Yöntem makalesi

Cerrahi Fare Modelinde Osteoartritin Standart Histomorfometrik Değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/60991

⸱

6 Mayıs 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Orthopedic Research and Translational Sciences, Department of Orthopedics and Rehabilitation, Pennsylvania State College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Pennsylvania State College of Medicine, 3Department of Pharmacology, Pennsylvania State College of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol osteoartrit eşlik morfolojik eklem değişikliklerinin nicelleştirilmesi için titiz ve tekrarlanabilir bir yöntem kurar. Bu protokolün uygulanması hastalığın ilerlemesinin izlenmesi ve osteoartritte terapötik müdahalelerin değerlendirilmesinde değerli olabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amerika Birleşik Devletleri'nde en sık görülen eklem bozukluklarından biri, osteoartrit (OA) eklem kıkırdağının ilerleyici dejenerasyonu ile karakterizedir, öncelikle kalça ve diz eklemleri, hangi hasta hareketliliği ve yaşam kalitesi üzerinde önemli etkilere yol açar. Bugüne kadar, oa yavaşlatmak veya kıkırdak dejenerasyonu inhibe edebilmek için mevcut küratif tedaviler vardır. Şu anda, OA patolojianlamak ve verimli yavaşlatmak, durdurmak, hatta OA ters yeni terapötik yaklaşımlar veya ajanlar keşfetmek için devam eden araştırma geniş bir vücut vardır. Bu nedenle eklem kıkırdağı, sinovyum ve subkondral kemikteki OA ile ilişkili patolojik değişiklikleri doğru bir şekilde değerlendirmek için kantitatif ve tekrarlanabilir bir yaklaşıma sahip olmak çok önemlidir. Şu anda, OA şiddeti ve ilerlemesi öncelikle Osteoartrit Araştırma Derneği Uluslararası kullanılarak değerlendirilir (OARSI) veya Mankin puanlama sistemleri. Bu skorlama sistemlerinin önemine rağmen yarı niceldirler ve kullanıcı öznelliği nden etkilenebilirler. Daha da önemlisi, erken hastalık durumları veya erken tedavi aşamalarında kıkırdak değişiklikleri, henüz önemli, ince, henüz önemli değerlendirmek için başarısız. Burada tanımladığımız protokol, OA'daki ortak değişikliklerin değerlendirilmesi için standartlaştırılmış, titiz ve tekrarlanabilir bir nicel metodoloji oluşturmak için bilgisayarlı ve yarı otomatik histomorfometrik yazılım sistemi kullanmaktadır. Bu protokol mevcut sistemlere güçlü bir ek sunar ve eklemdeki patolojik değişikliklerin daha verimli bir şekilde algılanmasını sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amerika Birleşik Devletleri'nde en yaygın eklem bozukluklarından biri, OA eklem kıkırdağının ilerleyici dejenerasyonu ile karakterizedir, öncelikle kalça ve diz eklemlerde, hangi hasta hareketliliği ve yaşam kalitesi üzerinde önemli etkilere neden olur1,2,3. Eklem kıkırdağı sürtünmeyi en aza indirmek için tasarlanmış diyasit eklemlerin özel bağ dokusudur, hareketi kolaylaştırmak, ve eklem sıkıştırma dayanmak4. Eklem kıkırdağı iki ana bileşenden oluşur: kondrositler ve hücre dışı matriks. Kondrositler, hücre dışı matriks4'üngeliştirilmesinde, bakımında ve onarımında birincil rol oynayan özel, metabolik olarak aktif hücrelerdir. Kondrosit hipertrofisi (CH) OA gelişiminin başlıca patolojik bulgularından biridir. Bu artan hücresel boyutu ile karakterizedir, proteoglikan üretimi azaldı, ve sonunda kıkırdak dejenerasyonu yol kıkırdak matris aşağılayıcı enzimlerin artan üretimi5,6,7. Ayrıca, subkondral kemik ve eklem sinovyumpatolojipatolojideğişiklikleri OA gelişimi veilerlemesindeönemli bir rol oynamaktadır 8,9,10,11,12. Bugüne,kadar kıkırdak dejenerasyonu1,2,3,13,14inhibe mevcut küratif tedaviler vardır. Bu nedenle, OA patolojisini anlamayı ve OA'yı yavaşlatabilen hatta durdurabilen yeni tedavi yaklaşımlarını keşfetmeyi amaçlayan kapsamlı bir araştırma bulunmaktadır. Buna göre, eklemin kıkırdak, sinovyum ve subkondral kemiğindeki OA ile ilişkili patolojik değişikliklerin doğru değerlendirilmesini sağlayan nicel ve tekrarlanabilir bir yaklaşıma ihtiyaç artmaktadır.

Şu anda, OA şiddeti ve ilerlemesi öncelikle OARSI veya Mankin puanlama sistemleri kullanılarak değerlendirilir15. Ancak, bu puanlama sistemleri sadece yarı nicel ve kullanıcı öznelliği etkilenebilir. Daha da önemlisi, onlar doğru hastalık sırasında eklemde meydana gelen ince değişiklikleri değerlendirmek için başarısız ya da genetik manipülasyon veya terapötik bir müdahale yanıt olarak. Literatürde kıkırdak, sinovyum veya subkondral kemik16,17,18,19,,20,21histomorfometrik analizleri açıklayan sporadik raporlar vardır. Ancak, tüm bu eklem bileşenlerinin titiz ve tekrarlanabilir histomorfometrik analizi için ayrıntılı bir protokol hala eksik tir ve bu da sahada karşılanmamış bir ihtiyaç yaratmaktadır.

Histomorfometrik analiz kullanarak OA'daki patolojik değişiklikleri incelemek için medial menisküs (DMM) dengesini bozarak OA'yı indüklemek için cerrahi oa fare modeli kullandık. Murine OA kurulan modeller arasında, DMM yaralanma22daha az travmatik mekanizma içerir çünkü çalışmamız için seçildi 22,23,24,25,26. Meniskal-ligamentöz yaralanma ile karşılaştırıldığında (MLI) veya ön çapraz bağ yaralanması (ACLI) ameliyatları, DMM OA daha kademeli bir ilerleme teşvik, insanlarda OA gelişimine benzer22,24,25,26. Fareler, eklem kıkırdağı, subkondral kemik ve sinovyumdaki değişiklikleri değerlendirmek için DMM ameliyatından on iki hafta sonra ötenazi yedirildi.

Bu protokolün amacı, OA'ya eşlik eden ortak değişiklikleri değerlendirmek için standartlaştırılmış, titiz ve nicel bir yaklaşım oluşturmaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jax Labs'dan 12 haftalık erkek C57BL/6 fare satın alındı. Tüm fareler 12 saat ışık/karanlık programa sahip bir odada mikro-izolatör kafesbaşına 3-5 fareden oluşan gruplar halinde barındırıldı. Tüm hayvan prosedürleri, Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na göre gerçekleştirildi ve Pennsylvania Eyalet Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.

1. Travma sonrası osteoartrit (PTOA) cerrahi modeli

  1. İntraperitoneal enjeksiyon yoluyla ketamin (100 mg/kg)/xylazine (10 mg/kg) kombinasyonu nu kullanarak fareleri anestezik, ağrı kesici için intraperitoneal enjeksiyon yoluyla buprenorfin (1 mg/kg) uygulayın ve saçı diz üzerinde tıraş edin. Ameliyata başlamadan önce pedal reflekseksikliği olup olmadığını kontrol edin.
  2. Daha önce açıklandığı gibi medial menisküs (DMM) cerrahi istikrarsızlık gerçekleştirin22,23.
    NOT: Daha ayrıntılı cerrahi protokol bilgileri için Lütfen Glasson et al. ve Singh ve ark. referanslarına bakın22,23.
    1. Distal patelladan sağ diz ekleminin proksimal tibial platoya kadar 3 mm boyuna kesi yapın. Patellar tendonu yerinden etmek için bir dikiş kullanın.
    2. Tendon için eklem kapsülü medial açın ve intercondylar bölge, medial menisküs ve meniscotibial ligament23görselleştirmek için infrapatellar yağ yastığı hareket .
    3. Transect medial meniscotibial ligament DMM tamamlamak ve eklem istikrarsızlaştırmak için22,23. Kesi bölgesini zımba veya dikişlerle kapatın.
  3. Benzer bir prosedür aşağıdaki sahte ameliyatlar gerçekleştirin, ancak medial meniscotibial ligament transection olmadan.
    NOT: Fareler DMM veya sahte cerrahi almak için randomize edildi. Daha önce yayınlanan literatüre göre, fareler DMM cerrahisi12hafta sonra önemli PTOA geliştirmek 22,23,24.

2. Fare ötenazisi ve örnek toplama

  1. Fare ötenazi
    1. DMM'den 12 hafta sonra, intraperitoneal enjeksiyon yoluyla ketamin (100 mg/kg)/xylazine (10 mg/kg) kombinasyonu kullanarak fareleri anestezi yetirin.
    2. Toraks boyunca deri yoluyla bir orta hat kesi yapmak ve perfüzyon fiksasyon için kalp ortaya çıkarmak için göğüs kafesi geri çekmek27.
      NOT: Uygun kemirgen fiksasyonu protokolü hakkında ek bilgi ve uygun ekipman montajı ve prosedürleri video tasviri için Gage ve ark referans bakın27.
    3. Perfüzyon cihazını üreticinin protokolüne göre ayarlayın.
    4. Kan temizlenir ve karaciğer soluk hale gelene kadar sol ventrikül yoluyla heparinize salin perfüzyon tarafından fare ötenazi. Fare fiksasyonu tamamlanana kadar fareyi %10 nötr arabellekli formalin ile perfuse.
      NOT: Başarılı bir şekilde perfüzyona kullanılan fare sertleşir. Otomatik pompa sistemi kullanılarak ortalama perfüzyon süresi 5-7 dk'dır.
  2. Numune toplama ve hazırlama
    1. Orta uyluk kemiği ve orta tibia kemik keserek diz izole ve çevreleyen kas dokusu nu incelemek.
    2. Diz eklemlerini oda sıcaklığında 24 saat, sonra 4 °C'de 6 gün boyunca %10 nötr tamponlu formalin de saklayarak fiksasyona devam edin.
    3. Hafif sallayarak oda sıcaklığında 1 hafta BOYUNCA EDTA kireçlenme tampon örnek saklayarak kemik dekalsite28. Çıkartma arabellek çözümünü her 3 günde bir değiştirin.
      NOT: Kireçlenme tamponu, 850 mL distile su artı 15 mL buzul asetik asit çözeltisi halinde 140 g ultrasaf EDTA tetrasodyumer olarak hazırlanmıştır. Tampon çözeltiye buzul asetik asit damla ile 7.6 pH dengelendi. pH = 7.6'ya ulaştıktan sonra tampon, distile su ile toplam 1 L hacmine getirildi. Kireçlenme tamponu taze olarak hazırlanır ve hazırlanışı ndan sonraki 1 hafta içinde kullanılır.
    4. % 50 etanol ile dizyıkama, sonra% 70 etanol her 15 dakika için, sonra gömme için süreç.
      NOT: Sıvı transferi işlemi Penn State Milton S. Hershey Tıp Merkezi'nde Moleküler ve Histopatoloji Core tarafından gerçekleştirilmiştir. En iyi numune işleme önerileri için kurumun histoloji çekirdeğine başvurun.
    5. Fare dizlerini, eklemin parafin bloğunun alt yüzeyine bakan medial yönüyle parafine yerleştirin. Kaval ve femoral yüzeylerin mümkün olduğunca aynı düzleme yakın olduğundan emin olmak için katıştırma sırasında eklemtibial tarafına hafif basınç uygulayın.

3. Mikrotom kesitve slayt seçimi

  1. Mikrotom kesiti
    1. Numune bloğunun düzgün bir şekilde karşı karşıya kalmasını sağlamak için mikrotomun blok tutucuüzerindeki düzlem ayar düğümlerini kullanın.
    2. Yüz parafin bloğu böylece femur distal yönü, tibia proksimal bölge, ve medial menisküs anterior ve posterior boynuzları kesit koleksiyonu için aynı düzlemde görünür(Ek Şekil 1A). Medial menisküsün ön ve arka boynuzları birbirinden ayırmaya başladığında slaytlarda kesittoplamaya başlayın.
    3. Kaval kemiği, femur ve meniscinin yapı büyüklüklerini karşılaştırarak aynı düzlemde görünmesini sağlayın. Tibia ve femur benzer boyutta olmalıdır, her iki meniskal boynuzları boyutu ve şekli benzer(Ek Şekil 1A). Bir yapı, muadili ile karşılaştırıldığında çok büyük görünüyorsa, bu ek bir yüzey gerekli olduğunu gösterir. Daha da önemlisi, eklem alanının bozulmadığını doğrulayın.
    4. Parafin le gömülü fare dizlerinin sagittal bölümlerini 5 μm'lik bölümlerdeki medial eklem bölmesi üzerinden alın ve slaytlar üzerindeki bölümleri toplayın. Parafin bloğu başına yaklaşık 30 bölüm toplayın.
  2. Slayt seçimi
    1. Beşinci bölümden başlayarak her örnek için 50 μm arayla üç temsili bölüm seçin (örneğin, slayt 5, 15 ve 25). Sonraki boyama, OARSI skorlama ve histomorfometrik analiz için seçilen slaytlar kullanılacaktır.
      NOT: Toplam 30 bölümden oluşan bir bloktan, tüm örneği net bir şekilde temsil etmek için setin başından (slayt 5-10 slayt), orta (slayt 15-20) ve sonu (slayt lar 25-30) slaytlarını seçin. Örnekler arasında benzer derinlik düzeylerinden slaytlar seçin.

4. Hematoksilin, Safranin Portakal, ve Hızlı Yeşil boyama

  1. Seçilen slaytları üç ksilen değişikliğiyle deparaffinize edin. Slaytları %100 etanol, %95 etanolde iki değişiklik ve %70 etanol değişimi ile nemlendirin.
  2. 7 dakika hematoksilin ile slaytlar leke sonra 10 dakika boyunca akan su ile yıkayın. 3 dakika hızlı yeşil ile leke ve 10 s. Safranin-O ile 10 s. Leke 5 dakika ve hızlı bir şekilde% 0.5 buzul asetik asit daldırma ile durulayın.
  3. Distile su iki değişiklik slaytlar durulayın ve hava kurumasını bekleyin.
  4. Her biri 5 dakika boyunca ksilenin üç değişiklik slaytlar temizleyin sonra ksilen tabanlı montaj ortamı ve bir coverslip ile monte.
    NOT: Hematoksilin kemik iliği alanları tanımlamak için nükleer leke olarak hizmet vermektedir. Safranin-O kıkırdak, proteoglikanlar, müsin ve mast hücreli granülleri lekelemek için kullanılır. Hızlı Yeşil kemik için bir karşı leke olarak kullanılır.

5. Slayt görüntüleme

  1. Mikroskop ve bilgisayar tabanlı görüntüleme yazılımına bağlı mevcut bir kamera yı kullanarak Safranin-O ve Fast Green lekeli slaytları görüntüleyin.
  2. Görüntüleme yazılımını açın (Bkz. Malzeme Tablosu)ve görüntüleme penceresinin ortasında diz eklemi bölgesini (RoI) düzenleyin. Bir dönme mikroskop slayt aşaması kullanıyorsanız, kaval yüzey görüntüleme bölgesinin yatay eksen genişliğine yayılacaktır şekilde slayt hizalamak.
  3. Bir dizi örnek le görüntüye başlamadan önce kameranın beyaz dengesini ayarlayın(Ek Şekil 2). Hem 4x hem de 10x büyütmede eklem bölmesi görüntü, hem tibial hem femoral eklem yüzeyi ve tibial subkondral kemik görüntü ROIs her içinde dahil olmasını sağlamak (Ek Şekil 1A, B). OARSI puanlamaiçin kullanılacak seçilen üç düzeyin her biri için görüntüleri kaydedin.
    NOT: Kameranın beyaz dengesinin ayarlanması kullanılan yazılım ve kamera sistemlerine bağlıdır. Genellikle, Kamera Sekmesi veya Ana Görüntüleme Menüsüne gidin ve Beyaz Dengesi Ayarla'yagidin. Beyaz Dengesi Ayarla'yı seçin ve küçük bir imleç veya simge görünmelidir(Ek Şekil 2A). İmleci kullanarak, beyaz dengesini ayarlamak için görüntü/örnek içinde eklem alanı gibi lekesiz bir alan seçin.

6. Osteoartrit araştırma topluluğu uluslararası (OARSI) puanlama15

  1. Seçilen üç Safranin-O ve Hızlı Yeşil lekeli slaytları tüm örneklerden randomize edin.
  2. Üç gözlemci ile kör bir şekilde OARSI puanlama gerçekleştirin. Kısaca, rasgele sırayla bir seferde bir görüntü görüntüleyin ve her örnek için seçilen üç seviyeden biriyle ilişkili olarak üç gözlemcinin her görüntüyü puanlamasını bekleyin.
    NOT:15nolu derecelendirme ölçeğinin ayrıntılı açıklamaları için lütfen OARSI puanlama tablosuna bakın.
  3. Her gözlemciden ayrı ayrı puanları kullanarak her bölümün ortalama puanını hesaplayın. Üç temsilci bölümün ortalama puanını alarak örnek başına ortalama puanı belirleyin.

7. Histomorfometrik analiz

NOT: Diz ekleminin canlı görüntüleri bir mikroskop kamera kullanılarak dokunmatik ekranlı monitörde izlenir ve ROI'ları manuel olarak izlemek için bir kalem kullanılır. Histomorfometri yazılımının yerleşik algoritmaları, tanımlanan ROI'larda belirtilen parametreleri (aşağıdaki Protokol'e bakın) ölçer. Daha da önemlisi, histomorfometrik analiziçin OARSI puanlamasında kullanılan aynı Safranin-O ve Fast Green lekeli kesitler kullanılmaktadır.

  1. Yazılım kurulumu ve ölçüm hazırlama
    1. Mikroskopu, kamerayı, bilgisayarı ve dokunmatik ekranı açın. Yazılım programını başlatmak için Yazılım Simgesi'ne tıklayın. Slaytı görüntülemek için mikroskop aşamasına yerleştirin.
    2. Örneği ölçüm penceresi içinde ortala. Ölçüm ızgarasının mikroskopta kullanılan hedefe uyacak şekilde uygun büyütmeye ayarlandığından emin olun(Ek Şekil 3).
    3. Ekranın üst kısmındaki Dosya sekmesine gidin ve Ayarlar'ı Oku'yagidin. Ayarlar penceresini açın ve ölçülecek parametreler için uygun ayarlar dosyasını seçin.
    4. Ekranın sağ tarafındaki listeden ölçülecek parametreyi seçin (Ek Şekil 3). Belirli doku ROI'larını ölçmek için aşağıda açıklanan adımlara göre görüntüleri izlemek için kalemi veya fare imlecini kullanın. Her ölçümle tamamlandığında, ölçümü sonlamak ve bir sonraki parametreye devam etmek için Sağ Tıklatın.
      NOT: Ölçülecek parametreler listesi, açıklanan ROI'ları ölçmek amacıyla yazılım şirketiyle istişare edilince oluşturulan farklı bir tercih dosyası aracılığıyla oluşturulur. Kurulumun tamamıyla ilgili daha fazla bilgi için lütfen tartışmaya bakın.
    5. Tüm ölçümleri tamamlayın ve ardından yazılım ekranının altındaki Özet Veri sekmesine gidin(Ek Şekil 3). Ekran penceresine tıklayın, klavyedeki Ekle tuşuna basın veya verileri kopyalayıp ayrı bir elektronik tabloya yapıştırın.
      NOT: Histomorfometrik analizi randomize ve kör bir şekilde gerçekleştirin. Tüm numuneler için tüm parametre ölçümlerini tamamladıktan sonra, verileri düzenleyin ve her örnekteki üç slayttan ölçümleri ortalaman.
  2. Toplam, kalsifiye ve kireçlenmemiş kıkırdak alanlarının ölçümleri
    NOT: Bu adımları gerçekleştirmek için ticari olarak kullanılabilen bir yazılım (bkz. Malzeme Tablosu)kullanın. Bu bölümde tartışılan kıkırdak bölgeleri, kavşaklar ve subkondral kemik bölgelerinin açıklanması için Lütfen Ek Şekil 1B,C'ye bakın.
    1. Kıkırdağın eklem boşluğuyla buluştuğu tibial kıkırdak yüzeyinin üst kenarına bir çizgi çizin. Kalsifiye kıkırdağın subkondral kemikle buluştuğu kondro-osseöz kavşakta ikinci bir çizgi çizin (Şekil 1B). Toplam kıkırdak alanı ölçümü otomatik olarak elde etmek için yazılım Alanı işlevini kullanın.
    2. Kıkırdağın kalsifiye ve kireçlenmemiş bölgelerini ayıran doğal olarak oluşan bir çizgi olan gelgit işareti boyunca bir çizgi çizin. Kalsifiye kıkırdağın subkondral kemikle buluştuğu kondro-osseöz kavşakta ikinci bir çizgi çizin (Şekil 1B). Kalsifiye kıkırdak alanı ölçümü otomatik olarak elde etmek için yazılım Alanı işlevini kullanın.
    3. Kalsifiye edilmiş kıkırdak alanını toplam kıkırdak alanından çıkararak kireçlenmemiş kıkırdak alanını hesaplayın (Şekil 1B).
  3. Kondrosit sayısı ve fenotip tayini
    1. Matris üreten ve matris üretmeyen kondrositleri ayırt etmek için histomorfometri yazılımındaki ayarlar içinde ayrı sayma işlevleri oluşturun (Şekil 1B).
    2. Belirtilen fenotipifade her kondrosit üzerinde küçük bir nokta yapmak için kalem kullanarak kondrosit üreten veya üretmeyen matris lerin sayısını belirleyin(Şekil 1B).
      NOT: Hücreleri fenotiplerine göre ya matris üreten (yani güçlü Safranin-O boyama) veya matris üretmeyen (yani çok sönük veya safranin-O boyama olmadan) olarak sayın.
  4. Tibial eklem yüzey çevresinin ölçümü
    1. Tibial kıkırdak yüzeyinde bir çizgi izleyerek mutlak tibial eklem yüzeyi çevresini ölçün, bireysel fibrilasyonları dikkatlice tanımlayın(Şekil 1C).
    2. Her bölümün düzlemi için bir iç kontrol görevi görmek için gelgit işareti boyunca ikinci bir çizgi çizin(Şekil 1C).
    3. Tibial eklem yüzeyi fibrilasyon indeksi gelgit işareti çevre ile tibial artiküler yüzey çevre bölerek hesaplayın.
      NOT: Gelgit çeşnisi genellikle numuneler arasında eşittir, bu nedenle sahte ve DMM arasındaki eklem yüzeyi çevreleri arasındaki fark, mutlak çevre veya fibrilasyon indeksi kullanılıp kullanılmadığı genellikle küçüktür.
  5. Subkondral kemik ve ilik uzay alanlarının ölçümü
    1. Subkondral kemik içindeki toplam ilik uzay alanını belirlemek için subkondral bölgedeki bölgeleri sadece hematoksilin ile boyanmış (yani Fast Green için negatif) sıralayarak Alan işlevini kullanarak subkondral ilik uzay alanını ölçün. Tibial subkondral kemik içindeki tüm ilik uzayının toplam alanını belirlemek için bu alanların çevresine çizgiler çizin (Şekil 2B).
    2. Kondro-osseous kavşak ve büyüme plakasının üstün sınırı arasındaki bölgeyi özetleyerek, anterior ve posterior osteofit bölgelerine yanal olarak uzanan bölge işlevini kullanarak toplam subkondral alanı ölçün(Şekil 2B).
    3. Subkondral kemik iliği uzay alanını total subkondral alandan çıkararak subkondral kemik alanını hesaplayın (Şekil 2B,C).
  6. Anterior ve posterior osteofit alanlarının ölçümü
    1. Osteofit alanını ölçmek için, Alan fonksiyonunu kullanarak proksimal tibianın ön ve posterior osteofitlerini takip edin (Şekil 2B,E,F).
      NOT: Osteofitler eklem kıkırdağı ile büyüme plakası, subkondral bölgeye anterior veya posterior arasında şekil veren kemikli projeksiyonlardır. Tibianın ön ve arka tarafındaki osteofit alanlar subkondral kemiğin ön veya posterior bölgesinin izlenmesi ile belirlenir. Osteofitler ve subkondral kemik arasındaki kavşak açıkça eklem kıkırdağı büyüme plakasına kadar uzanan hücrelerin bir çizgi ile belirlenir. Osteofit ve sinovyum arasındaki kavşak kemik ve fibröz doku arasındaki geçiş ile tanımlanır.
  7. Sinovyal kalınlığın ölçülmesi
    1. Femur üzerindeki ön sinovyumun iç ekleme noktasından menisküs üzerindeki bağlanma noktasına doğru bir çizgi çizerek Alan işlevini kullanarak ön femoral sinovyal kalınlığı ölçün (Şekil 3B).
    2. Femur üzerindeki sinovyumun dış sineğinden menisküse olan ekine doğru ikinci bir çizgi çizin (Şekil 3B).
    3. Toplam sinovyal alanı sinovyal çevreye bölerek sinovyal kalınlığı hesaplayın.

8. İstatistiksel analiz

  1. Ölçülen parametreleri toplayın ve her örnek için üç temsili bölümden elde edilen sonuçları ortalama. Üç veya daha fazla grubu karşılaştırmak için iki grubu veya tek yönlü ANOVA'yı karşılaştırmak için eşlenmemiş bir Öğrencinin t-testini kullanarak verileri analiz edin.
  2. Verileri ortalama ± standart hatası olarak görüntüleyin.
    NOT: P ≤ 0.05'te istatistiksel anlamlılık elde edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DMM'ye bağlı OA artiküler kıkırdak dejenerasyonu ve kondrosit kaybı ile sonuçlanır
DMM'ye bağlı OA, yüzey erozyonu ve kıkırdak kaybı ile belirgin bir şekilde karakterize olan sahte farelere göre artmış OARSI skoru ile sonuçlanmıştır(Şekil 1A,D). Burada ayrıntılı olarak açıklanan histomorfometri protokolü, toplam kıkırdak alanında ve kireçlenmemiş kıkırdak alanında azalma da dahil olmak üzere çeşitli OA ile ilişkili değişiklikler tespit etti (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son osteoartrit araştırma eklem içinde farklı dokular arasındaki çapraz konuşma anlayışımızı geliştirdi ve her doku hastalık başlatma veya ilerleme8oynadığı rol8 ,9,10,35,36. Buna göre, OA değerlendirmesinin kıkırdak analizi ile sınırlı kalmaması, aynı zamanda subkondral kemik ve sinovyum analizini de içermesi gerektiği açıkça ortaya çıkmıştır. Buna rağmen, ek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Karşılaştırmalı Tıp Bölümü personeli ve Penn State Milton S. Hershey Tıp Merkezi Moleküler ve Histopatoloji çekirdek yardım larını kabul etmek istiyorum. Finansman kaynakları: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Artrit Araştırma Bursu (F.K.).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 10 Tamponlu Formalin Fosfat FisherChemicalSF100-20Hasattan sonra numune fiksasyonu için
Asetik Asit, Buzul (Sertifikalı ACS)Fisher ChemicalA38S-212Boyama için tampon hazırlama ve asetik asit çözeltisi hazırlama
Cintiq 27QHD Yaratıcı Kalem EkranWacomhttps://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touchHistomorfometrik analiz ve görüntüleme için
Cintiq Ergo standıWacomhttps://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touchHistomorfometrik analiz ve görüntüleme için
Etilendiamintetraasetik asit, tetrasodyum tuzu dihidrat, %99Acros OrganicsAC446080010Dekalsifikasyon için Tampon hazırlama
Hızlı Yeşil lekeSIGMA Yaşam BilimleriF7258Örnek boyama için
Fisherbrand Superfrost Plus Mikroskop Slaytları Fisher12-550-15Örnek kesit toplama için
HistoPrep KsilenFisherbrandHC-700-1GALNumune ayrıştırma ve boyama için
Histosette II Doku Kasetleri - Kombinasyon Kapağı ve TabanıFisher15-182-701ANumune işleme ve yerleştirme için
HP Z440 İş İstasyonuHPÜrün numarası: Y5C77US#ABAHistomorfometrik analiz ve görüntüleme için
Manuel Döner MikrotomLeicaRM 2235İçin Numune kesitleme
Markalama kalemleriLeica3801880Numune etiketleme, kasetler ve slaytlar için
OLYMPUS BX53 MikroskopOLYMPUShttps://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/Histomorfometrik analiz ve görüntüleme için
OLYMPUS DP 73 Mikroskop KamerasıOLYMPUShttps://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/Histomorfometrik analiz ve görüntüleme için (durduruldu)
ORION STAR A211 pH metreDekalsifikasyon Tamponu hazırlama içinThermo ScientificSTARA2110
OsteoMeasure Yazılımı OsteoMetricshttps://www.osteometrics.com/index.htmHistomorfometrik ölçüm ve analiz için
Perfüzyon İki Otomatik Basınç Perfüzyon sistemiLeicaModel # 39471005Fare için diz hasadı
PRISM 7 YazılımıGraphPadKurumsal Erişim Hesabıİstatistiksel Analiz
Safranin-O boyasıSIGMA Life SciencesS8884Örnek boyama için
ThinkBoneStage - Döner Mikroskop AşamasıThink Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (tedarikçi)http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.phpHistomorfometrik analiz ve görüntüleme için
Wacom Pro Pen StylusWacomhttps://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touchHistomorfometrik analiz ve görüntüleme için
Hematoksilen boyama içinWeigerts Iron Hematoxylin AFisher5029713
Weigerts Iron Hematoxylin BFisher5029714Hematoksilen boyama için
Dekalsifikasyon için Hematoksilenboyama için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ma, V. Y., Chan, L., Carruthers, K. J. Incidence, prevalence, costs, and impact on disability of common conditions requiring rehabilitation in the United States: stroke, spinal cord injury, traumatic brain injury, multiple sclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, limb loss, and back pain. Archives of Physical Medicine and Rehabililation. 95 (5), 986-995 (2014).
  2. Hopman, W., et al. Associations between chronic disease, age and physical and mental health status. Journal of Chronic Diseases in Canada. 29 (3), 108-116 (2009).
  3. Lorenz, J., Grässel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. Singh, S., Coppola, V. 1194, Humana Press. New York, NY. 401-419 (2004).
  4. Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: structure, composition, and function. Journal of Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
  5. Van der Kraan, P., Van den Berg, W. Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis: role in initiation and progression of cartilage degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (3), 223-232 (2012).
  6. Hodsman, A. B., et al. Parathyroid hormone and teriparatide for the treatment of osteoporosis: a review of the evidence and suggested guidelines for its use. Endocrine Reviews. 26 (5), 688-703 (2005).
  7. Pitsillides, A. A., Beier, F. Cartilage biology in osteoarthritis-lessons from developmental biology. Nature Reviews Rheumatology. 7 (11), 654(2011).
  8. Yuan, X., et al. Bone-cartilage interface crosstalk in osteoarthritis: potential pathways and future therapeutic strategies. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (8), 1077-1089 (2014).
  9. Goldring, S. R., Goldring, M. B. Changes in the osteochondral unit during osteoarthritis: structure, function and cartilage-bone crosstalk. Nature Reviews Rheumatology. 12 (11), 632(2016).
  10. Martel-Pelletier, J., et al. Osteoarthritis. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 16072(2016).
  11. Goldring, M. B., Otero, M. Inflammation in osteoarthritis. Current Opinion in Rheumatology. 23 (5), 471(2011).
  12. Sellam, J., Berenbaum, F. The role of synovitis in pathophysiology and clinical symptoms of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 6 (11), 625(2010).
  13. Ma, H., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
  14. Katon, W., Lin, E. H., Kroenke, K. The association of depression and anxiety with medical symptom burden in patients with chronic medical illness. General Hospital Psychiatry. 29 (2), 147-155 (2007).
  15. Glasson, S., Chambers, M., Van Den Berg, W., Little, C. The OARSI histopathology initiative-recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, 17-23 (2010).
  16. Pastoureau, P., Leduc, S., Chomel, A., De Ceuninck, F. Quantitative assessment of articular cartilage and subchondral bone histology in the meniscectomized guinea pig model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 11 (6), 412-423 (2003).
  17. O'Driscoll, S. W., Marx, R. G., Fitzsimmons, J. S., Beaton, D. E. Method for automated cartilage histomorphometry. Tissue Engineering. 5 (1), 13-23 (1999).
  18. Matsui, H., Shimizu, M., Tsuji, H. Cartilage and subchondral bone interaction in osteoarthrosis of human knee joint: a histological and histomorphometric study. Microscopy Research Technique. 37 (4), 333-342 (1997).
  19. Hacker, S. A., Healey, R. M., Yoshioka, M., Coutts, R. D. A methodology for the quantitative assessment of articular cartilage histomorphometry. Osteoarthritis and Cartilage. 5 (5), 343-355 (1997).
  20. Pastoureau, P., Chomel, A. Methods for Cartilage and Subchondral Bone Histomorphometry. Cartilage and Osteoarthritis. Methods in Molecular Medicine. DeCeuninck, F., Sabatini, M., Pastoureau, P. 101, Humana Press. New York, NY. 79-91 (2004).
  21. McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
  22. Glasson, S., Blanchet, T., Morris, E. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  23. Singh, S. R., Coppola, V. Mouse Genetics: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2004).
  24. Fang, H., Beier, F. Mouse models of osteoarthritis: modelling risk factors and assessing outcomes. Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 413(2014).
  25. Culley, K. L., et al. Mouse Models of Osteoarthritis: Surgical Model of Posttraumatic Osteoarthritis Induced by Destabilization of the Medial Meniscus. Osteoporosis and Osteoarthritis. Methods in Molecular Biology. Westendorf, J., van Wijnen, A. 1226, Humana Press. New York, NY. 143-173 (2015).
  26. Van der Kraan, P. Factors that influence outcome in experimental osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (3), 369-375 (2017).
  27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  28. Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of bone: literature review and practical study of various decalcifying agents. Methods, and their effects on bone histology. Journal of Histotechnology. 21 (1), 49-58 (1998).
  29. Lajeunesse, D., Massicotte, F., Pelletier, J. P., Martel-Pelletier, J. Subchondral bone sclerosis in osteoarthritis: not just an innocent bystander. Modern Rheumatology. 13 (1), 0007-0014 (2003).
  30. Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research Therapy. 15 (6), 223(2013).
  31. Kapoor, M., Martel-Pelletier, J., Lajeunesse, D., Pelletier, J. P., Fahmi, H. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 33(2011).
  32. Scanzello, C. R., Goldring, S. R. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 51 (2), 249-257 (2012).
  33. Benito, M. J., Veale, D. J., FitzGerald, O., van den Berg, W. B., Bresnihan, B. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (9), 1263-1267 (2005).
  34. De Lange-Brokaar, B. J., et al. Synovial inflammation, immune cells and their cytokines in osteoarthritis: a review. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (12), 1454-1499 (2012).
  35. Findlay, D. M., Kuliwaba, J. S. Bone-cartilage crosstalk: a conversation for understanding osteoarthritis. Bone Research. 4, 16028(2016).
  36. Lories, R. J., Luyten, F. P. The bone-cartilage unit in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43(2011).
  37. Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Journal of Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  38. Hayami, T., et al. Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis. Bone. 38 (2), 234-243 (2006).
  39. Priemel, M., et al. mineralization defects and vitamin D deficiency: Histomorphometric analysis of iliac crest bone biopsies and circulating 25-hydroxyvitamin D in 675 patients. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (2), 305-312 (2010).
  40. Yukata, K., et al. Continuous infusion of PTH 1–34 delayed fracture healing in mice. Scientific Reports. 8 (1), 13175(2018).
  41. Kawano, T., et al. LIM kinase 1 deficient mice have reduced bone mass. Bone. 52 (1), 70-82 (2013).
  42. Zhang, L., Chang, M., Beck, C. A., Schwarz, E. M., Boyce, B. F. Analysis of new bone, cartilage, and fibrosis tissue in healing murine allografts using whole slide imaging and a new automated histomorphometric algorithm. Bone Research. 4, 15037(2016).
  43. Wu, Q., et al. Induction of an osteoarthritis-like phenotype and degradation of phosphorylated Smad3 by Smurf2 in transgenic mice. Arthritis Rheumatism. 58 (10), 3132-3144 (2008).
  44. Hordon, L., et al. Trabecular architecture in women and men of similar bone mass with and without vertebral fracture: I. Two-dimensional histology. Bone. 27 (2), 271-276 (2000).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Osteoartrit Fare ModeliHistomorfometrik AnalizK k rdak Alan l mSubkondral Kemik De erlendirmesiOsteofit Alan KantifikasyonuSinovyal Kal nl k De erlendirmesiKondrosit Say mFibrilasyon ndeksi HesaplamasDMM ile nd klenen OAKantitatif Eklem De erlendirmesi

İlgili makaleler