Method Article

Alt Yapı Analizörü: Floresan Mikroskopi Görüntülerinde HücreCisimlerinin Hızlı Araştırılması ve Doğru Analizi için Kullanıcı Dostu İş Akışı

DOI:

10.3791/60990

⸱

July 15th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Université de Lorraine, CNRS, IMoPA F54000 Nancy France, 2Institut Pasteur, BioImage Analysis Unit, CNRS UMR 3691, Paris, France.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Floresan mikroskopi görüntülerinde belirli hücre bölmelerinde hücresel cisimlerin hızlı araştırılması ve doğru analizi için oluşturulmuş serbestçe kullanılabilir bir iş akışı salıyoruz. Bu kullanıcı dostu iş akışı açık kaynak yazılım Icy üzerinde tasarlanmıştır ve aynı zamanda ImageJ işlevleri kullanır. Boru hattı görüntü analizi nde bilgi olmadan uygun fiyatlı.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son on yılda floresan mikroskopi tekniklerinde uzamsal çözünürlük iyileştirmesi ile gösterildiği gibi canlı hücre görüntüleme ve yüksek işlem mikroskobu tekniklerinde de atılımlar ile karakterize edilmiştir. Bu, tek bir deney için mikroskopi verilerinin miktarında ve karmaşıklığında sürekli bir artışa yol açmıştır. Mikroskopi verilerinin manuel analizi çok zaman alıcı, öznel ve nicel analizleri yasakladığı için, biyogörüntü analizinin otomasyonu neredeyse kaçınılmaz hale gelmektedir. Floresan mikroskopiden biyogörüntülerde sinyal analizini tam olarak otomatikleştirmek için Alt Yapı Analizörü adı verilen bir bilişim iş akışı kurduk. Bu iş akışı kullanıcı dostu açık kaynak platformu Icy üzerinde geliştirilmiştir ve ImageJ işlevleri tarafından tamamlanır. Sinyalin gürültü oranına doğru geliştirilmesi için görüntülerin ön işlenmesini, hücrelerin bireysel bölümlemesi (hücre sınırlarının saptanması) ve belirli hücre bölmelerinde zenginleştirilmiş hücre gövdelerinin algılanmasını/nicelleştirilmesini içerir. Bu iş akışının en büyük avantajı, kullanıcı dostu bir arayüz aracılığıyla görüntü analizi uzmanlığı olmayan kullanıcılara karmaşık biyo-görüntüleme işlevleri önermektir. Ayrıca, son derece modüler ve farklı hücresel alt yapılarda farklı hücre organlarının karşılaştırmalı analizi nükleer / sitoplazmik translokasyon karakterizasyonu çeşitli konulara adapte. Bu iş akışının işlevselliği oksidatif stres (OS) koşulları altında Cajal (kıvrılmış) Organların çalışması ile gösterilmiştir. Floresan mikroskopiden elde edilen veriler, insan hücrelerindeki bütünlüklerinin işletim sistemi indüksiyonundan birkaç saat sonra etkilendiğini göstermektedir. Bu etki karakteristik Cajal Cisimler içine bobin nükleasyonu bir azalma ile karakterizedir, küçük foci artan sayıda bobin bir nükleoplazmik yeniden dağılımı ile ilişkili. CB bileşenleri ile çevresindeki nükleoplazm arasındaki değişimde bobinin merkezi rolü, OS'nin indüklenen bobinin yeniden dağılımının Cajal Cisimlerinin bileşimini ve işlevselliğini etkileyebileceğini düşündürmektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Işık mikroskobu ve özellikle floresan mikroskobu biyolojik bilimlerde yaygın olarak kullanılan sağlam ve çok yönlü tekniklerdir. Proteinler veya RNA gibi çeşitli biyomoleküllerin spesifik floresan etiketlemeyoluyla kesin lokalizasyonuna erişim verirler. Son on yılda mikroskobik ve görüntüleme teknolojilerinde hızlı gelişmeler ile karakterize edilmiştir 2014 Nobel Kimya Ödülü Eric Betzig, Stefan W. Hell ve William E. Moerner süper çözülmüş1floresan mikroskopi mikroskobu (SRFM) gelişimi için verilen . SFRM, geleneksel optik mikroskopinin kırınım sınırını atlayarak nanoboyuta getirir. Canlı görüntüleme veya yüksek iş elde tarama yaklaşımları gibi ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Kullanıcı dostu öğreticiler icyweb sitesinde http://icy.bioimageanalysis.org mevcuttur.

1. Icy ve Alt Yapı Analizörü protokolünü indirin

  1. Buzlu web sitesinden(http://icy.bioimageanalysis.org/download) indirin ve Alt Yapı Analizörü protokolünü indirin: http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest.
    NOT: 64 bit işletim sistemi kullanıyorsanız, Java'nın 64 bit sürümünü kullandığınızdan emin olun. Bu sürüm, Buzlu'ya ayrılan belleği artırmaya olanak sağlar (Tercihler | Genel | Maksim....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan tüm analizler standart bir dizüstü bilgisayarda (Java'nın 64 bit sürümüyle çalışan 16 GB rastgele erişimli bellek (RAM)) ile 2,80 GHz'de 64 bit, dört çekirdekli işlemci de gerçekleştirilmiştir. Rasgele erişim bellek miktarı ve analiz etmek görüntülerin çözünürlüğüne bağlı olarak, dikkate alınması gereken önemli bir parametredir. Java'nın 32 bit sürümünün kullanılması, belleği büyük veri analizi için uygun olmayan yaklaşık 1300 MB ile sınırlar, 64 bit versiyonu ise Icy'ye ayrılan belleğin artırılmasına olanak ta.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Floresan hücre görüntülerinin analizi için giderek artan sayıda özgür yazılım aracı mevcuttur. Kullanıcılar, sorunlu larının karmaşıklığına, görüntü işlemedeki bilgilerine ve analizlerinde harcamak istedikleri zamana göre yeterli yazılımı doğru bir şekilde seçmelidir. Buzlu, CellProfiler veya ImageJ /Fiji hem kullanılabilirlik hem de işlevselliği birleştiren güçlü araçlardır3. Icy net bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) sunan tek başına bir araçtır, ve özellikle onun "Protokoller" noktası ve iş a.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

G.H., Ministère Délégué à la Recherche et aux Technologies'den lisansüstü burs ile desteklenmiştir. L.H. Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL) tarafından lisansüstü burs ile desteklenirken, Q.T. ikinci "Investissements d'Avenir" programı FIGHT-HF(referans: ANR-15-RHU4570004) kapsamında Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR) tarafından denetlenen bir kamu hibesi tarafından desteklendi. Bu çalışma CNRS ve Université de Lorraine (UMR 7365) tarafından finanse edilmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
% 16 Formaldehit çözeltisi (w/h) metanol içermezsabitlemek içinThermo Fisher Scientific28908
Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşanThermo Fisher ScientificA-11008floresan ikincil antikoru
Alexa Fluor 555 keçi anti-fareThermo Fisher ScientificA-21425floresan ikincil antikor
Alexa Fluor 555 PhalloidinThermo Fisher ScientificA34055floresan ikincil antikor
Sığır serum albümin standardı (BSA)euromedex04-100-812-E
DMEMSigma-AldrichD5796-500mlhücre kültürü ortamı
Duolink DAPISigma-AldrichDUO82040-5MLmontaj ortamı
İnsan: HeLa S3 hücreleriIGBMC, Strazburg, FransaDeneyleri gerçekleştirmek için kullanılan hücre hattı
Hidrojen peroksit çözeltisi% 30 (H2< / sub>O2< / sub >)Sigma-AldrichH1009-100mlstres ajanı olarak kullanılır
Lipofectamine 2000 ReaktifiThermo Fisher Scientific11668-019transfeksiyon reaktifi
Fare monoklonal anti-coilinabcamab11822Coilin spesifik antikor
Nikon Optiphot-2 floresan mikroskobuNikonepifloresens mikroskobu
Opti-MEM I Azaltılmış Serum OrtamıThermo Fisher Scientific31985062transfeksiyon ortamı
PBS pH 7.4 (10x)gibco70011-036yıkamak için
Tavşan poliklonal anti-53BP1Thermo Fisher ScientificPA1-1656553BP1'e özgü antikor
Tavşan poliklonal anti-EDC4Sigma-AldrichSAB4200114EDC4'e özgü antikor
Triton X-100Roth6683
Hücreleri ile Yerinde Montaj Ortamı hücreleri hücrelere nüfuz etmek için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Möckl, L., Lamb, D. C., Bräuchle, C. Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner. Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).
  2. Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Substructure AnalyzerFluorescence MicroscopyImage SegmentationBioimage AnalysisCell Body DetectionSignal QuantificationIcy PlatformImageJ IntegrationNuclear TranslocationCajal Bodies

Related Articles