Beyin Zarı Proteinlerinin Palmitoylarasyonunun Kantitatif Tayini için Acyl-PEGyl Exchange Jel Shift Tayini

S-palmitoylation kararlı membran ilişkisi, protein ticareti ve protein-protein^{etkileşimleri}düzenleyen hedef proteinlerin geri dönüşümlü post-çevirisel modifikasyon 1. Palmitoyl acyltransferaz (PAT) enzimleri tarafından katalize edilen tiyoester bağlantısı ile sistein kalıntılarına 16 karbonlu palmitat moiety eklenmesini içerir. Beyindeki birçok sinaptik proteinler palmitoylated, AMPA-Rs ve PSD-95 dahil, bir aktiviteye bağlı bir şekilde istikrar düzenlemek için, lokalizasyon, ve fonksiyon^2,3,4. PSD-95 gibi sinaptik silikatüritlik ile yardımcı faktörlerin etkileşimi yoluyla PSD sinaptik AMPAR düzeylerinde değişiklikler sinaptik plastisite altında; böylece sinaptik proteinlerin palmitoylation durumunu belirleme yöntemleri sinaptik plastisite mekanizmalarına önemli bir bakış açısı sağlar.

Daha önce,^ampaper5 ile ilişkilendirmek beyin özgü transmembran proteinleri kodlama dört gen (SynDIG1-4) SynDIG aile tespit . Aşırı ekspresyon veya parçalanmış sıçan hipokampal nöronlar SynDIG1 knock-down artar veya azalır, sırasıyla, AMPA-R sinaps boyutu ve sayısı ~ 50% olarak immünositokimya ve elektrofizyoloji kullanılarak tespit⁵. Biz syndig1 iki korunmuş yan yana transmembran Cys kalıntılar (tüm SynDIG proteinlerde bulunan) bir aktiviteye bağlı bir şekilde istikrar, lokalizasyon ve fonksiyon⁶düzenlemek için palmitoylated olduğunu göstermek için acyl-biotin değişimi (ABE) tsay kullanılmıştır. ABE tsay modifikasyon ve sonraki yakınlık saflaştırma⁷tarafından korunan sistein biotin değişimi dayanır. Burada, yenilikçi bir biyokimyasal yaklaşım tanımlamak, acyl-PEGyl döviz jel vardiya (APEGS) tsay^8,9,10,11,^12,hangi yakınlık arınma gerektirmez ve bunun yerine ilgi bir protein için modifikasyon sayısını belirlemek için jel hareketlilik değişiklikleri kullanır. Protokol, fare beyninden gelen ve uygun antikorların bulunduğu endojen membran proteinlerinin araştırılması için tanımlanmıştır.

Tüm hayvan prosedürleri Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından belirlenen yönergeleri takip ve California Üniversitesi, Davis Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Fare beyin zarlarının hazırlanması

1. Bir giyotin aparatı kullanarak fareyi decapitate ve hızlı bir şekilde beyin dışarı diseksiyon (in <1 dk, mümkünse, diseksiyon işlemi sırasında oluşabilir palmitoylation değişiklikleri en aza indirmek için). 10 ml'lik homojenizasyon tamponu(Tablo 1)içinde bir cam homogenizer (~12 vuruş) buz üzerinde hemen homojenleştirin.
2. Santrifüj 15 dk 1.400 x g 4 °C'de. Supernatant'ı buz üzerinde yeni bir tüpe aktarın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 710 x g'de eşit homojenizasyon tamponu ve santrifüj hacminde peleti (~6 vuruş) yeniden askıya alın.
3. 4 °C'de 20 dakika boyunca 40.000 x g'de 1.2 adımve santrifüjdeki süpernatanları birleştirin.
4. Supernatant atın (sitosolik fraksiyonu) ve homojenizasyon tampon peletli membran (P2) fraksiyonu resuspend.
   NOT: Numuneler daha sonra kullanılmak üzere -80 °C'de dondurulabilir ve saklanabilir.
5. Protein düzeylerini quantitate için bir bicinchoninic asit (BCA) tsay gerçekleştirin. APEGS ttübünü 1,5 mL'lik bir tüpte 470 μL tampon A(Tablo 1)hacminde ~100−200 mg protein (maksimum 250 mg) ile başlayın. İzole ve santrifüj >13.000 x g 10 dk 25 °C'de çözünmez proteini çıkarmak için. Çözünen proteini yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.

2. Acyl-PEGyl değişim jel-shift (APEGS) teşp

1. Disülfür bağlarını bozun ve serbest sisteinları engelleyin.
   1. 25 mM tris (2-karboksitil)fosfin (TCEP; 25 μL, bir stok çözeltisinden eklenen) kuluçkaya yatarak disülfür bağlarını bozar; Tablo 1) 55 °C'de 60 dk.
   2. 50 mM N-etilmaleimid (NEM; 12.5 μL, bir stok çözeltisinden eklenen) bloksuz sisteinlar; Tablo 1) 3 saat oda sıcaklığında.
      NOT: Reaksiyon bir gecede uzatılabilir.
2. Kloroform metanol (CM) yağış gerçekleştirin.
   1. Protein çözeltisini 1,5 mL'lik tüpten, sallanan kova rotorunda mütevazı bir hızda santrifüj edilebilen polipropilen veya cam tüpe aktarın. 5 mL'lik bir tüp idealdir. Dört cilt (2 mL) metanol (MeOH) ve girdap kısaca ekleyin.
   2. Kloroform ve girdap kısa bir süre iki cilt (1 mL) ekleyin.
   3. Üç cilt (1,5 mL) dH₂O ve girdap kısaca ekleyin.
   4. Numuneleri 3.000 x g'de 25 °C'de 30 dk'da sallanan bir kova rotoruile santrifüj edin.
   5. Üst fazı dikkatlice çıkarın ve atın.
   6. MeOH 3 cilt (1,5 mL) ekleyin ve opak protein gözleme parçalamak için dikkatli olmak, hafifçe ama iyice karıştırın.
   7. 3.000 x g'de 25 °C'de sallanan bir kova rotorunda 10 dakika boyunca santrifüj.
   8. Bir cam serolojik pipet kullanarak, protein gözleme rahatsız etmeden mümkün olduğunca üst faz ın çok çıkarın.
   9. Peleti 1 mL MeOH ile dikkatlice durula.
   10. Hava en az 10 dakika pelet kuru.
       NOT: Kurutulmuş pelet -20 °C'de saklanabilir.
3. Palmitoyl-tiyoester bağlantılarının hidroksilin (NH₂OH, HAM) bölünmesini gerçekleştirin.
   1. Resuspend protein ankesür 125 μL tampon A ve sonicate kısaca. Çözünmez malzemeyi çıkarmak için 25 °C'de 10 dk için >13.000 x g'de santrifüj. Çözünen proteini yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
   2. 375 μL arabellek H (HAM+; Tablo 1) veya tampon T (HAM-; Tablo 1) ve 25 °C'de 60 dk kuluçka numuneleri.
4. Adım 2.2'de açıklanan CM yağışını tekrarlayın.
   NOT: Kurutulmuş pelet -20 °C'de saklanabilir.
5. Korumasız sisteinlara mPEG ekleyin.
   1. 10 mM TCEP içeren arabellek A 100 μL resuspend pelet. 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
      NOT: CM yağış basamakları sırasında önemli miktarda protein kaybı nın meydana gelmiş olması normaldir. Sonraki tüm adımlar 1,5 mL'lik bir tüpte gerçekleştirilecektir ve protein hacmi maksimum ~120−130 μL'ye kadar kısıtlanacaktır. Bu son CM yağış sırasında protein kaybını azaltacaktır.
   2. 20 mM mPEG-5k ekleyin (25 μL, bir stok çözeltisinden eklendi; Tablo 1) protein numunesi ve pipetleme ile karıştırın. 25 °C'de 60 dakika boyunca inkübün ve uç abitrotasyon.
   3. Dahil edilmemiş mPEG-5k'yi kaldırmak için, bu ayarlanmış hacimleri kullanarak adım 2.2'de açıklandığı gibi CM çökeltme gerçekleştirin: 4 birim MeOH (500 μL), 2 birim kloroform (250°L) ve 3 cilt dH₂O (375°L). 25 °C'de 10 dk için >13.000 x g'de santrifüj.
   4. Kalın, flocculent gözleme kaçınarak, daha önce olduğu gibi dikkatle üst faz kaldırın. MeOH 1 mL ekleyin ve yavaşça ama iyice karıştırın. 25 °C'de 10 dk için >13.000 x g'de santrifüj.
   5. Supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve 1 mL MeOH ile peleti durula. 25 °C'de 10 dk için >13.000 x g'de santrifüj. Hava kuru pelet.
      NOT: Kurutulmuş pelet -20 °C'de saklanabilir.
   6. Kurutulmuş peleti 50 μL tampon A'da yeniden askıya alın (TCEP veya herhangi bir azaltma maddesi olmadan). BCA protein niceliği için 5 μL ayırın. Sayısallaştırmadan sonra, uygun miktarda 4x Laemmli numune tamponu ekleyin ve ilgi proteinine bağlı olarak numuneyi 10 dakika boyunca 70−100 °C'ye ısıtın.
      NOT: Kaynama bazı membran proteinlerinin toplanmasına neden olabilir.

3. PEGylated proteinlerin Batı leke analizi

1. Numuneyi sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforezine (SDS-PAGE) yükleyin^13.
   NOT: Bu protokolde %10 poliakrilamid kullanılmıştır.
2. Batı lekeleme¹⁴için standart ayırma, aktarım ve algılama protokolleri kullanın.
3. Pegylated ve nonPEGylated proteinlerin göreceli miktarlarını belirlemek için densitometri¹⁴ kullanın.

İlgi proteinine karşı antikorlarla immünoblotlama, HAM'in dahil olmadığı örneklere kıyasla hareket kabiliyetine göre fare beynindeki palmitoylated durumunu (non, tek başına, iki kat, vb.) ortaya çıkarır. Daha önce, SynDIG1'in ABE tsay6kullanarak iki yerde palmitoylated olduğunu göstermiştik; Ancak her iki sitenin de beyin dokusunda modifiye edilip edilmediği belirlenemedi. Burada SynDIG1, SynDIG4/Prrt1 ve Prrt2'nin fare beyninde palmitoylat olduğunu ve iki potansiyel palmitoylation bölgelerine sahip olduklarını gösteriyoruz(Şekil 1). İlginçtir, her protein fare beyninde olmayan için sinyaldayalı farklı bir palmitoylation durumu vardır, tek başına ve iki kat palmitoylated protein. Lekelerin densitometri analizi palmitoylated durum hakkında nicel bilgi sağlar.

Şekil 1: Fare zarı preparatlarında PEGylated protein türlerinin saptanması. Fare beyinleri hızla kesildi ve hemen homojenize edildi. P2 membran fraksiyonları bu protokolde açıklandığı gibi APEGs testine tabi tutulmuştur. Bu deneyde doğum sonrası gün 18 (P18) SDS-PAGE jeli kullanılarak ayrılmış ve syndig1 (SD1), Prrt2 ve SynDIG4 (SD4) karşı antikorlarla incelenmiştir. Semboller palmitoylated olmayan proteini gösterir (•), palmitoylated tek il (*), ya da iki kat (**). HAM (-) koşullarında soluk bantların varlığı ya disülfür bağlarının eksik azaldığını ya da NEM tarafından serbest sisteinların eksik tıkandığını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: APEGS tarar için kullanılan çözümler. Homojenizasyon tamponu ve tampon A önceden hazırlanabilir; ancak, proteaz inhibitörleri ve fenilmetilsülfonil florür ekleyin (PMSF) hemen kullanmadan önce. Diğer tüm çözümler taze olarak hazırlanmalıdır.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.