Yöntem makalesi

Makromoleküler Kalabalık Kullanılarak İnsan Kutanöz Hipertrofik YaraNın In Vitro Modeli

DOI:

10.3791/61037

⸱

1 Mayıs 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Skin Research Institute of Singapore, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 2School of Chemical and Life Sciences, Singapore Polytechnic, 3Institute of Medical Biology, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, in vivo koşullarına benzeyen bir in vitro insan hipertrofik skar dokusu modeli oluşturmak için makromoleküler kalabalık kullanımını açıklar. Kalabalık bir makromoleküler ortamda ekili zaman, insan deri fibroblastlar fenotipleri, biyokimya, fizyoloji ve skar dokusu andıran fonksiyonel özellikleri sergiler.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnvivo dokuların proteinler, nükleik asitler, ribonükleoproteinler, polisakkaritler vb. ile çok kalabalık olduğu gösterilmiştir. Aşağıdaki protokol, nötr polimerlerin (crowders) hücre kültürlerine in vitro eklenmesi yle bu fizyolojik kalabalığı taklit etmek için makromoleküler bir kalabalık (MMC) tekniğini uygular. Ficoll veya dextran'ı crowder olarak kullanan önceki çalışmalar, WI38 ve WS-1 hücre hatlarında kollajen I ve fibronektin ekspresyonunun MMC tekniği kullanılarak önemli ölçüde geliştirildigini göstermektedir. Ancak, bu teknik primer hipertrofik skar kaynaklı insan deri fibroblastlarında (hHSFs) doğrulanmamıştır. Hipertrofik yara kollajenaşırı birikimi ortaya çıktığından, bu protokol hHSFs ile MMC tekniği uygulanarak kollajen açısından zengin in vitro hipertrofik skar modeli oluşturmayı amaçlamaktadır. Bu optimize MMC modeli geleneksel 2 boyutlu (2-B) hücre kültür sistemleri ile karşılaştırıldığında in vivo skar dokusu ile daha fazla benzerlikler sahip olduğu gösterilmiştir. Buna ek olarak, hayvan modellerine göre uygun maliyetli, zaman-etkin ve etik olarak arzu edilir. Bu nedenle, burada bildirilen optimize edilmiş model hipertrofik skar ile ilgili çalışmalar için gelişmiş bir "in vivo benzeri" modeli sunuyor.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yara dokusu doku onarımının bitiş noktasını temsil eder. Ancak, birçok kişide, özellikle yanık veyatravma1 muzdarip olanlar, yara izi aşırı olabilir ve morfolojisi ve iyileşmiş cildin işleyişi üzerinde istenmeyen etkileri empoze. Patolojik (hipertrofik yara izleri ve keloidler) skar oluşumunun tam mekanizmaları tam olarak anlaşılamamasına rağmen, yara iyileşmesi sırasında kollajenin aşırı birikiminin önemli bir katkı olduğu gösterilmiştir2.

Transforming büyüme faktörü beta 1 (TGF-β1) ve alfa düz kas aktininin (αSMA) hipertrofik yaraların oluşumunda kilit rol oynadığı iyi belirlenmiştir. Kanıtlar, yüksek TGF-β1'in SMAD sinyal yolu3'üdüzenleyerek kollajenin aşırı birikimini doğrudan uyardığını göstermektedir. Buna ek olarak αSMA'nın yara iyileşme sürecinde hücre daralması ve reepitelizasyonunu düzenleyerek hipertrofik skar oluşumuna katkıda bulunduğu bulunmuştur4. Uygun in vitro ve in vivo modellerin in eksikliği, yara izi İyileştirme için müdahalelerin ve tedavilerin geliştirilmesi ve değerlendirilmesi açısından önemli bir engeldir. Bu çalışmanın amacı, yeni ve ortaya çıkan yara ile ilgili müdahaleleri değerlendirmek için uygun olan "in vivo benzeri" hipertrofik skar modeli oluşturmak için mevcut MMC tekniğini kullanmaktır.

Canlı dokuların vücut dışında üretilmesi bilim camiasında yıllardır bir hedef olmuştur. Yirminci yüzyılın başlarında in vitro tekniklerinin geliştirilmesi kısmen bu hedefe ulaşıldı. Mevcut in vitro teknikleri biraz Roux orijinal gösteri embriyonik hücrelerin sıcak tuzlu5birkaç gün için ex vivo hayatta olabilir gelişti . Ancak in vitro metodolojiler çoğunlukla 2-B'de yetiştirilen tek hücreli tiplerle sınırlıdır ve in vivo dokuları doğru bir şekilde özetlemez. Hücre biyokimyası, fizyolojisi ve genetiğinin incelenmesinde yararlı olmakla birlikte, yerli dokular 3-B'dir ve birden fazla hücre tipini içerir. Basit 2-D in vitro sistemler memeli hücrelerini doğal dokuya özgü mimarinin6'sınıkaybettiği son derece yapay ortamlara tabi tutar. Buna karşılık, bu anormal hücre morfolojisi, fizyolojisi ve davranış7sonuçlanan, hücre içi ve hücre dışı olayları etkiler.

Bu protokolün arkasındaki ilgi hipertrofik yara ve keloidlerin gelişimi ve klinik yönetiminde yatsın. Dermal fibroblastların skar dokusunda bulunan kollajenlerin bol miktarda üretilmesinden büyük ölçüde sorumlu olduğu iyi saptanmış olsa da, 2-D in vitro sistemleri kullanılarak dermal fibroblastların yetiştirilmesi in vivo8'degözlenen kollajenin cirosunu yeniden üretememektedir. Çağdaş in vitro yöntemleri hala aslında "sıcak tuzlu" kullanmak, bir ortamda tamamen canlı dokularda farklı. Vivo'daki dokular proteinler, nükleik asitler, ribonükleoproteinler ve polisakkaritlerle son derece kalabalıktır ve toplam hacmin %5-40'ını kaplarlar. Hiçbir iki molekül aynı anda aynı alanı işgal edebilirsiniz gibi, çok az boş alan mevcut ve serbest su neredeyse tam yokluğu9.

MMC tekniği, sitosol ve interstisyel sıvıların termodinamik özelliklerini etkileyen kısıtlamalar uygular. Moleküler etkileşimler, reseptör-ligand sinyal kompleksleri, enzimler ve organeller serbestçe etkileşime girerler 9. Perisellüler ortam (yani interstitium) içindeki etkileşimler de kısıtlanır. Son kanıtlar, kalabalık çözeltilerde yüksek oranda inert makromoleküllerin perturb difüzyon, fiziksel ilişki, viskozite ve hidrodinamik özellikleri10olduğunu doğrulamaktadır.

İlginçtir, çeşitli popüler kalabalık ajanlar (yani, Ficoll, dextran, polivinylpyridone [PVP], ve sodyum 4-stirensülfonat [PSS]) farklı hücre tipleri ve farklı ortamlarda uygulandığında eşdeğer değildir. Bir önceki çalışmada, Ficoll PVP ile karşılaştırıldığında mezenkimal kök hücreler için daha az sitotoksik olduğu bildirilmiştir. Bu sonuçlar nötr yükü ve nispeten küçük hidrodinamik yarıçapı11sonucu olarak yorumlandı. Buna karşılık, ikinci bir çalışmada dextran ficoll12ile karşılaştırıldığında insan akciğer fibroblastları tarafından kollajen I birikimi uyarıcı daha etkili olduğunu bulundu . Kendi çalışmamızdan elde edilen veriler Ficoll hipertrofik skar kaynaklı fibroblastlar tarafından kollajen birikimini artırır düşündürmektedir, PVP bu hücreler için toksik ise13.

Bu kollajen için prokollajen dönüşüm ü vivo ortamda son derece kalabalık bir ortamda daha hızlı olduğu gösterilmiştir14, biyolojik reaksiyonların oranı seyreltilmiş 2-B kültür sisteminde gecikilir iken15. Biz burada in vitro protokolü optimize var, dermal fibroblastlar dermal fibrozis ve skar oluşumu için daha "in vivo gibi" bir model olarak hizmet veren ekimi göstermek için MMC içeren. Ortak 2-B kültür sisteminin aksine, MMC ile hHSFs yetiştirmek önemli ölçüde13kollajen biyosentez ve birikimi ni uyarır. Özellikle, fibrozis diğer özellikleri (yani, matris metalloproteinazların artan ekspresyonu [MDP] ve proinflamatuar sitokinler) ayrıca bu optimize MMC protokolü13altında belirgindir . Bu yöntemle ekili olduğunda, dermal hücrelerin in vivo ölçülen fizyolojik, biyokimyasal ve fonksiyonel parametreleri yeniden kapitalizettiği gösterilmiştir.

Optimize edilmiş MMC in vitro protokolü, hipertrofik skar dermisi ve ilgisiz komşu dermisten izole edilen dermal fibroblastlar tarafından kollajen ve diğer ECM proteinlerinin ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılmıştır. MMC ortamlarında in vitro olarak yetiştirildiğinde, HHSF'lerin dermal hipertrofik skar dokusuna benzer belirli özellikleri (yani mRNA, biyokimya, fizyoloji ve fenotip) ifade ettiği gözlenmiştir. Kanıtlar, crowders seçerken ve in vitro ekimi için MMC koşullarını optimize ederken fiziksel ve kimyasal özelliklerin önemli noktalar olduğunu göstermektedir.

Prensip kanıtı için, MMC protokolü burada Nitel ve nicel olarak Shikonin ve analoglarının apoptoza neden olma yeteneğini değerlendirmek için uygulanır. Bu dermal yara izi yönetmek için bu doğal kaynaklı Geleneksel Çin Tıbbı (TCM) bileşiklerin potansiyel uygulamalarının değerlendirilmesi sağlar13. Buna rağmen, bu in vitro MMC protokolünün basitliği, maliyet etkinliği ve güncelliği, ab direktifi 2010/63/EU ve ABD Çevre Koruma Ajansı (EPA) tarafından memelilerde yapılan deneyleri ortadan kaldırmak için yapılan son düzenlemeleri de karşılar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre kültürü

  1. Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM) patolojik olmayan dokudan (hNSFs) elde edilen hHSF'leri ve normal dermal fibroblastları %10 fetal baldır serumu (FCS) ve %1 v/v penisilin/streptomisin çözeltisi (P/S) içeren %5 CO2/95hava ile bir kuvözde 37°C'de muhafaza edin.
  2. Ficoll 70, Ficoll 400 ve uygun şirketlerden askorbik asit satın alın.

2. MMC hipertrofik skar modelinin yapımı

  1. HHSF'leri veya hNSF'leri (50.000/iyi) her kuyuda 1 mL ortam içeren 24 kuyu plakasına yerleştirin.
  2. %5 CO2'de 37°C'lik bir kuluçka makinesine yerleştirin ve gece boyunca bırakın.
  3. MMC ortamını hazırlayın. Deney için gereken toplam hacme göre Ficoll 70 (18,75 mg/mL), Ficoll 400 (12,5 mg/mL) ve askorbik asit (100 μM) karıştırılarak %10 FCS/DMEM ortam üretin.
  4. Karışımı 37°C'lik bir su banyosuna yerleştirin ve crowders'ı çözeltiye dağıtın ve ardından 0,2 m filtre kullanarak MMC ortamını sterilize edin.
  5. Harcanan ortamı aspire edin ve yeni yapılmış MMC ortamıile değiştirin.
  6. Hücreleri 37°C'de 6 gün ve %5 CO2'dekuluçkaya yatırın ve her 3 günde bir ortam değiştirin.

3. Kollajen toplam miktarının ifadesi

  1. Sirius kırmızı çözeltisi hazırlayın (%0.1 w/v). 200 mL distile deiyonize su (ddH2O) ve 1 mL asetik asit ile Doğrudan Kırmızı 80 tozunun 0,2 g'ını çözün.
  2. MMC ortamını aspire edin ve her kuyuya 300 μL Sirius Red çözeltisi ekleyin. 90 dk için 37 °C'de kuluçka.
  3. Sirius Red çözeltisini musluk suyuyla hafifçe durulayın ve plakanın bir gecede hava kurmasını bekleyin.
  4. Her kuyuya 200 μL sodyum hidroksit (0,1 M) ekleyerek Sirius Red lekesini ayıklayın. Sirius Kırmızı lekesini tamamen çıkarmak için plakayı 5-10 dakika boyunca orbital shaker üzerine yerleştirin.
  5. Çıkarılan Sirius Red lekesinin 100 μL'sini 96 iyi saydam bir plakaya aktarın ve mikroplaka okuyucu kullanarak 620 nm'de emiciliği ölçün.

4. Kollajen I ekspresyonu (immünboyama)

  1. 200 μL fosfat tamponlu salin (PBS, pH = 7,35) kullanarak kuyuları yıkayın.
  2. Hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca metanol (500 μL/iyi) kullanarak düzeltin.
  3. Oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca %3 büyükbaş serum albumini ile nonspesifik etkileşimleri engelleyin.
  4. Engelleme çözeltisini aspire edin ve RT'de 90 dk boyunca 200 μL anti-kollajen I antikor (10 μg/mL) ile inkübat.
  5. Birincil antikor aspire ve 5 dakika her pbs ile 3x yıkayın.
  6. 200 μL Keçi anti-Rabbit-FITC ikincil antikor (1:400 seyreltme) ve 4 ',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; 1: 2000 seyreltme) ile inkübat 30 dakika RT. Alüminyum folyo ile plaka kapağı.’
  7. Hem ikincil antikor ve DAPI atın ve 5 dakika her pbs ile 3x yıkayın.
  8. Floresan boyamasını doğrudan mikroskop altında görselleştirin.

5. Batı lekeleme

  1. Hücreleri 2 kat PBS ile yıkayın.
  2. Her kuyuya 40 μL likte arabellek ekleyin ve bir pipet ucu ile hücre tabakasıkazıyın. Lysis tamponripa tampon, proteaz inhibitörü kokteyl (PIC), 2 mM sodyum vanadate ve 10 mM sodyum florür içerir.
  3. Protein lisatını mikrosentrifuge tüplere aktarın ve üreticinin talimatlarına göre protein tonu kullanarak protein konsantrasyonu ölçün16.
  4. Her grubun 10 μg proteinini %4-12 Oranında Bis-Tris protein jellerinin kuyularına yükleyin. Sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) 200 V 30 dakika için gerçekleştirin.
  5. 90 dk için 90 V'de batı lekesini çalıştırarak proteini nitroselüloz membrana aktarın.
  6. Membranı 10 mL blokaj tamponu ile kapatın.
  7. Bir gecede 4°C'de primer antikorlarla kuluçkaya yatırın. Primer antikorlar şunlardır: anti-kollajen I, anti-kollajen III, anti-kollajen IV, anti-αSMA, anti-MMP-1, anti-MMP-2, anti-MMP-9, anti-MMP-13, ve anti-gliserinaldehit 3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH).
  8. Membranı %0,1 TBS-Tween 20 (her biri 5 dk için 5 x) ile yıkayın. TBS/Tween 20 (1 L) aşağıdakileri içerir: 50 mL 1 M Tris (pH = 7.4), 30 mL 5 M sodyum klorür, 1 mL Tween 20 ve 920 mL ddH2O içerir.
  9. 1 saat için RT uygun ikincil antikor ile kuluçka.
  10. Adım 5.8'i tekrarlayın ve bir görüntüleme sistemi kullanarak floresan'ı görselleştirin.

6. RT-PCR

  1. RNA ekstraksiyon sayıcı kitinde yer alan 2-mercaptoetanol ile karıştırılmış lysis tamponu kullanarak toplam RNA'yı toplayın.
  2. Üreticinin talimatları na göre RNA arındırın17.
  3. Mikro hacimsi spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonu ölçün.
  4. Üreticinin talimatlarına göre cDNA sentez kiti kullanarak ilk iplikçik cDNA sentezini gerçekleştirin.
  5. RT-PCR oligonükleotid astarlar özel 96 kuyu plakaları (precoated) sağlanır. CDNA numunelerinin 100 ng'sini 10 μL SYBR yeşil supermix ile özelleştirilmiş plakaya karıştırın.
  6. DDH2O kullanarak toplam hacmi 20°L/iyiye yükseltin.
  7. RT-PCR'ı üreticinin talimatlarına uygun bir termal döngü kullanarak çalıştırın: 98°C'de 15 s için 40 devir denaturing ve 60 s için 60 °C'de tavlama/uzatma. RT-PCR'de test edilen genler şunlardır: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD7, IL1A, IL1B, IL6, IL8, MMP1, MMP2, MMP3, TGFB1, ve VEGF.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Her deneyde üçerlik örnekler uygulandı ve her deney üç hastanın hücreleri kullanılarak 3x tekrarlandı. Veriler kontrol grubunun yüzdeleri olarak ifade edilir. İstatistiksel farklılıkları analiz etmek için tek yönlü ANOVA ve Tukey'in post-hoc testi uygulandı (*p 0.05).

MMC% 9 FVO (fraksiyonel hacim doluluk) de Ficoll kullanarak hHSF13kollajen ve kollajen I birikimi nin toplam miktarını artırır. Şekil 1A'dagösterildiği gibi, Ficoll i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, insan kutanöz skar dokusu için geliştirilmiş bir "scar-in-a-jar" in vitro modelini optimize etmeyi ve doğrulamasını amaçlamaktadır. Önceki çalışmalarda insan akciğer fibroblastları için MMC tekniğinin uygulama bildirilmiştir12, insan kemik iliği mezenkimal kök hücreler23, ve insan dermal fibroblastlar23 dekstran kullanarak12, Ficoll12, ve PVP23 crowders olarak. Burad...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların çıkar çatışması yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Singapur Bilim, Teknoloji ve Araştırma Ajansı "SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research" ve "Tropics için Yara Bakımı İnovasyonu" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009 tarafından desteklendi. Yazarlar minnetle tavsiye ve Dr Paula Benny ve Dr Michael Raghunath yardım kabul.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.2 ve mu; m filtreSartorius16534
2-MerkaptoetanolSigma-AldrichM6250
4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Thermo Fisher ScientificP36962
Alexa Fluor 680Thermo Fisher ScientificA-21076
Alexa Fluor 800Thermo Fisher ScientificA-11371
alfa düz kas aktin (&alfa;SMA) birincil antikoruAbcamab5694
Uygulamalı Biyosistemler 7500 Hızlı Gerçek Zamanlı PCR Sistemi (termal döngüleyici)Thermo Fisher Scientific4351106
Askorbik asitWako# 013-12061
Sığır serum albüminiSigma-Aldrich#A2153
Bradford protein testiBio-Rad500-0006
Kollajen I birincil antikoru (immün boyama için)Abcam6308
Kollajen I birincil antikoru (western blot için)Abcamab21286
Kollajen III birincil antikoruAbcamab7778
Kollajen IV birincil antikoruAbcamab6586
Doğrudan Kırmızı 80Sigma-Aldrich2610108
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM)Yaşam Teknolojileri11996-065
Fetal buzağı serumu (FCS)Yaşam Teknolojileri6000-044
Ficoll 400GE Sağlık Hizmetleri#17-0300-10
Ficoll 70GE HealthCare#17-0310-10
GAPDH birincil antikoruSigma-AldrichG8795
Keçi Anti-Tavşan ikincil antikoruAbcamab97050
İnsan hipertrofik skar/normal fibroblastlar (hHSF/hNSF)Cell Research Corporation106, 107, 108
iScript cDNA Sentez KitiBio-Rad#1708890
MMP-1 birincil antikoruAbcamab38929
MMP-13 birincil antikorAbcamab39012
MMP-2 primer antikorAbcamab37150
MMP-9 primer antikorAbcamab38898
NanoDrop Mikrohacim SpektrofotometreleriThermo Fisher ScientificN/A
Nitroselüloz membranBio-Rad10484060
NuPAGE %4-12 Bis-Tris Protein JelleriThermo Fisher ScientificNP0321BOX
Odyssey engelleme tamponuLI-COR Biosciences927– 40000
Odyssey Fc Görüntüleme SistemiLI-COR BiosciencesN/A
Olympus IX-81 HCS mikroskobu (immün boyama için)OlympusN/A
Penisilin/streptomisin çözeltisi (P/S)Life Technologies15140-122
PrimePCR TestleriBio-Radİhtiyaca göre 96 oyuklu plakalarda önceden kaplanmış özelleştirilmiş astarlar
Proteaz inhibitör kokteyli (PIC)Sigma-Aldrich11697498001
PVP 360Sigma#PVP360
PVP 40Sigma#PVP40
RIPA tamponuMerckR0278
RNeasy Plus Mini KitQIAGEN# 74134
Sodyum vanadatSigma-Aldrich450022
Sodyum vanadatSigma-Aldrich450243
SpectraMax M5 Çok Modlu mikroplaka okuyucuMoleküler CihazlarN/A
SsoAdvanced evrensel SYBR yeşil süper karışımBio-Rad# 172-5270
Tween 20Sigma-AldrichP9416

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
  2. Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
  3. Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
  4. Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
  5. Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373(2015).
  6. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  7. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  8. Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
  9. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
  10. Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
  11. Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904(2012).
  12. Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
  13. Fan, C., et al. Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747(2019).
  14. Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, Pt 7 1341-1353 (2005).
  15. Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
  16. Ernst, O., Zor, T. Linearization of the bradford protein assay. Journal of Visualized Experiments. (38), e1918(2010).
  17. Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
  18. Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
  19. Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
  20. Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
  21. Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
  22. Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
  23. Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
  24. Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165(2019).
  25. Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746(2016).
  26. Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
  27. Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70(2015).
  28. Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
  29. Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kolajen BirikimiFicoll 70Ficoll 400Sirius Red BoyamaWestern BlotRT PCR Analizinsan Deri FibroblastlarH cre D Matriks

İlgili makaleler