Cerrahi Fare Modelinde Osteoartritin Standart Histomorfometrik Değerlendirilmesi

Amerika Birleşik Devletleri'nde en yaygın eklem bozukluklarından biri, OA eklem kıkırdağının ilerleyici dejenerasyonu ile karakterizedir, öncelikle kalça ve diz eklemlerde, hangi hasta hareketliliği ve yaşam kalitesi üzerinde önemli etkilere neden olur^1,2,3. Eklem kıkırdağı sürtünmeyi en aza indirmek için tasarlanmış diyasit eklemlerin özel bağ dokusudur, hareketi kolaylaştırmak, ve eklem sıkıştırma dayanmak⁴. Eklem kıkırdağı iki ana bileşenden oluşur: kondrositler ve hücre dışı matriks. Kondrositler, hücre dışı matriks^4'üngeliştirilmesinde, bakımında ve onarımında birincil rol oynayan özel, metabolik olarak aktif hücrelerdir. Kondrosit hipertrofisi (CH) OA gelişiminin başlıca patolojik bulgularından biridir. Bu artan hücresel boyutu ile karakterizedir, proteoglikan üretimi azaldı, ve sonunda kıkırdak dejenerasyonu yol kıkırdak matris aşağılayıcı enzimlerin artan üretimi^5,6,7. Ayrıca, subkondral kemik ve eklem sinovyumpatolojipatolojideğişiklikleri OA gelişimi ve^{ilerlemesinde}önemli bir rol oynamaktadır 8^,9,10,11,12. Bugüne^,kadar kıkırdak dejenerasyonu^1,2,3,13,14inhibe mevcut küratif tedaviler vardır. Bu nedenle, OA patolojisini anlamayı ve OA'yı yavaşlatabilen hatta durdurabilen yeni tedavi yaklaşımlarını keşfetmeyi amaçlayan kapsamlı bir araştırma bulunmaktadır. Buna göre, eklemin kıkırdak, sinovyum ve subkondral kemiğindeki OA ile ilişkili patolojik değişikliklerin doğru değerlendirilmesini sağlayan nicel ve tekrarlanabilir bir yaklaşıma ihtiyaç artmaktadır.

Şu anda, OA şiddeti ve ilerlemesi öncelikle OARSI veya Mankin puanlama sistemleri kullanılarak değerlendirilir¹⁵. Ancak, bu puanlama sistemleri sadece yarı nicel ve kullanıcı öznelliği etkilenebilir. Daha da önemlisi, onlar doğru hastalık sırasında eklemde meydana gelen ince değişiklikleri değerlendirmek için başarısız ya da genetik manipülasyon veya terapötik bir müdahale yanıt olarak. Literatürde kıkırdak, sinovyum veya subkondral kemik^{16,17,18,19,,20,21}histomorfometrik analizleri açıklayan sporadik raporlar vardır. Ancak, tüm bu eklem bileşenlerinin titiz ve tekrarlanabilir histomorfometrik analizi için ayrıntılı bir protokol hala eksik tir ve bu da sahada karşılanmamış bir ihtiyaç yaratmaktadır.

Histomorfometrik analiz kullanarak OA'daki patolojik değişiklikleri incelemek için medial menisküs (DMM) dengesini bozarak OA'yı indüklemek için cerrahi oa fare modeli kullandık. Murine OA kurulan modeller arasında, DMM yaralanma²²daha az travmatik mekanizma içerir çünkü çalışmamız için seçildi 22^,23,24,25,26. Meniskal-ligamentöz yaralanma ile karşılaştırıldığında (MLI) veya ön çapraz bağ yaralanması (ACLI) ameliyatları, DMM OA daha kademeli bir ilerleme teşvik, insanlarda OA gelişimine benzer^22,24,25,26. Fareler, eklem kıkırdağı, subkondral kemik ve sinovyumdaki değişiklikleri değerlendirmek için DMM ameliyatından on iki hafta sonra ötenazi yedirildi.

Bu protokolün amacı, OA'ya eşlik eden ortak değişiklikleri değerlendirmek için standartlaştırılmış, titiz ve nicel bir yaklaşım oluşturmaktır.

Jax Labs'dan 12 haftalık erkek C57BL/6 fare satın alındı. Tüm fareler 12 saat ışık/karanlık programa sahip bir odada mikro-izolatör kafesbaşına 3-5 fareden oluşan gruplar halinde barındırıldı. Tüm hayvan prosedürleri, Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na göre gerçekleştirildi ve Pennsylvania Eyalet Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.

1. Travma sonrası osteoartrit (PTOA) cerrahi modeli

1. İntraperitoneal enjeksiyon yoluyla ketamin (100 mg/kg)/xylazine (10 mg/kg) kombinasyonu nu kullanarak fareleri anestezik, ağrı kesici için intraperitoneal enjeksiyon yoluyla buprenorfin (1 mg/kg) uygulayın ve saçı diz üzerinde tıraş edin. Ameliyata başlamadan önce pedal reflekseksikliği olup olmadığını kontrol edin.
2. Daha önce açıklandığı gibi medial menisküs (DMM) cerrahi istikrarsızlık gerçekleştirin^22,23.
   NOT: Daha ayrıntılı cerrahi protokol bilgileri için Lütfen Glasson et al. ve Singh ve ark. referanslarına bakın^22,23.
   1. Distal patelladan sağ diz ekleminin proksimal tibial platoya kadar 3 mm boyuna kesi yapın. Patellar tendonu yerinden etmek için bir dikiş kullanın.
   2. Tendon için eklem kapsülü medial açın ve intercondylar bölge, medial menisküs ve meniscotibial ligament²³görselleştirmek için infrapatellar yağ yastığı hareket .
   3. Transect medial meniscotibial ligament DMM tamamlamak ve eklem istikrarsızlaştırmak için^22,23. Kesi bölgesini zımba veya dikişlerle kapatın.
3. Benzer bir prosedür aşağıdaki sahte ameliyatlar gerçekleştirin, ancak medial meniscotibial ligament transection olmadan.
   NOT: Fareler DMM veya sahte cerrahi almak için randomize edildi. Daha önce yayınlanan literatüre göre, fareler DMM cerrahisi¹²hafta sonra önemli PTOA geliştirmek 22^,23,24.

2. Fare ötenazisi ve örnek toplama

1. Fare ötenazi
   1. DMM'den 12 hafta sonra, intraperitoneal enjeksiyon yoluyla ketamin (100 mg/kg)/xylazine (10 mg/kg) kombinasyonu kullanarak fareleri anestezi yetirin.
   2. Toraks boyunca deri yoluyla bir orta hat kesi yapmak ve perfüzyon fiksasyon için kalp ortaya çıkarmak için göğüs kafesi geri çekmek²⁷.
      NOT: Uygun kemirgen fiksasyonu protokolü hakkında ek bilgi ve uygun ekipman montajı ve prosedürleri video tasviri için Gage ve ark referans bakın²⁷.
   3. Perfüzyon cihazını üreticinin protokolüne göre ayarlayın.
   4. Kan temizlenir ve karaciğer soluk hale gelene kadar sol ventrikül yoluyla heparinize salin perfüzyon tarafından fare ötenazi. Fare fiksasyonu tamamlanana kadar fareyi %10 nötr arabellekli formalin ile perfuse.
      NOT: Başarılı bir şekilde perfüzyona kullanılan fare sertleşir. Otomatik pompa sistemi kullanılarak ortalama perfüzyon süresi 5-7 dk'dır.
2. Numune toplama ve hazırlama
   1. Orta uyluk kemiği ve orta tibia kemik keserek diz izole ve çevreleyen kas dokusu nu incelemek.
   2. Diz eklemlerini oda sıcaklığında 24 saat, sonra 4 °C'de 6 gün boyunca %10 nötr tamponlu formalin de saklayarak fiksasyona devam edin.
   3. Hafif sallayarak oda sıcaklığında 1 hafta BOYUNCA EDTA kireçlenme tampon örnek saklayarak kemik dekalsite²⁸. Çıkartma arabellek çözümünü her 3 günde bir değiştirin.
      NOT: Kireçlenme tamponu, 850 mL distile su artı 15 mL buzul asetik asit çözeltisi halinde 140 g ultrasaf EDTA tetrasodyumer olarak hazırlanmıştır. Tampon çözeltiye buzul asetik asit damla ile 7.6 pH dengelendi. pH = 7.6'ya ulaştıktan sonra tampon, distile su ile toplam 1 L hacmine getirildi. Kireçlenme tamponu taze olarak hazırlanır ve hazırlanışı ndan sonraki 1 hafta içinde kullanılır.
   4. % 50 etanol ile dizyıkama, sonra% 70 etanol her 15 dakika için, sonra gömme için süreç.
      NOT: Sıvı transferi işlemi Penn State Milton S. Hershey Tıp Merkezi'nde Moleküler ve Histopatoloji Core tarafından gerçekleştirilmiştir. En iyi numune işleme önerileri için kurumun histoloji çekirdeğine başvurun.
   5. Fare dizlerini, eklemin parafin bloğunun alt yüzeyine bakan medial yönüyle parafine yerleştirin. Kaval ve femoral yüzeylerin mümkün olduğunca aynı düzleme yakın olduğundan emin olmak için katıştırma sırasında eklemtibial tarafına hafif basınç uygulayın.

3. Mikrotom kesitve slayt seçimi

1. Mikrotom kesiti
   1. Numune bloğunun düzgün bir şekilde karşı karşıya kalmasını sağlamak için mikrotomun blok tutucuüzerindeki düzlem ayar düğümlerini kullanın.
   2. Yüz parafin bloğu böylece femur distal yönü, tibia proksimal bölge, ve medial menisküs anterior ve posterior boynuzları kesit koleksiyonu için aynı düzlemde görünür(Ek Şekil 1A). Medial menisküsün ön ve arka boynuzları birbirinden ayırmaya başladığında slaytlarda kesittoplamaya başlayın.
   3. Kaval kemiği, femur ve meniscinin yapı büyüklüklerini karşılaştırarak aynı düzlemde görünmesini sağlayın. Tibia ve femur benzer boyutta olmalıdır, her iki meniskal boynuzları boyutu ve şekli benzer(Ek Şekil 1A). Bir yapı, muadili ile karşılaştırıldığında çok büyük görünüyorsa, bu ek bir yüzey gerekli olduğunu gösterir. Daha da önemlisi, eklem alanının bozulmadığını doğrulayın.
   4. Parafin le gömülü fare dizlerinin sagittal bölümlerini 5 μm'lik bölümlerdeki medial eklem bölmesi üzerinden alın ve slaytlar üzerindeki bölümleri toplayın. Parafin bloğu başına yaklaşık 30 bölüm toplayın.
2. Slayt seçimi
   1. Beşinci bölümden başlayarak her örnek için 50 μm arayla üç temsili bölüm seçin (örneğin, slayt 5, 15 ve 25). Sonraki boyama, OARSI skorlama ve histomorfometrik analiz için seçilen slaytlar kullanılacaktır.
      NOT: Toplam 30 bölümden oluşan bir bloktan, tüm örneği net bir şekilde temsil etmek için setin başından (slayt 5-10 slayt), orta (slayt 15-20) ve sonu (slayt lar 25-30) slaytlarını seçin. Örnekler arasında benzer derinlik düzeylerinden slaytlar seçin.

4. Hematoksilin, Safranin Portakal, ve Hızlı Yeşil boyama

1. Seçilen slaytları üç ksilen değişikliğiyle deparaffinize edin. Slaytları %100 etanol, %95 etanolde iki değişiklik ve %70 etanol değişimi ile nemlendirin.
2. 7 dakika hematoksilin ile slaytlar leke sonra 10 dakika boyunca akan su ile yıkayın. 3 dakika hızlı yeşil ile leke ve 10 s. Safranin-O ile 10 s. Leke 5 dakika ve hızlı bir şekilde% 0.5 buzul asetik asit daldırma ile durulayın.
3. Distile su iki değişiklik slaytlar durulayın ve hava kurumasını bekleyin.
4. Her biri 5 dakika boyunca ksilenin üç değişiklik slaytlar temizleyin sonra ksilen tabanlı montaj ortamı ve bir coverslip ile monte.
   NOT: Hematoksilin kemik iliği alanları tanımlamak için nükleer leke olarak hizmet vermektedir. Safranin-O kıkırdak, proteoglikanlar, müsin ve mast hücreli granülleri lekelemek için kullanılır. Hızlı Yeşil kemik için bir karşı leke olarak kullanılır.

5. Slayt görüntüleme

1. Mikroskop ve bilgisayar tabanlı görüntüleme yazılımına bağlı mevcut bir kamera yı kullanarak Safranin-O ve Fast Green lekeli slaytları görüntüleyin.
2. Görüntüleme yazılımını açın (Bkz. Malzeme Tablosu)ve görüntüleme penceresinin ortasında diz eklemi bölgesini (RoI) düzenleyin. Bir dönme mikroskop slayt aşaması kullanıyorsanız, kaval yüzey görüntüleme bölgesinin yatay eksen genişliğine yayılacaktır şekilde slayt hizalamak.
3. Bir dizi örnek le görüntüye başlamadan önce kameranın beyaz dengesini ayarlayın(Ek Şekil 2). Hem 4x hem de 10x büyütmede eklem bölmesi görüntü, hem tibial hem femoral eklem yüzeyi ve tibial subkondral kemik görüntü ROIs her içinde dahil olmasını sağlamak (Ek Şekil 1A, B). OARSI puanlamaiçin kullanılacak seçilen üç düzeyin her biri için görüntüleri kaydedin.
   NOT: Kameranın beyaz dengesinin ayarlanması kullanılan yazılım ve kamera sistemlerine bağlıdır. Genellikle, Kamera Sekmesi veya Ana Görüntüleme Menüsüne gidin ve Beyaz Dengesi Ayarla'yagidin. Beyaz Dengesi Ayarla'yı seçin ve küçük bir imleç veya simge görünmelidir(Ek Şekil 2A). İmleci kullanarak, beyaz dengesini ayarlamak için görüntü/örnek içinde eklem alanı gibi lekesiz bir alan seçin.

6. Osteoartrit araştırma topluluğu uluslararası (OARSI) puanlama¹⁵

1. Seçilen üç Safranin-O ve Hızlı Yeşil lekeli slaytları tüm örneklerden randomize edin.
2. Üç gözlemci ile kör bir şekilde OARSI puanlama gerçekleştirin. Kısaca, rasgele sırayla bir seferde bir görüntü görüntüleyin ve her örnek için seçilen üç seviyeden biriyle ilişkili olarak üç gözlemcinin her görüntüyü puanlamasını bekleyin.
   NOT:¹⁵nolu derecelendirme ölçeğinin ayrıntılı açıklamaları için lütfen OARSI puanlama tablosuna bakın.
3. Her gözlemciden ayrı ayrı puanları kullanarak her bölümün ortalama puanını hesaplayın. Üç temsilci bölümün ortalama puanını alarak örnek başına ortalama puanı belirleyin.

7. Histomorfometrik analiz

NOT: Diz ekleminin canlı görüntüleri bir mikroskop kamera kullanılarak dokunmatik ekranlı monitörde izlenir ve ROI'ları manuel olarak izlemek için bir kalem kullanılır. Histomorfometri yazılımının yerleşik algoritmaları, tanımlanan ROI'larda belirtilen parametreleri (aşağıdaki Protokol'e bakın) ölçer. Daha da önemlisi, histomorfometrik analiziçin OARSI puanlamasında kullanılan aynı Safranin-O ve Fast Green lekeli kesitler kullanılmaktadır.

1. Yazılım kurulumu ve ölçüm hazırlama
   1. Mikroskopu, kamerayı, bilgisayarı ve dokunmatik ekranı açın. Yazılım programını başlatmak için Yazılım Simgesi'ne tıklayın. Slaytı görüntülemek için mikroskop aşamasına yerleştirin.
   2. Örneği ölçüm penceresi içinde ortala. Ölçüm ızgarasının mikroskopta kullanılan hedefe uyacak şekilde uygun büyütmeye ayarlandığından emin olun(Ek Şekil 3).
   3. Ekranın üst kısmındaki Dosya sekmesine gidin ve Ayarlar'ı Oku'yagidin. Ayarlar penceresini açın ve ölçülecek parametreler için uygun ayarlar dosyasını seçin.
   4. Ekranın sağ tarafındaki listeden ölçülecek parametreyi seçin (Ek Şekil 3). Belirli doku ROI'larını ölçmek için aşağıda açıklanan adımlara göre görüntüleri izlemek için kalemi veya fare imlecini kullanın. Her ölçümle tamamlandığında, ölçümü sonlamak ve bir sonraki parametreye devam etmek için Sağ Tıklatın.
      NOT: Ölçülecek parametreler listesi, açıklanan ROI'ları ölçmek amacıyla yazılım şirketiyle istişare edilince oluşturulan farklı bir tercih dosyası aracılığıyla oluşturulur. Kurulumun tamamıyla ilgili daha fazla bilgi için lütfen tartışmaya bakın.
   5. Tüm ölçümleri tamamlayın ve ardından yazılım ekranının altındaki Özet Veri sekmesine gidin(Ek Şekil 3). Ekran penceresine tıklayın, klavyedeki Ekle tuşuna basın veya verileri kopyalayıp ayrı bir elektronik tabloya yapıştırın.
      NOT: Histomorfometrik analizi randomize ve kör bir şekilde gerçekleştirin. Tüm numuneler için tüm parametre ölçümlerini tamamladıktan sonra, verileri düzenleyin ve her örnekteki üç slayttan ölçümleri ortalaman.
2. Toplam, kalsifiye ve kireçlenmemiş kıkırdak alanlarının ölçümleri
   NOT: Bu adımları gerçekleştirmek için ticari olarak kullanılabilen bir yazılım (bkz. Malzeme Tablosu)kullanın. Bu bölümde tartışılan kıkırdak bölgeleri, kavşaklar ve subkondral kemik bölgelerinin açıklanması için Lütfen Ek Şekil 1B,C'ye bakın.
   1. Kıkırdağın eklem boşluğuyla buluştuğu tibial kıkırdak yüzeyinin üst kenarına bir çizgi çizin. Kalsifiye kıkırdağın subkondral kemikle buluştuğu kondro-osseöz kavşakta ikinci bir çizgi çizin (Şekil 1B). Toplam kıkırdak alanı ölçümü otomatik olarak elde etmek için yazılım Alanı işlevini kullanın.
   2. Kıkırdağın kalsifiye ve kireçlenmemiş bölgelerini ayıran doğal olarak oluşan bir çizgi olan gelgit işareti boyunca bir çizgi çizin. Kalsifiye kıkırdağın subkondral kemikle buluştuğu kondro-osseöz kavşakta ikinci bir çizgi çizin (Şekil 1B). Kalsifiye kıkırdak alanı ölçümü otomatik olarak elde etmek için yazılım Alanı işlevini kullanın.
   3. Kalsifiye edilmiş kıkırdak alanını toplam kıkırdak alanından çıkararak kireçlenmemiş kıkırdak alanını hesaplayın (Şekil 1B).
3. Kondrosit sayısı ve fenotip tayini
   1. Matris üreten ve matris üretmeyen kondrositleri ayırt etmek için histomorfometri yazılımındaki ayarlar içinde ayrı sayma işlevleri oluşturun (Şekil 1B).
   2. Belirtilen fenotipifade her kondrosit üzerinde küçük bir nokta yapmak için kalem kullanarak kondrosit üreten veya üretmeyen matris lerin sayısını belirleyin(Şekil 1B).
      NOT: Hücreleri fenotiplerine göre ya matris üreten (yani güçlü Safranin-O boyama) veya matris üretmeyen (yani çok sönük veya safranin-O boyama olmadan) olarak sayın.
4. Tibial eklem yüzey çevresinin ölçümü
   1. Tibial kıkırdak yüzeyinde bir çizgi izleyerek mutlak tibial eklem yüzeyi çevresini ölçün, bireysel fibrilasyonları dikkatlice tanımlayın(Şekil 1C).
   2. Her bölümün düzlemi için bir iç kontrol görevi görmek için gelgit işareti boyunca ikinci bir çizgi çizin(Şekil 1C).
   3. Tibial eklem yüzeyi fibrilasyon indeksi gelgit işareti çevre ile tibial artiküler yüzey çevre bölerek hesaplayın.
      NOT: Gelgit çeşnisi genellikle numuneler arasında eşittir, bu nedenle sahte ve DMM arasındaki eklem yüzeyi çevreleri arasındaki fark, mutlak çevre veya fibrilasyon indeksi kullanılıp kullanılmadığı genellikle küçüktür.
5. Subkondral kemik ve ilik uzay alanlarının ölçümü
   1. Subkondral kemik içindeki toplam ilik uzay alanını belirlemek için subkondral bölgedeki bölgeleri sadece hematoksilin ile boyanmış (yani Fast Green için negatif) sıralayarak Alan işlevini kullanarak subkondral ilik uzay alanını ölçün. Tibial subkondral kemik içindeki tüm ilik uzayının toplam alanını belirlemek için bu alanların çevresine çizgiler çizin (Şekil 2B).
   2. Kondro-osseous kavşak ve büyüme plakasının üstün sınırı arasındaki bölgeyi özetleyerek, anterior ve posterior osteofit bölgelerine yanal olarak uzanan bölge işlevini kullanarak toplam subkondral alanı ölçün(Şekil 2B).
   3. Subkondral kemik iliği uzay alanını total subkondral alandan çıkararak subkondral kemik alanını hesaplayın (Şekil 2B,C).
6. Anterior ve posterior osteofit alanlarının ölçümü
   1. Osteofit alanını ölçmek için, Alan fonksiyonunu kullanarak proksimal tibianın ön ve posterior osteofitlerini takip edin (Şekil 2B,E,F).
      NOT: Osteofitler eklem kıkırdağı ile büyüme plakası, subkondral bölgeye anterior veya posterior arasında şekil veren kemikli projeksiyonlardır. Tibianın ön ve arka tarafındaki osteofit alanlar subkondral kemiğin ön veya posterior bölgesinin izlenmesi ile belirlenir. Osteofitler ve subkondral kemik arasındaki kavşak açıkça eklem kıkırdağı büyüme plakasına kadar uzanan hücrelerin bir çizgi ile belirlenir. Osteofit ve sinovyum arasındaki kavşak kemik ve fibröz doku arasındaki geçiş ile tanımlanır.
7. Sinovyal kalınlığın ölçülmesi
   1. Femur üzerindeki ön sinovyumun iç ekleme noktasından menisküs üzerindeki bağlanma noktasına doğru bir çizgi çizerek Alan işlevini kullanarak ön femoral sinovyal kalınlığı ölçün (Şekil 3B).
   2. Femur üzerindeki sinovyumun dış sineğinden menisküse olan ekine doğru ikinci bir çizgi çizin (Şekil 3B).
   3. Toplam sinovyal alanı sinovyal çevreye bölerek sinovyal kalınlığı hesaplayın.

8. İstatistiksel analiz

1. Ölçülen parametreleri toplayın ve her örnek için üç temsili bölümden elde edilen sonuçları ortalama. Üç veya daha fazla grubu karşılaştırmak için iki grubu veya tek yönlü ANOVA'yı karşılaştırmak için eşlenmemiş bir Öğrencinin t-testini kullanarak verileri analiz edin.
2. Verileri ortalama ± standart hatası olarak görüntüleyin.
   NOT: P ≤ 0.05'te istatistiksel anlamlılık elde edildi.

DMM'ye bağlı OA artiküler kıkırdak dejenerasyonu ve kondrosit kaybı ile sonuçlanır
DMM'ye bağlı OA, yüzey erozyonu ve kıkırdak kaybı ile belirgin bir şekilde karakterize olan sahte farelere göre artmış OARSI skoru ile sonuçlanmıştır(Şekil 1A,D). Burada ayrıntılı olarak açıklanan histomorfometri protokolü, toplam kıkırdak alanında ve kireçlenmemiş kıkırdak alanında azalma da dahil olmak üzere çeşitli OA ile ilişkili değişiklikler tespit etti (Şekil 1A,B,E,G); toplam kondrosit sayısında azalma; ve, daha da önemlisi, kondrosit üreten matris kaybı (Şekil 1H,I). Erozyonun şiddetini gösteren eklem yüzeyindeki değişiklikler kıkırdak fibrilasyon indeksi kullanılarak değerlendirildi. Genel olarak, DMM farelerde fibrilasyon indeksi artmıştır (Şekil 1C,K,L). Ancak protokolde anlatıldığı gibi kıkırdak yüzeyinin tamamen erozyona uğraması nedeniyle fibrilasyon indeksi son evre OA'da düşebilir. Fibrilasyon indeksindeki artış, OA gelişimi ve ilerlemesi sırasında eklem kıkırdağı yüzeyinin dejenerasyonunu belirtir. Bu sonuçlar histomorfometrik analiz programının OA ilerlemesini karakterize eden patolojik kıkırdak değişikliklerini tespit etme ve ölçme yeteneğini vurgulamaktadır.

DMM'ye bağlı OA'daki diğer eklem değişikliklerinin değerlendirilmesi
OA kıkırdak dışındaki eklem dokularını etkiler ve bu dokularda patolojik değişiklikler hastalığın ilerlemesinde önemli bir rol oynamaktadır. Burada açıklanan histomorfometrik analiz yönteminde subkondral kemik bölgesinde bir artış ve DMM farelerde kemik iliği alanının azalması saptanmış(Şekil 2A–D), subkondral kemik sklerozunu gösteren29,30. Hem anterior hem de posterior osteofit alanları da DMM farelerde artmıştır (Şekil 2E,F), yaralanma yerinde eklem yükleme değişiklikleri işlemek için bir kompansatör mekanizması olarak hareket eden devam eden bir subkondral kemik remodeling düşündüren29,30.

Sinovyumhistomorfometrik analizi DMM farelerde artmış sinovyal kalınlığı gösterdi (Şekil 3A–C), Hangi OA ilişkili sinovyal inflamasyon tipik bir sonucudur ve eklem boşluğuna inflamatuar sitokinlerin difüzyon11,12,31,32,33,34.

OARSI skorlaması ile histomorfometri arasındaki kullanıcı arası değişkenliğin analizi
Şekil 4A, kireçlenmemiş kıkırdak alanının(Şekil 4A)histomorfometrik analizinin ve OARSI skorunun(Şekil 4B)önemli bir kullanıcı arası değişkenliğini göstermez. Ancak histomorfometrik analiz, gözlemciler arasında -0.0001179-0.00120 arasında son derece düşük bir ortalama farkı göstererek üç gözlemci tarafından elde edilen sonuçların neredeyse tam bir çakışmasına yol açarak, oarsi skorunda -0.3-0.3 arasında değişen ortalama fark ın O2 ve O3 değerlerinden net bir sapma ile daha yüksek olduğunu göstermiştir.

Şekil 1: Sahte cerrahi ve DMM farelerden tibial eklem kıkırdağının histomorfometrisi ve artiküler kondrosit fenotipleri. (A) Safranin-O/Hızlı Yeşil ile boyanmış tibial eklem yüzeyi. (B) Toplam kıkırdak bölgesini ve kalsifiye kıkırdak alanını (turuncu) izlemek için histomorfometrik analiz kullanılmıştır. Gelgit bölgesinden daha üstün olan kıkırdak, kireçlenmemiş kıkırdak (yeşil) olarak hesaplanmıştır. Matris üreten kondrositler (beyaz) ve matris üretmeyen kondrositler (macenta) kireçlenmemiş kıkırdak alanı içinde sayıldı. (C) Tibial eklem yüzeyi çevresi, fibrilasyon indeksini belirlemek için eklem yüzeyinin (mavi çizgi) izlenmesi ve ardından gelgit işaretinin (mor çizgi) izlenmesiyle ölçüldü. (D) DMM farelerde OARSI skoru artmıştır. (E–L) Nicel kıkırdak alanlarının ve kondrosit sayımlarının grafiksel gösterimi sham ve DMM farelerden sayılır. Sahte farelerile karşılaştırıldığında, DMM fareler total tibial kıkırdak alanı(E),tibial kalsifiye kıkırdak alanı(F),tibial kireçlenmez kıkırdak (G), tibial total chondrocyte sayısı (H), tibial matris üreten kondrositler, (I) ve tibial matris olmayan kondrositler(J)azalmıştır. Sahte farelerile karşılaştırıldığında, DMM fareler tibial eklem yüzey çevresi artmış (K) ve artmış tibial artiküler yüzey fibrilasyon indeksi(L). Görüntüler 10x büyütme kullanılarak alınmıştır. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 ve ****P < 0.0001 welch düzeltme si ile eşleşmemiş t-testi kullanılarak, değerler ortalama SEM ± olarak ifade edilir; n = 5/grup. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Sham cerrahisi ve DMM farelerden subkondral kemik iliği bölgesi ve subkondral kemik bölgesihistomorfometrisi. (A) Tibial artiküler kıkırdak ve subkondral kemik Safranin-O/Fast Green ile boyanmıştır. (B) Subkondral kemik iliği alanları (yeşil), subkondral kemik alanı (macenta), anterior osteofit alanı (sarı) ve posterior osteofit alanı (gri) bilgisayarlı histomorfometri yazılımı ile izlendi. (C–F) Sahte ve DMM fareler için histomorfometrik alanlar grafisi. Sahte fareler ile karşılaştırıldığında, DMM fareler artmış tibial subkondral kemik alanı vardı (C) ve tibial anterior ve posterior osteofit alanları(E–F), yanı sıra azalmış tibial subkondral kemik iliği alanı sahte farelere göre (D). Görüntüler 4x büyütme kullanılarak alınmıştır. *P < 0.05, **P < 0.01 Welch düzeltme ile eşleşmemiş t-testi kullanarak. Değerler ortalama ± SEM olarak ifade edilir; n = 5/grup. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Sham cerrahisi ve DMM farelerden sinovyum histomorfometrisi. (A) Safranin-O/Hızlı Yeşil ile boyanmış sinovyum. (B) Sinovyal kalınlık, tibiofemoral eklemin ön kısmındaki anterior meniskofemoral sinovyal membranın (yeşil) izlenmesi ile ölçüldü. (C) Bilgisayarlı histomorfometri yazılımı kullanılarak sinovyal kalınlık ölçümlerinin grafikgösterimi. DMM fareler, sahte farelere göre daha fazla sinovyal kalınlığa sahipti. Görüntüler 20x büyütme alınmıştır. P < 0.001 Welch düzeltme ile eşleşmemiş t-testi kullanılarak, değerler ortalama ± SEM olarak ifade edilir; n = 5/grup; S = sinovyum; F = femur; ve M = menisküs. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: OARSI puanlamasında histomorfometrik analizde kullanıcı içi değişkenlik. (A) Üç kör gözlemci (O1, O2, O3) tarafından histomorfometri kullanılarak elde edilen kireçlenmemiş kıkırdak alan ölçümleri. (B) OARSI, kör üç gözlemciden elde edilen sahte ve DMM fareler için puanlanır. Noktalı çizgiler her grup için ortalama değeri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Safranin-O ve Hızlı Yeşil lekeli fare tibiofemoral eklem bölümlerinin histolojik analizi. (A) Tibiofemoral eklemin 4x büyütme görüntüsü. Odak alanları etiketlenir. (B) Tibiofemoral eklem Yatırım Getirisi 10x büyütme görüntü. Tibial ve femoral yüzeylerin yanı sıra anterior ve posterior meniskal boynuzlar görselleştirilmiştir. Menisküs ler yaklaşık olarak aynı boyuttadır ve görüntüleme yatırım getirisi eklem bölmesi üzerinde ortalanır. (C) Proksimal tibial yüzeyin 40x büyütme görüntüsü. Tidemark hattı kireçlenmemiş ve kalsifiye edilmiş kıkırdak bölgeleri arasındaki çizgi olarak etiketlenir. Osteokondral kavşak kalsifiye kıkırdak sonu ve subkondral kemik başlangıcı arasında etiketlenir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: Histomorfometri sistemi kurulumu ve kamera beyaz dengesi kalibrasyonu. (A) Fare tibiofemoral eklem beyaz dengesi ayarlanmadan yazılım penceresinde 4x büyütme görselleştirilmiş. Beyaz dengesini ayarlamak için ekranın üst kısmındaki kamera ayarları sekmesine ve açılır menüdeki seçimi not edin. (B) Fare tibiofemoral eklem 4x büyütme beyaz dengesi seti ile. Ölçüm yaparken tibiofemoral eklemin belirli alanlarını ayırt etme yeteneğini artırarak, numunenin renklendirme ve boyama sındaki değişikliğe dikkat edin. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 3: Histomorfometrik analiz ölçümlerinden önce histomorfometrik yazılımın kurulumu. Histomorfometrik yazılım penceresinin temsili ekran görüntüsü. Lekeli fare diz bölümü ölçüm bölgesinde (sarı ızgara) ortalanır ve mikroskopta kullanılan hedefe uyacak şekilde bölge için doğru büyütme ölçeği seçilir (ekranın sağ üst köşesinde kırmızı daire şeklinde). Parametrelerlistesi görüntüleme ve ölçüm alanının sağındaki sütunda görüntülenir. Bir parametre seçilmesi parametreyi vurgular, bu nedenle tibial fibrilasyon şu anda ölçülmek üzere seçilir. Pencerenin altındaki Özet Veri sekmesi, her bir örnek için her bir parametre için ölçümlerin düzenleneceği ve her bir bölüm için her parametre ölçümütamamlandıktan sonra dışa aktarılmak üzere kaydedildiği yerdir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Hiçbiri