Palmitoylation geri dönüşümlü bir şekilde hedef proteinlerin sistein artıkları için 16 karbon palmitate moiety dahil gerektirir. Burada, fare beyin lysates ilgi herhangi bir protein palmitoylation durumunu araştırmak için, bir biyokimyasal yaklaşım, asil-PEGyl değişim jel vardiya (APEGS) tsay açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Beyin Zarı Proteinlerinin Palmitoylarasyonunun Kantitatif Tayini için Acyl-PEGyl Exchange Jel Shift Tayini
Bu makalede
Özet
Özet
Postsinaptik yoğunluk (PSD) içindeki sinaptik AMPA reseptörlerinin (AMPA) düzeylerindeki aktiviteye bağlı değişikliklerin öğrenme ve hafıza için hücresel bir mekanizmayı temsil olduğu düşünülmektedir. Palmitoylation ampa-Rs, yardımcı faktörler ve sinaptik iskeleler gibi birçok sinaptik proteinin lokalizasyonunu ve işlevini aktiviteye bağlı bir şekilde düzenler. AMPA'larla ilişki içinde olan ve sinaps gücünü düzenleyen, beyne özgü transmembran proteinlerini kodlayan dört genden oluşan sinaps farklılaşma (SynDIG) ailesini (SynDIG1-4) belirledik. SynDIG1, aktiviteye bağlı eksitatory sinaps gelişimi için önemli olan yan yana-transmembran bölgesinde 191 ve 192 pozisyonlarında bulunan iki sistein kalıntısında palmitoylatedtir. Burada, yenilikçi bir biyokimyasal yaklaşım tanımlamak, asil-PEGyl değişim jel shift (APEGS) tsay, ilgi herhangi bir protein palmitoylation durumunu araştırmak ve fare beyin lysates proteinlerin SynDIG ailesi ile yarar göstermek için.
Giriş
S-palmitoylation kararlı membran ilişkisi, protein ticareti ve protein-proteinetkileşimleridüzenleyen hedef proteinlerin geri dönüşümlü post-çevirisel modifikasyon 1. Palmitoyl acyltransferaz (PAT) enzimleri tarafından katalize edilen tiyoester bağlantısı ile sistein kalıntılarına 16 karbonlu palmitat moiety eklenmesini içerir. Beyindeki birçok sinaptik proteinler palmitoylated, AMPA-Rs ve PSD-95 dahil, bir aktiviteye bağlı bir şekilde istikrar düzenlemek için, lokalizasyon, ve fonksiyon2,3,4. PSD-95 gibi sinaptik silikatüritlik ile yardımcı faktörleri....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan prosedürleri Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından belirlenen yönergeleri takip ve California Üniversitesi, Davis Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Fare beyin zarlarının hazırlanması
- Bir giyotin aparatı kullanarak fareyi decapitate ve hızlı bir şekilde beyin dışarı diseksiyon (in <1 dk, mümkünse, diseksiyon işlemi sırasında oluşabilir palmitoylation değişiklikleri en aza indirmek için). 10 mL'lik homojenizasyon tamponu(Tablo 1)içinde bir cam homogenizer (~12 vuruş) buz üzerinde hemen homojenleştirin.
- Santrifüj 15 dk 1.400 x g 4 °C'de. Superna....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İlgi proteinine karşı antikorlarla immünoblotlama, HAM'in dahil olmadığı örneklere kıyasla hareket kabiliyetine göre fare beynindeki palmitoylated durumunu (non, tek başına, iki kat, vb.) ortaya çıkarır. Daha önce, SynDIG1'in ABE tsay6kullanarak iki yerde palmitoylated olduğunu göstermiştik; Ancak her iki sitenin de beyin dokusunda modifiye edilip edilmediği belirlenemedi. Burada SynDIG1, SynDIG4/Prrt1 ve Prrt2'nin fare beyninde palmitoylat olduğunu ve iki potansiy.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Önceki çalışmamızda, SynDIG1'in stabiliteyi, lokalizasyonu ve fonksiyon6'yıdüzenlemek için aktiviteye bağımlı bir şekilde iki korunmuş yan yana transmembran Kis kalıntısı (tüm SynDIG proteinlerinde bulunan) palmitoylated olduğunu göstermek için ABE tsayını kullandık. Bir sınırlama ABE tahlil avidin moieties prosedürün son adım olarak konjuge agarose reçine ile yakınlık arınma gerektirir, kantitatif analiz karmaşık sinyal önemli kaybına neden. Ayrıca, ABE tsay bir protein palmitoylated bir kez veya.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Yazarlar tavsiye ve APEGS tayini üzerinde giriş için K. Woolfrey teşekkür ederim. Bu çalışmalar, Whitehall Vakfı ve NIH-NIMH'den (1R01MH119347) E.D.'ye yapılan araştırma hibeleri ile finanse edilmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Hidroksilamin (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Metoksi-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Mikrofüj | Eppendorf | 5415R | veya eşdeğeri ekipman |
| N-etilmalemid (NEM) | Calbiochem | 34115 | Son derece zehirlidir. |
| Dansitometri için optik görüntüleyici | Azure Biosystems | Safir Biyomoleküler Görüntüleyici | veya eşdeğer ekipman |
| Kapaklı polipropilen tüpler | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serolojik pipetler (cam) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Masa üstü santrifüj | Beckman | Allegra X-15R | veya eşdeğeri ekipman |
| Tris (2-karboksietil) fosfin-hidroklorür (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
Kaynaklar
- Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins? FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
- Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
