan, tüm çekirdeklerin tüm numune türlerini işleme deneyimine sahip olmaması ve numunelerin laboratuvarda hazırlanması genellikle uzun biriktirme listesi olan çekirdekler için zamandan tasarruf edebileceğinden, numune hazırlama ve bir çekirdeğe gönderilmeden önce numune hazırlama ve etiketlemenin bir çekirdeğe gönderilmesi yararlı olabilir. Bu sürecin kütle spektroskopisi bölümünün ayrıntılı açıklamaları için lütfen Kirshenbaum ve Perumal ve ark.18,19.

Numune hazırlama protokolü aşağıdaki önemli adımlardan oluşur: ekstraksiyon, niceleme, yağış, sindirim ve etiketleme. Bu optimize edilmiş protokolün en önemli yararları, etiketleme maliyetlerini azaltmasıdır, protein ekstraksiyonu artırır ve sürekli olarak yüksek kaliteli veriler üretir. Buna ek olarak, tmt verilerinin kısa sürede binlerce proteini taramak için nasıl analiz edilebildiğini anlatıyoruz. Bu protokolün diğer araştırma gruplarını bu güçlü metodolojiyi çalışmalarına dahil etmeyi düşünmeye teşvik etmesini umuyoruz.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tüm hayvan çalışmalarını onayladı.

1. Reaktiflerin hazırlanması

  1. CHAPS Lysis Tampon (150 mM KCl, 50 mM HEPES pH = 7.4, %0.1 CHAPS ve 50 mL tampon başına 1 proteaz inhibitörü kokteyl tableti hazırlayın). Proteaz inhibitörleri olmayan tampon 4 °C'de 6 aya kadar veya -20 °C'de 1 yıla kadar proteaz inhibitörü ile tampon olarak saklanabilir.
  2. 100 mM triethylamonnium bikarbonat (TEAB): 1 M TEAB'den 4,5 mL ultrasaf suya 500 μL ekleyin.
  3. 200 mM tris (2 karboksitil) fosfin hidroklorür (TCEP): 70 μL 0,5 M TCEP, bir denaturing reaktif, 70 μL ultrasaf su ekleyin. Daha sonra 1 M TEAB'nin 35 μL'sini ekleyin.
  4. %5 hidroksilin hazırlayın: 100 mM TEAB'ın 450 μL'sine %50 hidroksilin 50 μL ekleyin.

2. Protein ekstraksiyonu

  1. Bir IACUC onaylı protokole göre bir ötenazi fare den quadriceps kas izole. -80 °C'de dondurun ve bakımını koruyun veya hemen kullanım için protokole devam edin.
  2. Taze veya dondurulmuş quadriceps fare dokusuyaklaşık 10 mg izole etmek için kesin. İskelet kası ile çalışırken cımbız kullanarak ayrı lifler. Alternatif olarak, hücre kültürleri ile çalışıyorsanız, 300 μL CHAPS lysis tampon ~3 x 106 hücreleri resuspend ve adım 2.4 atlamak.
  3. Yaklaşık 200 μL 1 mm zirkon/silika boncuk ve 500 μL CHAPS lysis tamponu ile dolu 2 mL tüpler kullanarak boncuk kırıcı kullanarak dokuyu homojenleştirin. Uygun şekilde yukarı veya aşağı ölçeklendirin (örneğin, 250 μL CHAPS lysis tamponunda 5 mg doku).
  4. DNA'ya bağlı proteini serbest bırakmak için sonication (10 s her biri için% 50 genlik ve buz üzerinde 30 s aralıkları ile 10x gerçekleştirin. Aynı DNA bozunma sonuçları, 1 mL şırıngaya bağlı 21 G iğneden 10x lysat e batık yoluyla veya 37 °C'de 30 dakika boyunca benzonaz kuluçka (44 U/mL) ile şırınga lysis ile elde edilebilir.
  5. 4 °C'de 10 dakika boyunca 16.000 x g'de lysat'ı santrifüj edin ve süpernatant'ı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.

3. Protein ölçümü

  1. Kurulu protokolleri kullanarak supernatant protein konsantrasyonu belirlemek (Malzemeler Tablosubakınız).
    NOT: ≥2 μg/μL'de numune kullanmak en iyisidir, ancak daha az konsantre numuneler de kullanılabilir. Daha az konsantre bir numune kullanılırsa, 5.1 adımdaki azaltıcı/alkilleyici reaktiflerin hacimlerini uygun şekilde ayarlamak gerekir.
  2. CHAPS lysis tamponu kullanarak BSA standart eğri seyreltme hazırlayın.
  3. Üreticinin talimatlarına uyun ve 15 dakika sonra, 750 nm de emici okuyun.

4. Reaktif tedavisinin azaltılması/alkillemi

  1. Yeni bir santrifüj tüpüne durum başına 200 μg protein aktarın ve CHAPS lysis tamponunu kullanarak 100 μL'lik son hacme ayarlayın. Protein konsantrasyonu çok düşük olduğunda 200 μL'ye kadar ölçeklendirmek mümkündür, ancak reaktifi azaltma/alkilleme hacmini uygun şekilde ayarlamayı unutmayın.
  2. 200 mM TCEP'in 5 μL'sini ekleyin ve 55 °C'de 1 saat boyunca kuluçka yada numune ekleyin.
  3. Kullanımdan hemen önce, bir tüp iodoacetamide (yani 9 mg) 100 mM TEAB'nin 132 μL'sine eriterek 375 mM iodoacetamide hazırlayın. Bu çözümü ışıktan koruyun.
  4. Numuneye 5 μL 375 mM iodoacetamide ekleyin ve ışıktan korunan oda sıcaklığında (RT) 30 dakika kuluçkaya yatırın.

5. Metanol/kloroform yağış20

  1. Her 100 μL protein ve kısaca girdap örneklerine 400 μL metanol ekleyin.
  2. RT'de 10 s için 9.000 x g'de santrifüj. Bu örnek tüp yanlarında biriken sıvılar dahil etmektir.
  3. Karışıma 100 μL kloroform ekleyin ve kısa bir süre girdap. Numunede yüksek konsantrasyonda fosfolipid varsa 200 μL kloroform kullanın.
  4. RT'de 10 s için 9.000 x g'de santrifüj. Bu örnek tüp yanlarında biriken sıvılar dahil etmektir.
  5. 300 μL su ve girdap şiddetle ekleyin. Homojen bir çözelti elde etmek önemlidir.
  6. RT'de 1 dk için 9.000 x g'da santrifüj Tüpü rafa aktarırken katmanları rahatsız etmemek için son derece dikkatli olun.
    NOT: Tüp şimdi üç aşamadan içermelidir: 1) Üst tabaka (yani, supernatant), su ve metanol karışımı; 2) Orta tabaka (yani, interfaz), beyaz çökelmiş protein; ve 3) Alt tabaka (yani, alt faz), kloroform.
  7. Dikkatle supernatant çıkarın.
  8. Kalan interfaz ve alt faza 300 μL metanol ekleyin. Girdap şiddetle.
  9. RT'de 2 dk için 9.000 x g'da santrifüj Tüpü rafa aktarırken katmanları rahatsız etmemek için son derece dikkatli olun.
  10. Dikkatle supernatant çıkarın.
  11. Pelet sadece biraz nemli olana kadar RT'de bir hava akımı altında mümkün olduğunca çok sıvı (örneğin, vakum konsantratörü kullanarak) hafifçe aspire edin ( ~10 dk). Her örnek için gerekli süre farklı olabileceğinden, değerlendirmek için her 2 dakikadan bir kontrol edin. Peleti -80 °C'de daha fazla işleme konana kadar saklayın.

6. Protein sindirimi

  1. Çökelmiş protein peletini 100 μL TEAB lysis tamponunda yeniden askıya alın.
    NOT: Bu adımda protein konsantrasyonunu ölçmek isteğe bağlıdır.
  2. Kullanımdan hemen önce, 100 μg trypsin cam şişenin altına 100 μL trypsin (50 mM asetik asit) ekleyerek 1 μg/μL tripsin hazırlayın ve 5 dakika boyunca RT. Store'da tek kullanımlık dozlarda -80 °C'de kalan reaktifi hazırlayın.
  3. Protein 100 μg başına 2,5 μL tripsin ekleyin. Numuneyi bir gecede 37 °C'de sindirin. Bu adım proteinin tam çözünmesi için çok önemlidir; bu koşulları değiştirmeyin. Sindirimden sonra, standart protein tahlilleri kullanarak protein konsantrasyonu ölçmek için isteğe bağlıdır.

7. Peptit etiketleme

  1. Kullanmadan hemen önce, TMT etiket kiti reaktiflerini RT'ye dengeleyin.
  2. Her tüpe 41 μL susuz asetonitil ilavesi ile 0.8 mg TMT etiket şişelerinin her birini çözün. Reaktifi 5 dakika boyunca RT'de ara sıra girdaplarla kuluçkaya yatırın. Kısaca tüpleri santrifüj.
    NOT: 0.8 mg TMT etiketi konsantrasyonu genellikle iki seti etiketlemek için yeterlidir. Diğer araştırmacılar, ancak, bu konsantrasyon daha da azaltılabilir ve hala güvenilir veri15verim göstermiştir.
  3. Her 100 μL numuneye TMT etiket reaktifinin 41 μL'sini dikkatlice ekleyin.
  4. RT'de 1 saat boyunca reaksiyon uyguluyor.
  5. Numuneye %5 hidroksilin indeksleri ekleyin ve reaksiyonu gidermek için 15 dakika kuluçkaya yatırın.
  6. Numuneleri yeni bir santrifüj tüpünde eşit miktarlarda bölün ve -80 °C'de saklayın.
    NOT: Bu adımda numuneler stabildir ve kütle spektroskopisi için gönderilebilir. Bu noktada standart protein tahlilleri kullanarak konsantrasyonu ölçmek için isteğe bağlıdır.

8. Kütle spektroskopisi

  1. Örnekleri, tüm numunelerin C18 spin kolonları kullanılarak birleştirildiği ve saflaştırıldığı bir proteomik tesise (bu çalışmada UF ICBR Proteomics Core tesisini kullanmaktadır) gönderin.
    NOT: Gönderimler için tercih ettikleri adımları onaylamak için numuneleri hazırlamadan önce çekirdek tesisle nasıl gönderilenleri tartışın.
  2. Kombine multipleks numunesi başına aşağıdaki prosedürleri isteyin: katı faz ekstraksiyonu, HPLC (SCX, SE), zip ucu ve LC-MS/MS (protein kimliği için 2 saat degrade, eğer >10QE Plus).
  3. Veriler toplandıktan sonra, çekirdek tesis protein tanımlama için satıcı tarafından sağlanan yazılımı kullanarak RAW dosyalarını işleyecek.

9. Veri analizi

  1. Veriler genellikle çekirdekten kullanıcıya 7z formatında teslim edilir ve bu da her veri seti için yaklaşık 16 GB disk alanı gerektirebilir (bu durumda 11 örnek). Veri işleme için, en az 3,4 GHz olan bir bilgisayarın kullanılabilir olduğundan emin olun.
  2. 7-Zip File Manager kullanarak dosyaları ayıklayın. Çıkarılan bu dosyalar RAW verileri, pdStudy biçim dosyalarını ve pdResultView biçim dosyalarını içerir. Daha fazla analiz için tüm dosyaları kaydedin.
  3. Proteome Discovery 2.2 Yazılım'ı kullanarak dosyayı açın.
    NOT: Dosya biçimi "Dosya adı.pdStudy" dir. "Dosya adı.pdResultView" açılırsa denetim örneğini seçmek mümkün değildir.
  4. "Örnekler" panelinde kontrol örneklerini seçin.
  5. "Analiz Sonuçları" panelinde kimlik seçerek Sonucu Açın.
  6. Elektronik tablo yazılımına dışa aktarma.
  7. Ham verileri kaydedin (tanımlanan tüm proteinler).
  8. Elektronik tablo yazılım dosyasını açın. Bu tespit edilmiş tüm proteinleri içerecektir.
  9. Elektronik tablo yazılım dosyasında "Filtre" işlevini "Protein FDR Confidence: Combined" in high (sütun B), " #UniquePeptidler" 2 'den yüksek (K sütunu)ve " BollukOranı" boş ( S'den W'yekadarsütun) kullanılır.
  10. "p-value" hesaplaması için bir sütun ekleme işlevi
    =TTEST(kontrol grubu,deney grubu, kuyruklar, tip)
  11. "İstatistiksel Anlamlılık" için bir sütun ekleyin
    =IF(p-value<0.05, "Anlam","NS")
  12. "Filtre" işlevini kullanarak "İstatistiksel Anlamlılık" " "Anlamlılık" gösteren ekranı kullanın. Sonuç, kontrol grubunda ve deney grubunda istatistiksel olarak anlamlı analiz edilen proteinleri göstermektedir.
  13. Deney grubunda kontrol grubuna göre anlamlı olarak daha yüksek veya daha düşük protein ekspresyonu bolluğunu belirleyin, "Yönetmelik" için bir sütun ekleyin.
    =IF(AVERAGE(controlgroup)>AVERAGE(experimentalgroup),"Upregulated","Downregulated")

10. Önemli vuruşları değerlendirme yöntemleri

  1. TMT çalışmalarında tanımlanan önemli isabetler arasındaki protein-protein etkileşimlerini belirlemek için, Etkileşen Genlerin/Proteinlerin (STRING) 11.021sürümünden geri alınması için Arama Aracı'nı kullanın : https://string-db.org/
  2. Gruplara göre sınıflandırmak için (yani moleküler fonksiyon, biyolojik süreçler ve protein sınıfları) Evrimsel İlişkiler (PANTHER) ontoloji sınıflandırma yazılımı22ile Protein Analizi kullanın : http://www.pantherdb.org/
  3. Çeşitli yollardan protein etkileşimlerini belirlemek için yol analizi yazılımı23'ükullanın.

11. Bir depo bankasına proteomik veri yükleme

  1. Proteomics IDEntificantions Database (PRIDE) veya Mass Spectrometry Interactive Virtual Environment (MassIVE) proteomik verileri göndermek için aşağıdaki bilgileri içerir: tepe listesi dosyaları (mzXML gibi standart bir biçimde işlenmiş kitle spektrum dosyaları, mzML veya MGF), sonuç dosyaları (mzIdentML veya mzTab gibi standart bir biçimde spektrum tanımlamaları) ve ham spektrum dosyaları (standart olmayan veya enstrümana özgü bir biçimde ham kütle spektrum dosyaları. RAW dosyaları veya . WIFF dosyaları).
  2. Göndermek, bir hesap oluşturmak ve bağlantı ve proje ayrıntıları gibi bilgileri eklemek için. Ardından, adım 11.1'de listelenen dosyaları seçin ve yükleyin.
  3. Resmi bir veri kümesi oluşturmak için, yüklenen bu dosyalarda bir gönderme iş akışı çalıştırın.
    NOT: Gönderimden sonra, veri kümesi depo bankasında özel olacaktır. Özel seçenekle, veriler yalnızca yetkili kullanıcılar tarafından kullanılabilir. İki ek seçenek vardır: 1) Günlük gözden geçirenlere ve ortak çalışanlara erişim sağlayan paylaşılan veri kümesi; veya 2) Genel veri kümesi aramalarında gösterilecek genel veri kümesi. Bu depoların bir diğer önemli özelliği yüklenen verileri güncelleştirme ve sonraki yayınları varolan veri kümesiyle ilişkilendirebilme yeteneğidir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sağlıklı ve hastalıklı hücreler CHAPS tamponu içinde lysed, Bizim TMT etiketleme yöntemi ayrıntılı olarak hazırlanan ve University of Florida Disiplinlerarası Merkezi Biyoteknoloji Araştırma (UF-ICBR) Proteomics Çekirdek Sıvı Kromatografi için tandem kütle spektrometresi ile gönderildi. Çekirdekten veri toplama ve tesliminardından, veri seti satıcı tarafından sağlanan yazılımda açıldı ve aşağıdaki kesme filtreleri uygulandı: ≥2 benzersiz peptidler, tüm kanallarda bulunan her protein örneği için muhabir iyonları ve yalnızca önemli ölçüde değiştirilmiş proteinleri içerir (p ≤ 0.05). Tablo 1 verileri özetlez: 7.211'i iki benzersiz peptidden eşit veya daha büyük olan 39.653 toplam peptid, 3.829'u ise tüm kanallar için muhabir iyonlarını içerir. Bu 3.829 peptidin p değerleri Student's t testi ile hesaplandı ve p ≤ 0.05 anlamlı kabul edildi. Buna ek olarak, hastalıklı proteinlerin sağlıklı hücrelere göre göreceli dağılımını belirlemek için bir kat değişimi kesintisi kullanılmıştır: indirgenmiş (mavi) veya düzensiz (kırmızı)(Şekil 1).

Anlamlı disregulated protein ekspresyonu listesi PANTHER ontoloji sınıflandırma sistemi ve STRING analizleri kullanılarak değerlendirildi. Panter analizleri, moleküler fonksiyona dayalı hastalıklı hücrelerde anlamlı olarak daha düşük(Şekil 2A)veya daha yüksek bolluk temeline dayanan proteinlerin kategorize edilmiş bir listesini göstermiştir(Şekil 2B). Anlamlı olarak daha düşük(Şekil 2C)ve daha yüksek(Şekil 2D)proteinlerinin string analizleri, proteinler arasında birden fazla etkileşim ve güçlü ilişki saptandı.

figure-results-1
Şekil 1: Volkan çizim olan bolluk önemli ölçüde değişmiş değildi proteinleri gösteren (siyah), önemli ölçüde alçaltılmış (mavi), ya da önemli ölçüde artmış (kırmızı) hastalıklı vs sağlıklı kontrol hücreleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Panter (A, B) ve String (C, D) tarafından anlamlı olarak daha düşük veya daha yüksek bolluk proteinlerinin saptanan önemli disregulated hitsin temsili değerlendirmeleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Toplam peptidlerToplam tanımlanmış≥ 2 benzersiz peptidNicel proteinlerÖnemli ölçüde değiştirilmiş proteinler
DüşükYüksek
39653721144573829296108

Tablo 1: Veri seti analizi başına nicel proteinlerin temsil tablosu.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TMT tabanlı izobarik izotop etiketleme metodolojileri kullanılarak proteomik analiz için numuneleri başarılı bir şekilde hazırlamak için, protein ekstraksiyonlarını 4 °C'de çok dikkatli bir şekilde gerçekleştirmek ve proteaz inhibitörükokteyli 24,25içeren bir lisis tamponu kullanmak çok önemlidir. Proteaz inhibitörü kokteyl protein sindirimi sırasında beklenmedik protein bozulmasını önlemek için önemli bir reaktif olduğunu. Protokolümüz ile satıcı tarafından sağlanan mevcut fark arasındaki en önemli fark, memeli hücreleri ve dokuları ile ilgili deneyimimize dayanarak CHAPS lysis tamponunun kullanılmasını şiddetle tavsiye etmektir. Ayrıca hem hücre peletleri hem de dokular için metanol/kloroform protein yağış yaklaşımı kullanmanızı öneririz.

İdeal olarak, protein ekstraksiyonu, ölçümü, azaltıcı/alkilleyici reaktif tedavileri ve metanol/kloroform yağışları aynı gün yapılır. Bu önerinin ardından sonraki etiketleme için daha doğru protein konsantrasyonları neden olacaktır. Protein çökeltme adımı, tandem kütle spektrometresi ile müdahale edecek reaktiflerin uzaklaştırılması için önemlidir. Yağış adımı da dahil olmak üzere önemli ölçüde TMT26çözünürlüğünü artırır. Özetle, TMT protokolümüzün en büyük avantajları, farklı numune türleri için yüksek etiketleme verimliliği, bunun tekrarlanabilirliği ve elde edilen güvenilir verilerdir.

Bu TMT hedeflenmemiş proteomik stratejisinin çok katlı doğası genişlemeye devam ettikçe, araştırmacıların çok çeşitli alanlarda yeni keşifler yapma yeteneğini aşamalı olarak geliştirecektir. Özellikle biyomedikal alanında, biz ve diğerleri bu teknolojiyi, hastalıkta yeni eylem mekanizmalarını ve çeşitli terapötiklerin göreceli etkilerini araştıran çalışmalarda giderek daha bilgilendirici bulduk. Tüm bu nedenlerden dolayı, bu güçlü teknoloji modern araştırma çalışmalarında kullanılan diğer OMICS yaklaşımlarının repertuarını tamamlar ve daha fazla terapötik gelişime rehberlik edecek önemli bilgiler sağlar.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uf-ICBR proteomics tesisini numunelerimizin işlenmesi için kabul etmek istiyoruz. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri R01 HL136759-01A1 (CAP) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 M Trietilamonyum bikarbonat (TEAB), 50 mLThermo Fisher90114Protein etiketleme reaktifi
%50 Hidroksilamin, 5 mLThermo Fisher90115Protein etiketleme reaktifi
Asetik asitSigmaA6283Protein sindirimi için reaktif
Susuz asetonitril, LC-MS SınıfıThermo Fisher51101Protein etiketleme reaktifi
Benzonaze nükleazSigma-AldrichE1014DNA kesme
Bağ Kırıcı TCEP çözeltisi, 5 mLThermo Fisher77720Protein etiketleme için
reaktif BSA standardıThermo23209Protein ölçümü için reaktif
CHAPSThermo Fisher28300Protein ekstraksiyonu için reaktif
KloroformFisherBP1145-1Protein çökeltme için reaktif
cTam, EDTA içermeyen Proteaz İnhibitörü Kokteyl TabletiRoche4693132001Protein ekstraksiyonu için reaktif
DC Protein Testi BioRad500-0116Protein ölçümü için reaktif
Excelanalizleri içinMicrosoft Office
Isı bloğuVWR analog12621-104Protein sindirim inkübasyonu için donatım
HEPESSigmaRDD002Protein ekstraksiyonu için reaktif
MetanolFisherA452-4Protein çökeltme için reaktif
Pierce Tripsin Proteaz, MS SınıfıThermo Fisher90058Protein sindirimi için reaktif
Potasyum klorürSigma46436Protein ekstraksiyonu için reaktif
Sigma Plot 14.0Sigma Plot 14.0Veri analizleri için yazılım
SonicatorFisher ScientificFB120DNA kesme
Spectra Max i3x Çok Modlu AlgılamaPlatformu Moleküler CihazlarProtein ölçümü için plaka okuyucu
Thermo Scientific Pierce Kantitatif Kolorimetrik Peptit TestiThermo Fisher23275Protein için reaktif ölçüm
Thermo Scientific Pierce Kantitatif Floresan Peptit TestiThermo Fisher23290Protein ölçümü için reaktif
Thermo Scientific Proteome Discoverer YazılımıThermo FisherOPTON-30945Veri analizleri için yazılım
TMT 10plex İzobarik Etiket Reaktif Seti 0.8 mg, bir 10plex izobarik deney için yeterli reaktifThermo Fisher90110Reaktif protein etiketleme
TMT11-131C Etiket Reaktifi 5 mgThermo FisherA34807Protein etiketleme için Reaktif
Su, LC-MS SınıfıThermo Fisher51140Protein ekstraksiyonu için Reaktif
Veri Yazılımı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Graves, P. R., Haystead, T. A. Molecular biologist's guide to proteomics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (1), 39-63 (2002).
  2. Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. Sample Preparation for Relative Quantitation of Proteins Using Tandem Mass Tags (TMT) and Mass Spectrometry (MS). Methods in Molecular Biology. 1741, 135-149 (2018).
  3. O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. Journal of Biological Chemistry. 250 (10), 4007-4021 (1975).
  4. Rabilloud, T., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: a tutorial. Journal of Proteomics. 74 (10), 1829-1841 (2011).
  5. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  6. Anderson, N. G., Anderson, N. L. Twenty years of two-dimensional electrophoresis: Past, present and future. Electrophoresis. 17 (3), 443-453 (1996).
  7. Haynes, P. A., Yates, J. R. Proteome profiling-pitfalls and progress. Yeast. 17 (2), 81-87 (2000).
  8. Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 815 (1-2), 227-236 (2005).
  9. Sury, M. D., Chen, J. X., Selbach, M. The SILAC fly allows for accurate protein quantification in vivo. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (10), 2173-2183 (2010).
  10. Zhang, G., Neubert, T. A. Use of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) for phosphotyrosine protein identification and quantitation. Methods in Molecular Biology. 527, 79-92 (2009).
  11. Wang, X., et al. SILAC-based quantitative MS approach for real-time recording protein-mediated cell-cell interactions. Scientific Reports. 8 (1), 8441(2018).
  12. Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).
  13. Cheng, L., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. Peptide Labeling Using Isobaric Tagging Reagents for Quantitative Phosphoproteomics. Methods in Molecular Biology. 1355, 53-70 (2016).
  14. Navarrete-Perea, J., Yu, Q., Gygi, S. P., Paulo, J. A. Streamlined Tandem Mass Tag (SL-TMT) Protocol: An Efficient Strategy for Quantitative (Phospho)proteome Profiling Using Tandem Mass Tag-Synchronous Precursor Selection-MS3. Journal of Proteome Research. 17 (6), 2226-2236 (2018).
  15. Zecha, J., et al. TMT Labeling for the Masses: A Robust and Cost-efficient, In-solution Labeling Approach. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).
  16. Bachor, R., Waliczek, M., Stefanowicz, P., Szewczuk, Z. Trends in the Design of New Isobaric Labeling Reagents for Quantitative Proteomics. Molecules. 24 (4), E701(2019).
  17. Suzuki-Hatano, S., et al. AAV9-TAZ Gene Replacement Ameliorates Cardiac TMT Proteomic Profiles in a Mouse Model of Barth Syndrome. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 13, 167-179 (2019).
  18. Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (40), e1954(2010).
  19. Perumal, N., et al. Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels. Journal of Visualized Experiments. (144), e59140(2019).
  20. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138, 141-143 (1984).
  21. Jensen, L. J., et al. STRING 8--a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms. Nucleic Acids Research. 37, D412-D416 (2009).
  22. Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).
  23. Cirillo, E., Parnell, L. D., Evelo, C. T. A Review of Pathway-Based Analysis Tools That Visualize Genetic Variants. Frontiers in Genetics. 8, 174(2017).
  24. Plaxton, W. C. Avoiding Proteolysis during the Extraction and Purification of Active Plant Enzymes. Plant and Cell Physiology. 60 (4), 715-724 (2019).
  25. Ryan, B. J., Henehan, G. T. Protein Chromatography: Methods and Protocols. Walls, D., Loughran, S. T. , Springer. New York. 53-69 (2017).
  26. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

TMT LabelingProtein ExtractionMethanol Chloroform PrecipitationTrypsin DigestionPeptide LabelingData AcquisitionPANTHER AnalysisString AnalysisProtein QuantificationProteomics Techniques

İlgili makaleler