Yöntem makalesi

C. elegans RAN Peptid Toksisitesi Ölçme

DOI:

10.3791/61024

⸱

30 Nisan 2020

 ,  ,  , 
1Graduate Program in Cell Biology and Molecular Physiology, University of Pittsburgh, 2Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tekrarla ilişkili olmayan ATG bağımlı çeviri ürünleri, tekrarlayan genişleme tabanlı hastalıkların patojenik özellikleridir. Açıklanan protokolün amacı, c. elegansmodel sisteminde davranışsal ve hücresel tahliller kullanarak bu peptidlerin neden olduğu toksisiteyi değerlendirmektir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans yaygın olarak amiyotrofik Lateral Skleroz (ALS) ve Huntington hastalığı gibi tekrarlayan genişleme mutasyonlarının neden olduğu yaşa bağlı nörodejeneratif hastalıkların modelini yapmak için kullanılır. Son zamanlarda, tekrar genleşme içeren RNA'nın, tekrarla ilişkili olmayan AUG bağımlı (RAN) çevirisi olarak adlandırılan yeni bir protein çevirisi nin substratı olduğu gösterilmiştir. Kanonik çevirinin aksine, RAN çevirisi başlangıç kodonu gerektirmez ve yalnızca yinelemeler bir eşik uzunluğunu aştığında oluşur. Okuma çerçevesini belirlemek için başlangıç kodonu olmadığından, RAN çevirisi hem duyu hem de antisense RNA şablonlarından yineleme genişletme dizisi içeren tüm okuma karelerinde oluşur. Bu nedenle, RAN çeviri bir den altı olası hastalık ile ilişkili toksik peptidlerin sayısını genişletir. Şimdiye kadar, RAN çeviri sekiz farklı tekrar genişleme tabanlı nörodejeneratif ve nöromüsküler hastalıklarda belgelenmiştir. Her durumda, hangi RAN ürünlerinin toksik olduğu ve toksisite mekanizmalarının deşifre edilmesi, bu peptidlerin hastalık patofizyolojisine nasıl katkıda bulunduğukonusunda kritik bir adımdır. Bu yazıda, model sistemi C. elegansRAN peptidlerin toksisitesini ölçmek için stratejiler sayılmiyoruz. İlk olarak, gelişmekte olan C. elegansbüyüme ve hareketlilik RAN peptid toksisitesi ölçmek için prosedürleri açıklar. İkinci olarak, RAN peptidlerinin hareketlilik üzerindeki postgelişimsel, yaşa bağlı etkilerini ölçmek için bir tetkik ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Son olarak, ran peptidlerin nöron morfolojisi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için bir nörotoksisite tetkiktarif. Bu tahliller RAN peptid toksisitesi geniş bir değerlendirme sağlamak ve hastalık mekanizmaları veya tedavileri tanımlamak için büyük ölçekli genetik veya küçük molekül ekranları gerçekleştirmek için yararlı olabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA tekrar dizilerinin uygunsuz genişlemesi amiyotrofik lateral skleroz (ALS), frontotemporal demans (FTD) ve Huntington hastalığı (HD)1gibi birçok nörodejeneratif hastalığın genetik temelini oluşturur. Bu hastalıklar için hücresel ve hayvansal modeller kurulmuş olmakla birlikte, bu koşulların altında yatan mekanizmalar iyi tanımlanmamıştır. Örneğin, HD Huntingtin protein Htt2için kodlama dizisinde bir CAG tekrar dizisinin genişlemeleri neden olur. CAG amino asit glutamin kodlar çünkü, CAG tekrar genişleme sonuçları bir polyGlutamin ekleme, veya polyQ, Htt içinde dizi genişletilmiş polyQ proteinleri form uzunluğu- ve toksisite ile ilişkili yaşa bağlı protein agregaları3,4. Şaşırtıcı bir şekilde, iki yeni çalışmalar poliQ dizisinin uzunluğu HD hastalığı başlangıçlı ana sürücü olmadığını düşündürmektedir, poliQ bağımsız faktörler de hastalığa katkıda bulunabilir düşündüren5,6.

Olası bir poliQ-bağımsız mekanizma protein çeviri repeat a Associated Non-AUG bağımlı (RAN) çeviri7olarak adlandırılan yeni keşfedilen türü içerir. Adından da anlaşılacağı gibi, RAN çevirisi yalnızca genişletilmiş bir yineleme sırası olduğunda oluşur ve kanonik bir başlangıç kodonu gerektirmez. Bu nedenle, RAN çevirisi üç farklı polipeptid üretmek için yinelemenin üç okuma karesinde de gerçekleşir. Buna ek olarak, birçok gen de genişletilmiş tekrar dizisinin ters tamamlayıcı içeren bir antisense transkript üretmek çünkü, RAN çeviri de antisense transkript her üç okuma kareoluşur. Birlikte, RAN çevirisi genişletilmiş tekrar içeren DNA dizisinden üretilen protein sayısını bir peptitten altı peptide genişletir. Bugüne kadar, RAN çeviri en az sekiz farklı tekrar genişleme bozukluklarıgözlenmiştir 8. RAN peptidler postmortem hasta örneklerinde gözlenir ve sadece hastanın genişletilmiş tekrar ı taşıdığı durumlarda9,10. Bu peptidler hasta hücrelerinde açıkça mevcut olmakla birlikte, hastalık patofizyolojisine katkıları belirsizdir.

Daha iyi RAN peptidler ile ilişkili potansiyel toksisite tanımlamak için, çeşitli gruplar maya, sinek, fare ve doku kültürü hücreleri11,12,,13,14,15,16gibi çeşitli model sistemlerinde her peptid ifade var. Bu modeller, ifade için yineleme dizisini kullanmak yerine, yineleme sırasının ortadan kaldırıldığı ancak amino asit dizisinin korunduğu bir kodon varyasyonu yaklaşımı kullanır. Çeviri başlatma bir kanonik ATG yoluyla oluşur ve peptit genellikle n floresan protein erimiş- veya C-terminus, her ikisi de RAN peptid toksisitesi ile müdahale gibi görünüyor. Bu nedenle, her yapı tek bir RAN peptid aşırı ifade eder. RAN peptid toksisitesini ölçmek için basit tahliller ile çok hücreli bir organizmada farklı RAN ürünleri modelleme her hastalık neden tekrar genişleme farklı RAN ürünleri hücresel disfonksiyon ve nörodejenerasyon katkıda nasıl anlamak için hayati önem taşımaktadır.

Diğer model sistemleri gibi, C. elegans ran peptid toksisitesi gibi yeni hastalık mekanizmaları, çalışmalar sağlayan esnek ve verimli bir deneysel platform sağlar. Solucanlar şu anda RAN peptid toksisitesi diğer modellerde mevcut olmayan birkaç benzersiz deneysel özellikleri sunuyoruz. Birincisi, C. elegans doğuştan ölüme optik saydamdır. Bu RAN peptid ekspresyonu ve lokalizasyonu basit görselleştirme sağlar, hem de canlı hayvanlarda nörodejenerasyon in vivo analizi. İkinci olarak, RAN peptit ekspresyonu modelleri oluşturmak için transgenik yöntemler ucuz ve hızlıdır. C. eleganskısa üç günlük yaşam döngüsü göz önüne alındığında, bir hücre tipi özel bir şekilde herhangi bir RAN peptid ifade kararlı transgenik çizgiler bir hafta altında üretilebilir. Üçüncü olarak, basit henotipik çıkışlar, RAN peptid toksisitesi için gerekli genleri hızla tanımlamak için kimyasal mutagenez veya RNAi taraması gibi genetik tarama yöntemleri ile kombine edilebilir. Son olarak, C. elegans kısa ömrü (~ 20 gün) araştırmacılar nasıl yaşlanma belirlemek için izin verir, en tekrar genişleme hastalıkları için en büyük risk faktörü olan, RAN peptid toksisitesi etkiler. Birlikte, deneysel özellikleri bu kombinasyonu başka bir model sisteminde eşsiz ve RAN peptid toksisitesi çalışması için güçlü bir platform sunuyor.

Burada, RAN peptidlerinin toksisitesini ölçmek ve bu toksisitenin genetik değiştiricilerini belirlemek için C. elegans'ın deneysel avantajlarından yararlanan birkaç tahlilleri tanımlıyoruz. Kodon çeşitli ATG-başlatılan RAN peptidler GFP ile etiketlenir ve unc-47 organizatörü altında myo-3 organizatörü altında kas hücrelerinde ya da GABAerjik motor nöronlarda bireysel olarak ifade edilir. Kas hücrelerinde ifade için, toksik RAN peptidler yeşil floresan protein ile etiketlenir önemlidir (GFP), veya diğer floresan protein (FP) etiketi bir RNAi besleme vektörü ile hedeflenebilir. Toksik RAN peptid ekspresyonu genellikle büyüme engeller, bu tür suşları cansız hale olmasıdır. Gfp(RNAi) kullanımı koşullu OLARAK RAN peptid ekspresyonunu inaktive eder ve gerinim bakımı, genetik haçlar, vb. sağlar. Tahliller için, bu hayvanlar gfp kaldırılır (RNAi), RAN peptid ve ortaya çıkan fenotiplerin ifade sağlar. Kodon çeşitli RAN peptid ekspresyonu yapıları tasarlamak için moleküler stratejiye ek olarak, gelişimsel toksisite (larva hareketliliği ve büyüme tahlilleri), gelişim sonrası yaşla ilişkili toksisite (paralizi tahlil) ve nöron morfolojik defektleri (komissitöz tahlil) ölçmek için tahliller tanımlarız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kodon çeşitli RAN peptid ekspresyonu oluşturur oluşturma

  1. Temel tekrarlayan DNA/RNA yapısını ortadan kaldırmak ancak üstteki amino asit dizisini korumak için eşanlamlı kodonları kullanan tek tek RAN peptid kodlama dizisi tasarla.
  2. Özel kodon dizilerini ticari olarak çalışmalar için gerekli tekrarlanan uzunluklarda sipariş edin (genellikle 5-100 tekrar). 5' sonunda bir HindIII kısıtlama sitesi ve pPD95.79 gibi C. elegans ifade vektörleri, klonlama kolaylaştırmak için 3 ' ucunda bir BamHI kısıtlama sitesi ekleyin.
    NOT: Daha büyük yapıların sentezi zor çıkarsa, daha küçük yapı taşı dizileri sentezlenebilir ve daha sonra yönlü ligasyon stratejisi17kullanılarak daha büyük tekrarlar içine inşa edilebilir.
  3. Standart T4 ligasyon yöntemlerini kullanarak peptit dizisini C. elegans ekspresyon vektörüne batırın.
  4. Dokuya özgü RAN peptid-GFP ekspresyonunu yönlendirmek için RAN peptid dizisinin önünde PCR tarafından oluşturulan hücre tipine özgü bir organizatör dizisini alt edin.
  5. Standart yöntemler kullanarak ekstrakromozomal diziler içeren transgenik suşlar oluşturmak için yabani tip C. elegans gonad içine RAN peptid yapı mikroenjekte18. Bir co-enjeksiyon belirteci için, kas-spesifik RFP muhabiri(myo-3p::RFP (pCFJ104)) kullanılmıştır, ancak diğer belirteçler de kullanılabilir.
  6. Standart C. elegans entegrasyon tarama yöntemlerini kullanarak genoma kararlı bir transgeni entegre edin19.
  7. RAN peptid toksik ve transgenik hayvanlar hayatta yoksa, beslenen hayvanlar gfp (RNAi) toksik protein ifadesini susturmak için enjeksiyon öncesi ve sonrası bakteri ifade.
    NOT: Hayvanların gfp(RNAi) den çıkarılması, aşağıda açıklanan tahlilleri kullanarak phenotipik analizler için RAN peptid ekspresyonunu sağlar.

2. RNAi tabanlı gen nakavtaşağıdaki RAN peptidlerin gelişimsel toksisitesi ölçme: Video hız analizi protokolü

  1. Pour standart nematod büyüme orta (NGM) RNAi 24 iyi plakalar ile 1 mM izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ve 25 μg/mL karbenicillin.
  2. HT1115 bakterilerinde RNAi ile beslenen klonları Luria suyu (LB) + carbenicillin (25 μg/mL) agar plakaları üzerine test edilecek empty vector(RNAi) ve 37 °C'de 24 saat gfp(RNAi) boyunca bakteri yetiştirin.
  3. Her klon için, 1 mL LB + carbenicillin sıvı ortam içine tek bir koloni seçin ve dakikada 250 rotasyon (RPM) sallayarak 37 °C'de 18 saat boyunca bir gecede bakteri büyümek.
  4. NgM RNAI 24 kuyularının dört ayrı kuyusu ve aşağıdaki gece bakteri kültürlerinin 20°L'si: sütun 1 kuyu = gfp(RNAi); sütun 2 kuyu = (EV)RNAi; sütunlar 3-6 kuyu = RNAi genlere karşı test edilecek. RNAi bakterilerinin oda sıcaklığında (RT) bir gecede dsRNA üretimini indüklemesine izin verin.
  5. Standart hipoklorit yöntemini kullanarak entegre RAN peptid transgeni ifade eden birinci günlük yetişkin C. elegans yumurtaları izole edin ve ngm RNAi 24 kuyu nun her kuyusuna ~30 C. elegans yumurtaları yerleştirin.
  6. 24 kuyuyu 20 °C'de 7 gün kuluçkaya yatırın.
    NOT: Bu kuluçka süresi pr50 veya GR50 gibi toksik C9orf72 RAN dipeptidleri ifade eden suşlar içindir. Diğer suşları bakteriyel gıda kaynağı nın tükenmesi ve sonraki açlık önlemek için daha kısa kuluçka süreleri gerektirebilir.
  7. Leica AF video edinme yazılımı çalıştıran Windows uyumlu bir bilgisayara bağlı DFC345FX monokrom kamera ile donatılmış Bir Leica MZ16FA stereo diseksiyon mikroskobu kullanarak aktarılan ışık videoları edinin (sürüm 2.6.0.7266).
    1. Kuyular arasında tutarlı video edinme ayarlarını kullanarak her RNAi koşulu için iki ayrı kuyudan iki video edinin. Her video için, 18,6X büyütme (AF yazılımında 1,49 yakınlaştırma ayarı) kullanarak 800 x 600 piksel çözünürlükte 10 saniye ve saniyede 13,16 kare (zaman voxel boyutu = 0,076 saniye) edinin. Görüntü pozlama süresini 4 milisaniyeye ayarlayın. Her videoyu hemen zorlanma, RNAi durumu ve iyi numarasıyla etiketlayın.
  8. Videoların sırasını rasgele leştirerek ve videoların adını sayılarla değiştirerek, deneyciyi her video dosyasıyla ilişkili genotipi kör edin. Bu video grubunu yeni bir dosya olarak kaydedin. Analiz tamamlandıktan sonra deneycinin kör olmadığını.
  9. Her rnai durumu için toplam ~40 solucanı inceleyerek, her videodan 20 farklı hayvan için 'kat edilen mesafeyi' ve her hayvanın uzunluğunu ölçün.
    1. Yazılımda, ek açıklama araçları düğmesini, ardından metin aracını çiz'i seçin. Videonun ilk karesinde ölçülen solucanın merkezindeki bir noktaya tıklayın ve bir sayı olarak işaretleyin. Solucanın hareket yolunu görsel olarak izlerken videoyu sonuna kadar ilerletin. Son karede, solucanın ortasındaölçülen bir noktaya tıklayın ve bir sonraki karşılık gelen sayıyı işaretleyin. Daha sonra, draw scalebar aracını kullanarak, "kat edilen mesafeyi" kaydetmek için birinci sayıdan ikinci sayıya bir çizgi çizin.
    2. 'Mesafe kat landı' iki santrifüj noktası arasındaki mesafedir. Bu uzaklık ölçüm çizgisine bitişik olarak gösterilir. Bu ölçümü elektronik tabloya kaydedin. Analiz penceresindeki her bir ölçümü korurken videodaki diğer 19 solucan için bu ölçümü tekrarlayın.
  10. Hiçbir hareket göstermeyen ve verileri felce karşı önyargılı hale getirmekten kaçınmak için en sağlam hareketi sergileyen hayvanlardan ölçümler yapın. Ölçümler tamamlandıktan sonra, verilerin kaynağı olan hayvana kadar izlenabilmesi için tüm ölçüm çizgilerini gösteren son video çerçevesinin anlık görüntüsünü alın.
  11. Verileri dört sütunluk bir elektronik tablo kullanarak çözümle. Sütun bir solucan "tanımlayıcı", sütun iki mesafe / zaman (hız) katedilir.
    1. Her videonun zamanı, denemenin altındaki videoya sağ tıklayarak ve videonun özelliklerine giderek bulunabilir.
  12. Quantify'i seçerek her hayvanın uzunluğunu bularak hız ölçümünü normalleştirin, ardından yazılıma ilişkin istatistikler. Video ekranındaki ek açıklama aracı simgesine tıkladığınızda "Polyline Çiz" aracının kullanımına izin verilmelidir. Bu araç daha sonra videodan başın ucundan kuyruğun ucuna kadar C. elegans serbestçe izlemek için kullanılabilir. SatırUzunluğu istatistiklere göre kaydedilir.
    1. Verilerin kaynağındaki hayvana kadar izlenebilmeleri için C. elegans boyutlandırmak için kullanılan tüm poliline gösteren son video çerçevesinin anlık görüntüsünü alın.
  13. Elektronik tabloya iki ek sütun ekleyerek verileri çözümle. Üçüncü sütun "Hayvan Uzunluğu", dördüncü sütun ise "Normalleştirilmiş Hız" (hız/hayvan uzunluğu) 'dir. Normalleştirilmiş hız verilerini, boş vektöre (RNAi)karşı post-hoc testi ile tek yönlü bir ANOVA kullanarak analiz edin.

3. RAN peptidin gelişimsel toksisitesinin ölçülmesi: Büyüme teşbiti

  1. Bir gfp(RNAi), (EV)RNAi veya (gen-spesifik) 6 cm RNAi plakaüzerinde 50 μL hipoklorit çözeltisi (10 mL çamaşır suyu, 20 N NaOH 20 ML, 37,5 mL dH2O) içine ~ 30 gravid hayvan seçin.
  2. 24 saat sonra, hipoklorit çözeltisi noktasından sürünerek çıkan altı transgenik sinayı, hipoklorit solüsyonu tedavisine tabi tutuldukları plakadaki RNAi koşullarına benzer 6 cm'lik yeni bir RNAi plakasına taşıyın. Bu sineiyi (F1) 20 °C'ye koyup büyüyüp çoğalın.
  3. 24-48 h sonra, 6 cm RNAi üzerine 10 transgenik L4 hayvan almak RNAi koşullara uygun hayvanlar üzerinde büyüyen edilmiştir. Hayvanların 20 °C'lik bir kuluçka makinesinde 24 saat boyunca yumurtlamalarına izin verin.
  4. 24 saat sonra, yetişkin hayvanları çıkarın ve atın. Mekanik bir el sayacı kullanarak 24 saat boyunca yumurtlan yumurta ve L1 larvalarının sayısını sayın. Bu toplam kuluçka boyutudur.
  5. Sonraki 72 saat boyunca, L4 veya daha eski aşamaya ulaşan hayvan sayısını sayın. Her hayvan sayıldığından, tabaktan çıkarın.
  6. Toplam kuluçka boyutu dışında L4 veya daha eski aşamaya ulaşan hayvanların yüzdesi olarak "Yüzde Büyüme" ölçün.
  7. Yüzde büyümeistatistiksel olarak anlamlı olup olmadığını belirlemek için boş vektör (RNAi) karşı 2 x 2 Fisher'S tam test gerçekleştirin. Karşılaştırma için kategoriler "Büyüme" (72 h'de L4 veya daha eski aşamaya ulaşan hayvanların sayısı) ve "Büyüme Yok" (toplam kuluçka boyutu eksi 72 saat l4 veya daha eski aşamaya ulaşan hayvan sayısı).

4. Post-gelişimsel RAN peptid paralizi tetkik

  1. 6 cm gfp(RNAi) plakaüzerine 4-6 transgenik L4 yerleştirerek gfp(RNAi) üzerinde kas RAN peptid-GFP ifade entegre C. elegans transgenik suşları korumak ve 20 °C solucanlar büyümek.
  2. Eğer deney RAN peptid toksisitesi üzerindeki genetik etkileri test etmek için RNAi kullanıyorsa, 10 transgenik gravid yetişkini aç olmayan bir plakadan iki 6 cm boş vektöre(RNAi) (felç için pozitif kontrol, genetik etkiler için negatif kontrol), gfp(RNAi) (felç için negatif kontrol, genetik etkiler için pozitif kontrol), gen spesifik(RNAi) (yani, 6 cm plaka başına 10 gravid yetişkin) taşıyın.
  3. Mutantlar RAN peptid toksisitesi üzerindeki genetik etkileri analiz etmek için kullanılıyorsa, iki 6 cm'lik boş vektör(RNAi) veya gfp(RNAi) plakalarının her birine aynı RAN transgenini ifade eden 10 gravid WT veya mutant hayvan yerleştirin. Solucanları 20 °C'de 48 saat boyunca yetiştirin.
  4. 6 cm RNAi plakasından 10 adet transgenik L4 seti seçin ve her seti 3 cm'lik Bir RNAi plakası üzerine yerleştirin (yani, her genotip için n = 100 hayvan). Test için seçilen L4'lerin yüzeysel olarak normal hareketliliğe sahip olduğundan emin olun. Nemi korumak için plakaları fermuarsaklama çantasının içine yerleştirin.
  5. Torbalı plakaları L4'lü 25 °C'lik kuluçka makinesine yerleştirin.
  6. Rt'de bulunan süreyi en aza indirmek için hayvanları 25 °C'lik kuluçka makinesinden 24 saat sonra çıkarın.
  7. Hareketi kontrol etmek için kesişen mikroskoptaki plakalara dokunun. Hayvanlar bir vücut uzunluğundan daha fazla hareket ederse, hayvanı hareketli olarak sayın ve yeni bir 3 cm RNAi plakasına aktarın. Kalan solucanları kafaya veya kuyrukta kullanmak için platin bir kazma kullanın. Hayvan bir vücut uzunluğundan daha fazla hareket ederse, hayvanı hareketli olarak sayın ve yeni bir 3 cm RNAi plakasına aktarın.
    NOT: Transfer yaparken plaka başına 10 solucanı geçmeyin. Yeni RNAi plakasına doğru hareket eden bir atadan kaçınmaya dikkat edin, çünkü titreşme yalnızca yaşlı hayvanları takip etmeye bağlıdır.
  8. Hareket etmeyen solucanların tümlerini bir araya getirin, böylece vücut uzunluğundan daha fazla hareket kolayca tespit edilebilir. Birden fazla vücut uzunluğu taşımak için hayvan en az bir dakika verin. Hala hareket etmezse, felç olur, torbalanır (yani, larvalar annenin içinde yumurtadan çıkar) ya da ölüdür.
  9. Torbalama sergileyen, tabağın kenarlarında kurutucu, ekstrüzyon edilmiş bağırsaklar sergileyen, yuva yapan, kaybolan veya tespit sırasında tahttan ölen hayvanları sansürler. Felçli solucanlar sayılır, eski RNAi plakası üzerinde bırakılır ve atılır.
  10. 4.6-4.9 adımlarında açıklandığı gibi 5-7 gün boyunca her gün felç için hayvanlar puan.
  11. Paralizi verilerini, yaşam süresini analiz etmek için kullanılanla aynı olan günlük sıralama testiyle analiz edin. Bu istatistiksel analizde, hareketli solucanlar "Canlı" olarak puanlandırılır, felçli solucanlar "Ölü" olarak puanlanır ve ölü, torbalanmış, bağırsakları ekstrüzyon, kurutulmuş, yuvalanmış veya başka bir şekilde kayıp solucanlar "Sansürlü" olarak puanlanır.
    NOT: Bu analizde "Yüzde Canlı" sayısı "Yüzde Hareketli" hayvanları gösterir. Ters "Yüzde Felç" temsil eder. Günlük sıralaması istatistiksel analizleri gerçekleştirmek için çevrimiçi analiz aracı OASIS'i (https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/)kullanın.

5. Nöron patolojisi ölçme: Komissür titreci

  1. Transgenik C. elegans unc-47 organizatörü kullanarak GABAerjik nöronlar ilgi RAN peptid ifade oluşturun. Ayrıca ekspres unc-47p::GFP veya unc-47p::RFP GABA nöronların hücresel morfolojisi ortaya çıkarmak için.
  2. 50 transgenik L4 hayvan seçin ve 25 °C'de 24 saat boyunca 6 cm OP50 plaka üzerine yerleştirin.
  3. 50 transgenik hayvanı 25 °C'de 24 saat boyunca yeni bir 6 cm OP50 plakasına aktarın.
  4. Geniş alan mikroskopisi altında hayvanların görüntüleme için agarose pedleri olun.
    1. İki mikroskop slaytının üzerine iki parça bant yerleştirin. Bantlanmış iki slaytın ortasına bantsız temizlenmiş bir slayt yerleştirin.
    2. Tek kullanımlık steril transfer pipeti ile orta kaydırağa %3 erimiş agarose ~100 μL (tek kullanımlık plastik Pasteur pipetinden 1 damla) dağıtın.
    3. Hemen bantlı slaytlar üzerinde dayanıyor ve slaytlar arasında agarose ince ve çift bir tabaka oluşturur böylece erimiş agarose damla üzerinde ikinci bir temiz slayt yerleştirin.
    4. Agarose soğuduktan ve katıladıktan sonra, iki slaytı aralarında agarose tabakası ile dikkatlice çıkarın, ayırmadan ve altlarında nemli bir kağıt parçası olan plastik bir torbaya koyun. Üç ekstra slayt ile birlikte incelenecek 10 solucan başına bir slayt yapın.
  5. Transgenik C. eleganları 25 °C inkübatörden çıkarın ve 10 transgenik C. elegan'ı cam depresyon slaytında 100 mM levamisole'lık 100 μL'lik bir damlaya çıkarın. 10 dakika veya hayvanlar felç olana kadar kuluçka.
  6. Plastik torbadan bir slayt çiftini çıkarın ve dikkatlice ayırın. Slaytı genotip ile etiketlendirin ve agarose'un ortasına 10 mM levamisole'nin 2 μL'sini ekleyin. Agarose ped üzerinde levamisole içine 10 hayvan taşıyın. #1 kalınlığında kapak kayma ile hayvanları kaplayın.
  7. Vulvanın yönlendirildiği görüntü hayvanları hayvanın sağ tarafındadır. Vulva başın sol tarafında ise, motor nöronların commissures hayvanların altında olacak ve açıkça görünür değil, doğru niceleme zor hale. Bu hayvanlardan nicelik leri atla. Bu oryantasyonda, motor nöronların komissürleri kapak kaymalarına en yakın olan ve ters geniş alan floresan mikroskobunda açıkça görülebilir. 63X 1.4X NA yağ daldırma lensi ve Leica L5 GFP filtre seti (Ex480/40nm; Em527/30nm). Nöron commissures ifade RFP GFP yerine, bir Leica TX2 RFP filtre seti kullanmak (Ex560/40nm; Em645/75nm).
    1. 63x 1.4x NA yağ daldırma lensi ve GFP filtre seti (Ex480/40 nm; Em527/30 nm). Nöron commissures ifade RFP GFP yerine, kırmızı floresan protein (RFP) filtre seti (Ex560/40 nm; Em 645/75 nm).
  8. İmmobilizasyondan kaynaklanan toksisiteyi en aza indirmek için solucanların kapağını solucanların üzerine yerleştirdiktan sonra 45 dakika içinde solucanları görüntüleyin.
  9. Her solucan için, görünür iletişim sayısını sayın. Yabani hayvanlarda 16 görünür komissür vardır. Ayrıca, komissürlerde büyük boncuklar (örneğin, blebs) bulunan komissürlerin sayısını ve kırılan iletişim sayısını da sayın. Komissür'ün bozulduğunu doğrulamak için, odak düzlemini ayarlayarak dorsal kordondan ventral kabloya kadar komissureyi takip edin.
    NOT: Unc-47p::GFP floresanlarının bir boşluk sergilediği commissures kırık olarak kabul edilir. Kırık bir commissure genellikle mola her iki tarafında bir bleb vardır, commissures kırık olduğunu göstermek yardımcı. 20 solucan için kanama ve mola miktarını sayın.
  10. Her hayvan için gözlenen commissures toplam sayısı üzerinde blebs veya tatili ile commissures kısmını hesaplayın. Hayvan başına sayılan komissürlerin mutlak sayısı (yabani tip, blebbed ve kırık olaylar dahil) da ölçülebilir.
  11. Her kategori için ortalama ± SD'yi hesaplayın ve iki popülasyon arasında karşılaştırma için öğrencinin t-testi veya 3 veya daha fazla popülasyon arasındaki karşılaştırmalar için tek yönlü ANOVA ile istatistiksel olarak analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan tahlilleri, G4C2 tekrar genleşmesi olan ALS hastalarında bulunan RAN dipeptidlerinin toksisitesi üzerindeki farklı gen inhibisyonunun etkisini değerlendirmek için kullandık. Gelişimsel toksisiteyi ölçmek için büyüme testini kullanarak, kas ifade li PR50-GFP toksisitesinin genom genişliğindeki RNAi ekran bastırıcılarında tanımlanan birkaç genetik nakavt mutantının etkilerini analiz ettik. Tek başına PR50-GFP ifadesi tamamen penetrant büyüme durmasıile sonuçlanırken, çeşitli genlerdek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada kas veya C. elegansnöronlarda modellenmiş RAN peptid toksisitesi titretini saymak için kullanılabilecek yöntemleri rapor ediyoruz. Nörodejeneratif proteinler insan hastalarında bir yaş başlangıçlı fenotip olsa da, onlar da model sistemlerinde aşırı ifade zaman gelişimsel toksisite sergileyebilir. Aşırı ifadenin önemli yorumlayıcı sınırlamaları vardır, ancak aynı zamanda toksik fenotipleri tersine çevirebilen genleri veya ilaçları tanımlamayı amaçlayan genetik veya farmakolojik ekranlar için güçlü bir başl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NIH R21NS107797

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
35mm x 10mm Petri Kabı, SterilCELLTREAT Bilimsel Ürünler50-202-036Nematod büyüme plakaları ve RNAi
AGAR GRANÜL 2KILOGRAMBD TEŞHIS SISTEMLERINematod büyüme plakaları ve RNAi
AGAROSE ULTRA SAFYAŞAM TEKNOLOJİLERİRAN peptit transgenik suşları oluşturmak için mikroenjeksiyon
KARBENİSİLİN 5GTERMO SCI FAIRLAWN KİMYASALLARIBP26485Nematod büyüme plakaları ve RNAi
KAPAK CAMLARI NO 1 22MM 1OZ/PKTHERMO SCI ERIE12542BKomisyon tahlili için görüntüleme
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CSEPPENDORF KUZEY AMERIKA BIOTOOLSRAN peptit transgenik suşları oluşturmak için mikroenjeksiyon
FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPKTHERMO SCI ERIE125485CRAN peptit transgenik suşları oluşturmak için mikroenjeksiyon
Fisherbrand  Superfrost Plus Mikroskop SlaytlarıTHERMO SCI ERIE12-550-15Komissür testi için görüntüleme
Gibco  Bacto Peptone Gibco DF0118-17-0Nematod büyüme plakaları ve RNAi
HALOKARBON YAĞI 700SIGMA-ALDRICH INCH8898-50MLRAN peptit transgenik suşları oluşturmak için mikroenjeksiyon
IPTG BIOTECH 10GTHERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALSNematod büyüme plakaları ve RNAi
Leica Gelişmiş Floresan görüntüleme yazılımıLeica MicrosystemsLAS-AFVideo hız analizi ve komisyon tahlili için görüntü elde etme yazılımı
Leica Daldırma tipi N (Yağ)W NUHSBAUM INCKomisyon tahlili için
LEVAMISOL HİDROKLORÜR 10GRTHERMO SCI ACROS ORGANICSKomisyon tahlili için görüntüleme
MİKRO YÜKLEYİCİ İPUÇLARI 2 X 96 ADETEPPENDORF KUZEY AMERİKA BİYOTOOLSE5242956003RAN peptit transgenik suşları oluşturmak için mikroenjeksiyon

PETRI KABAĞI, 60X15MM, 500/CS		CORNING YAŞAM BİLİMLERİ PLASTİKNematod büyüme plakaları ve RNAi
DOKU KÜLT PLAKASI 24WEL 50/CSCORNING YAŞAM BILIMLERI DL87721Nematod büyüme plakaları ve RNAi
DF0145070 16500500 E5242952008 BP162010 NC9547002 görüntüleme AC187870100 FB0875713A

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders. Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).
  2. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  3. Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
  4. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  5. Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset. Cell. 178 (4), 887-900 (2019).
  6. Wright, G. E. B., et al. Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease. American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).
  7. Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease. Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).
  8. Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology. Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).
  9. Banez-Coronel, M., et al. RAN Translation in Huntington Disease. Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).
  10. Ash, P. E., et al. Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS. Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).
  11. Kramer, N. J., et al. CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity. Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).
  12. Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Scientific Reports. 6, 20877(2016).
  13. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  14. Boeynaems, S., et al. Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics. Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).
  15. Lee, K. H., et al. C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles. Cell. 167 (3), 717-788 (2016).
  16. Hao, Z., et al. Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR. Nature Communications. 10 (1), 2906(2019).
  17. Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences. BMC Biotechnology. 11, 87(2011).
  18. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  19. Rudich, P., et al. Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans. Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).
  20. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genetics. 5 (3), 1000399(2009).
  21. Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  22. Satyal, S. H., et al. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).
  23. Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans. PLoS One. 7 (3), 33494(2012).
  24. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  25. Peters, O. M., et al. Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice. Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).
  26. O'Rourke, J. G., et al. C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD. Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).
  27. Mizielinska, S., et al. C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins. Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).
  28. Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility. Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).
  29. Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

C elegans ModelRepeat Expansion DisordersVideo Speed AnalysisAge Dependent Paralysis AssayNeuron Morphology AssayRNAi ScreeningProteasome Subunit RPN7Insulin IGF Receptor DAF 2Commissure Assay

İlgili makaleler