Yöntem makalesi

Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Makrofajlarının Üretimi ve Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/61038

⸱

16 Nisan 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Regenerative Medicine, Scottish Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh, 2Centre for Reproductive Health, The Queen's Medical Research Institute, University of Edinburgh

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden makrofajların sağlam nesil açıklar, ve sonraki karakterizasyonu için yöntemler. Hücre yüzeyi belirteç ekspresyonu, gen ekspresyonu ve fonksiyonel tahliller bu iPSC kaynaklı makrofajların fenotip ve fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofajlar çoğu omurgalı dokuda bulunur ve farklı fonksiyonlara sahip yaygın olarak dağılmış ve heterojen hücre popülasyonlarını kapsar. Onlar sağlık ve hastalık önemli oyuncular, bağışıklık savunma sırasında fagosit ler olarak hareket ve trofik aracılık, bakım, ve onarım fonksiyonları. İnsan makrofaj fonksiyonunda yer alan moleküler süreçlerin bazılarını incelemek mümkün olsa da, genetik mühendislik tekniklerini birincil insan makrofajlarına uygulamak zor olmuştur. Bu önemli ölçüde makrofaj biyolojisi dahil karmaşık genetik yolları sorgulamak ve belirli hastalık durumları için modeller oluşturmak için yeteneğimizi engelledi. Genetik manipülasyon teknikleri geniş cephanelik için münasip bir insan makrofajlar bir off-the-raf kaynak, bu nedenle, bu alanda değerli bir araç sağlayacaktır. Biz in vitro insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden makrofajlar üretimi için izin veren optimize edilmiş bir protokol salıyoruz. Bu iPSC kaynaklı makrofajlar (iPSC-DMs) CD45, 25F9, CD163 ve CD169 dahil olmak üzere insan makrofaj hücre yüzey işaretleri ifade ve canlı hücre görüntüleme fonksiyonel tsay sağlam fagositik aktivite gösterdiğini göstermektedir. Kültürlü iPSC-DM'ler, LPS ve IFNg, IL4 veya IL10 ekleyerek değiştirilmiş gen ekspresyonu ve fagositik aktiviteyi görüntüleyen farklı makrofaj durumlarına etkinleştirilebilir. Böylece, bu sistem belirli insan hastalığı modeli genetik değişiklikler taşıyan insan makrofajlar oluşturmak için bir platform ve ilaç tarama veya hücre tedavisi için bu hastalıkların tedavisi için hücre kaynağı sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embriyonik kök hücreler (ESCs) ve indüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs) her üç mikrop tabakası lineages hücreleri üretmek için ayırt edilebilir kendini yenileyen bir hücre kaynağı temsil eder. Çinko Parmak Çekirdeği, TALENS ve CRISPR-Cas9 gibi insan pluripotent kök hücrelerinin (PSCs) genetik manipülasyon sağlayan teknolojiler, tıbbi araştırma1devrim var1 ,2,3,4. İnsan PsCs genetik manipülasyon özellikle çekici bir strateji zaman ilgi birincil hücre genişletmek ve / veya in vitro korumak zordur, ya da genetik olarak işlemek zordur, makrofajlar için olduğu gibi5,6,7,8,9. İnsan iPSC'leri herhangi bir somatik hücreden türetilebildiği için, ESC'lerle ilişkili etik sınırlamaları aşarak kişiselleştirilmiş ilaç sunmak için bir strateji sağlarlar. Bu hastaya özgü hastalık modelleme içerir, ilaç testi, ve immün ret ve enfeksiyon riski ile otolog hücre tedavisi6,8,10,11.

iPSC'lerden makrofaj ların neslini açıklayan protokoller: 1) Embriyoid cisim lerin üretimi; 2) Süspansiyon hematopoetik hücrelerin ortaya çıkması; 3) Terminal makrofaj olgunlaşması.

Embriyoid cisimler (EBs) olarak bilinen üç boyutlu agregaların oluşumu iPSC'lerin farklılaşmasını başlatır. Kemik morfogenetik protein (BMP4), kök hücre faktörü (SCF) ve vasküler endotelbüyüme faktörü (VEGF) mezoderm belirtimi sürücü ve gelişmekte olan hematopoetik hücreleri7destek eklenir7 ,8,9,11,12. EBs içinde ayırt edici hücreler de Wnt ve Activin gibi endojen sinyal yollarının aktivasyonunu başlatın. Bazı farklılaşma protokolleri EB oluşumu aşamasından geçmez. Bu gibi durumlarda, Wnt ve Activin sinyal düzenleyicileri, rekombinant insan Activin A ve / veya Chiron gibi tek katmanlı bir biçimde ayırt edici iPSCs eklenir13,14,15. Burada, EB oluşumunu kullanan bir protokole odaklanıyoruz. Farklılaşmanın ikinci adımı için, EB'ler yapışkan bir yüzeye kaplanır. Bu bağlı hücreler daha sonra hematopoetik ve miyeloid ataları içeren süspansiyon hücrelerinin ortaya çıkmasını teşvik sitokinler maruz kalmaktadır. Bu in vitro kültür koşullarında, interlökin-3 (IL3) büyük olasılıkla hematopoetik kök-atajen hücre oluşumu ve çoğalmasıdestekler 16,17, yanı sıra miyeloid öncüleri proliferasyon ve farklılaşma18. Makrofaj koloni uyarıcı faktör (BOS1) miyeloid hücrelerin üretimini ve makrofajlar19,,20onların farklılaşması nı destekler. Farklılaşmanın üçüncü aşamasında, bu süspansiyon hücreleri terminal makrofaj olgunlaşmasını desteklemek için BOS1 varlığında kültürlenir.

İnsan iPSC'lerinin in vitro makrofajlara farklılaşması, gelişim sırasında makrofaj üretiminin erken dalgasını taklit eder. Dokuda yerleşik makrofajlar embriyogenez sırasında kurulur ve erişkin monositlerden farklı gelişimsel soylara sahiptir. Çeşitli çalışmalar, iPSC-DM'lerin, kan kaynaklı monositlere göre fetal karaciğer kaynaklı makrofajlarla karşılaştırılabilir bir gen imzasına sahip olduğunu göstermiştir ve bu da iPSC-DM'lerin dokuda yerleşik makrofajlara daha çok benzer olduğunu düşündürmektedir. iPSC-DMs doku remodelling ve anjiyogenez dahil proteinlerin salgılanması için kodlama genlerin yüksek düzeyde ifade ve pro-inflamatuar sitokin salgılanması ve antijen sunum faaliyetleri için kodlama genlerin düşük seviyelerde ifade21,22. Buna ek olarak, iPSC-DMs doku yerleşik makrofajlar23,,24benzer bir transkripsiyon faktörü gereksinimi var. Transkripsiyon faktörleri RUNX1, SPI1 (PU.1) ve MYB'de eksik olan nakavt iPSC hücre çizgilerini kullanarak, Buchrieser ve diğerleri iPSC-DM'lerin neslinin SPI1 ve RUNX1'e bağlı olduğunu, ancak MYB'nin bağımsız olduğunu gösterdi. Bu, gelişim sırasında hematopoyonun ilk dalgası sırasında oluşan yolk-kese türemiş makrofajlara transkripsiyonel olarak benzer olduklarını gösterir23. Bu nedenle, yaygın olarak iPSC-DMs mikroglia14,,25 ve Kupffer hücreleri11gibi doku yerleşik makrofajlar çalışmak için daha uygun bir hücre modeli temsil ve potansiyel dokuları onarmak için tedavilerde kullanılabilecek hücrelerin daha arzu edilen bir kaynak olduğu kabul edilmektedir. Örneğin, fare ESC'lerinden in vitro olarak üretilen makrofajların, ccl4'e bağlı karaciğer hasarı modelinde in vivo11'defibrozisin iyileştirilmesinde etkili olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, bu ESC kaynaklı makrofajlar farelerde lipozomal klodronat11 kullanarak makrofajlar tükenmiş Kupffer hücre kompartmanlarının yeniden doldurulma kemik iliği kaynaklı makrofajlar daha verimli idi.

Burada, insan iPSC'lerinin bakımı, dondurulması ve çözülmesi ve bu iPSC'lerin fonksiyonel makrofajlara farklılaşması için serum ve besleyiciiçermeyen protokolleri tanımlıyoruz. Bu protokol van Wilgenburg ve ark.12tarafından açıklanan çok benzer , dahil küçük değişiklikler ile: 1) iPSC-bakım medya; 2) EB oluşum aşamasında KAYA inhibitörü kullanılmaz; 3) iPSC kolonilerinden tek tip EB'ler üretmek için enzimatik bir yaklaşım yerine mekanik bir yaklaşım kullanılır; 4) EB hasat ve kaplama yöntemi farklıdır; 5) Süspansiyon hücreleri haftada 2x değil, haftada 2x hasat edilir; ve 6) Hasat edilen süspansiyon hücreleri 7 gün yerine 9 gün makrofaj olgunlaşması için BOS1 altında kültürlenir. Ayrıca, gen ekspresyonu (qRT-PCR), hücre yüzey marker ekspresyonu (akış sitometrisi) analizleri ve fagositoz ve polarizasyonu değerlendirmek için fonksiyonel tahliller de dahil olmak üzere, iPSC kaynaklı makrofaj fenotip ve fonksiyonu karakterize etmek için kullanılan protokolleri de tanımlıyoruz.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'ndalistelenmiştir. Hücre kültürü için ortam 37 °C'de olmalıdır. Diferansiyasyon protokolünde kullanılan ortam ve reaktifler steril olmalıdır.

1. İnsan iPSC Hattı Eritme ve Bakım

  1. Hücre bakım ortamını, büyüme faktörlerini ve diğer reaktifleri hazırlayın.
    1. HESC takviyesi, %1,8 w/v sığır serum albumini (BSA) ve 0.1 mM 2-mercaptoetanol ile Dulbecco'nun modifiye Eagle medium-F12 (DMEM/F12) ekleyerek hESC-serum serbest ortam (hESC-SFM; bkz. Malzemeler Tablosu)hazırlayın. (
    2. BFGF'yi steril %0,1 insan serum albumini (HSA)-fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisinde eriterek insan temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) stok çözeltisini (10 g/mL) hazırlayın. Stok çözümünü kriyotüplerde 200 μL aliquots olarak dağıtın. Stok çözümleri -20 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir. Çözüldükten sonra, stok bFGF 7 gün boyunca 4 °C'de saklanabilir.
    3. Rho kinaz inhibitörü (ROCK Inhibitörü)-Y27632 stok çözeltisi (1 mg/mL) steril suda eriterek hazırlayın. Stok çözümünü kriyotüplerde 50 μL aliquots olarak dağıtın. Stok çözümleri -20 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir. Bir kez çözülmüş, stok ROCK Inhibitörü 7 gün boyunca 4 °C'de saklanabilir.
  2. Seyreltik kök hücre substratı (Bkz. Malzemeler Tablosu) 1:50 Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu kalsiyum ve magnezyum ile.
  3. Seyreltilmiş kök hücre substrat çözeltisini kültür plakalarına yerleştirin, böylece yüzey alanı2başına son hacim 78°L/cm 2'dir. 6 kuyulu bir plakanın kuyusunu kaplamak için 750 μL çözelti ekleyin.
  4. 37 °C ve %5 CO2'dehumified bir atmosferde kaplanmış plakayı 1 saat kuluçkaya yatırın.
  5. Kök hücre substrat kaplamasını aspire edin ve 20 ng/mL bFGF ve 10 μM ROCK Inhibitörü ile takviye edilmiş 1 mL hESC ekleyin.
  6. Dondurulmuş insan iPSC hücrelerinden oluşan bir şişeyi eritmek için şişeyi 37 °C'de eriyene kadar kuluçkaya yatırın ve hücreleri 5 mL hESC-SFM ortama aktarın.
  7. 3 dk için 100 x g santrifüj hücreleri.
  8. 20 ng/mL bFGF ve 10 μM ROCK Inhibitörü ile desteklenen 0,5 mL hESC-SFM'de resuspend. Hücreleri kaplamalı kuyuya aktarın.
  9. 24 saat kültür hücreleri.
  10. 20 ng/mL bFGF ile desteklenen ancak ROCK inhibitörü içermeyen hESC-SFM'ye medya değiştirin.
  11. Hücreleri korumak için, hücreler % 80 biraraya ulaşana kadar her gün orta değiştirin. Farklılaşmamış iPSC'lerin %80 birleşmesine ulaşmak genellikle 3-4 gün sürer.
  12. Hücreler %80'e ulaştığında, geçiş hücreleri.
    1. Harcanan kültür ortamını 20 ng/mL bFGF (ROCK inhibitörü olmadan) ile birlikte 1,5 mL taze hESC-SFM ile değiştirin.
    2. Kültür kabını bir elinizde tutun ve tek kullanımlık bir hücre geçiş aracını (Bkz. Malzeme Tablosu)plaka boyunca tek bir yönde (yani soldan sağa) yuvarlayın. Silindirdeki tüm bıçaklar tabağa dokunuyor olmalı. Yuvarlanırken tek tip basıncı koruyun.
    3. Tüm kuyu kaplanana kadar aynı yönde yuvarlanma tekrarlayın.
    4. Kültür kabını 90° döndürün ve 1.12.2 ve 1.12.3 adımlarında açıklandığı gibi yuvarlanma tekrarlayın.
    5. Kullanımdan sonra geçiş aracını atın.
    6. Steril bir pipet ile, kesilmiş koloniler çıkarmak için kuyuda medya kullanın.
    7. Hücreleri 1:4 oranında precoated kök hücre substrat kuyularına (adım 1.2-1.5) son ortam hacmine (hESC -SFM 20 ng/mL bFGF ile desteklenmiş) aktarın.

2. İnsan iPSC Hattı Dondurma

  1. iPSC hücrelerini dondurmak için, 20 ng/mL bFGF ve 10 μM ROCK Inhibitörü ile desteklenen hESC-SFM ile 6 kuyulu bir plakanın %70-80'lik bir kısmının medyasını değiştirin.
  2. 37 °C'de ve %5 CO2'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
  3. Hücre geçiş aracı ile kolonileri kesin ve yerinden çıkan kolonileri bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
  4. 3 dk için 100 x g santrifüj hücreleri.
  5. Medyayı aspire edin ve hücre kriyopreservation media 1 mL hücreleri resuspend (Malzemeler Tablosubakınız).
  6. Hücreleri eşit olarak iki kriyopial'e bölün ve 4 °C'de önceden soğutulmuş bir hücre kriyopreservation kabına yerleştirin.
  7. Hücreleri -80 °C'de 24-48 saat boyunca saklayın.
  8. Şişeleri -135 °C'lik dondurucuya veya sıvı nitrojen tankına aktarın.

3. İnsan iPSC Makrofajlar Farklılaşması

NOT: Makrofaj farklılaşma protokolünün şematik bir özeti Şekil 1'degösterilmiştir.

  1. Hücre farklılaşması büyüme faktörlerinin ve diğer reaktiflerin hazırlanması
    1. hESC-SFM ortamını hazırlayın (önceki bölüme bakın).
    2. Jelatini steril suya eriterek domuz jelatininin %0,1 w/v çözeltisini hazırlayın. Jelatin çözeltisi 4 °C'de 2 yıla kadar saklanabilir.
    3. BMP4'ü 4 mM hidrojen klorür (HCl)-%0.2 BSA PBS çözeltisine eriterek insan BMP4 stok çözeltisini (25 g/mL) hazırlayın. Stok çözümünü kriyotüplerde 50 μL aliquots olarak dağıtın. Stok çözümleri -20 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir. Çözüldükten sonra, stok BMP4 4 °C'de 5 gün boyunca saklanabilir.
    4. VEGF'yi %0,2 BSA PBS çözeltisine eriterek insan VEGF stok çözeltisini (100 μg/mL) hazırlayın. Stok çözümünü kriyotüplerde 10 μL aliquots olarak dağıtın. Stok çözümleri -20 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir. Çözüldükten sonra stok VEGF 7 gün boyunca 4 °C'de saklanabilir.
    5. SCF'yi %0,2 BSA PBS çözeltisine eriterek insan SCF stok çözeltisini (100 μg/mL) hazırlayın. Stok çözümünü kriyotüplerde 5 μL aliquots olarak dağıtın. Stok çözümleri -20 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir. Çözüldükten sonra stok SCF 4 °C'de 10 gün boyunca saklanabilir.
    6. IL3'ü %0,2 BSA PBS çözeltisine eriterek insan IL3 stok çözeltisini (10 μg/mL) hazırlayın. Stok çözümünü kriyotüplerde 500 μL aliquots olarak dağıtın. Stok çözümleri -20 °C'de 2 yıla kadar saklanabilir. Çözüldükten sonra stok SCF 4 °C'de 15 gün boyunca saklanabilir.
    7. CSF1'i %0,2 BSA PBS çözeltisine eriterek insan BOS1 stok çözeltisini (10 g/mL) hazırlayın. Stok çözümünü kriyotubelarda 1 mL aliquot olarak dağıtın. Stok çözümleri -20 °C'de 2 yıla kadar saklanabilir. Çözüldükten sonra stok SCF 4 °C'de 15 gün boyunca saklanabilir.
    8. İnterferon-gama (IFNg), interlökin 4 (IL4) ve interlökin 10 (IL10) ayrı 10 μg/mL stok çözeltilerini %0,2 BSA PBS çözeltilerine eriterek hazırlayın. Lipopolisakkariti (LPS) %0,2 BSA PBS çözeltisine eriterek (100 U/mL) bir stok çözeltisine hazırlayın. Her stok çözümlerini 35 μL aliquots olarak dağıtın. -80 °C'de 2 yıla kadar saklayabilirsiniz. Çözüldükten sonra stoklar 7 gün boyunca 4 °C'de saklanabilir.
  2. Evre 1: Embriyoid cisimlerin üretimi (gün 0-gün 3)
    1. 0. günde, 2.25 mL Stage 1 ortam (hESC-SFM 50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF ve 20 ng/mL SCF ile desteklenmiş) ultralow eki 6 kuyu plakasının iki kuyuya ekleyin.
    2. 1,5 mL Stage 1 ortama sahip 6 kuyuluktabakasında %80'lik bir iPSC kuyunun bakım ortamını değiştirin.
    3. Hücre geçiş aracını kullanarak kolonileri kesin ve bir pipetle kesilen kolonileri ultralow eki 6 kuyu plakasının iki kuyuya aktarın (Bkz. Malzeme Tablosu).
    4. 2. günde, hESC-SFM ortam0.5 mL kullanarak 50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF ve 20 ng/mL SCF'lik son konsantrasyona sitokinler getirin.
      NOT: IPSC kolonileri EBs(Şekil 2A)haline gelecektir.
  3. Evre 2: Süspansiyonda hematopoetik hücrelerin ortaya çıkışı
    1. 4. günde, %0,1 w/v jelatinli 6 kuyulu doku kültür plakasının 4 kuyusunu kaplayın ve en az 10 dakika kuluçkaya yatırın.
    2. Jelatini çıkarın ve 2,5 mL Evre 2 ortam ekleyin (X-VIVO15 100 ng/mL CSF1, 25 ng/mL IL-3, 2 mM glutamax, %1 penisilin-streptomisin ve 0,055 mM 2-mercaptoetanol ile desteklenmiştir).
    3. 50 mL santrifüj tüp içine oluşan EBs toplamak ve onları yerçekimi ile tüpün altına yerleşmek için izin. Medyayı dikkatlice aspire edin.
    4. Aşama 2 ortamının 2 mL'sinde EB'leri yeniden askıya alın.
    5. 10-15 EB'yi (en fazla 15) Evre 2 ortam 2,5 mL içeren jelatin kaplı bir kuyuya aktarın.
    6. 37 °C ve %5 CO2 hava ile tüplü ebs.
    7. 2-3 hafta boyunca her 3-4 günde bir plakalı EBs medya değiştirin.
    8. 2-3 hafta sonra, EBs süspansiyon içine nonadherent hematopoetik hücreleri serbest başlar.
      NOT: Süspansiyon hücre salınımı Bu süre değişebilir ve hücre hattı bağlıdır. Bu süspansiyondaki hücreler hasat edilebilir ve makrofajlara dönüştürülebilir (bkz. Evre 3)(Şekil 2A).
  4. Aşama 3: Terminal makrofaj olgunlaşması
    1. Süspansiyon hematopoetik hücreleri toplamak ve EB plaka üzerinde ortam (Stage 2 media) doldurmak.
    2. Santrifüj süspansiyon hücreleri 200 x g 3 dk için.
    3. Evre 3 ortamdaki süspansiyon hücrelerinin yeniden askıya alınması (X-VIVO15 100 ng/mL CSF1, 2 mM glutamax ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiştir).
    4. Plaka toplanan ve işlenmemiş plastik üzerine bükülmüş hücreleri 10 cm bakteriyolojik sınıf plakaları (10 mL) veya kaplamasız 6 kuyu doku kültür plakaları (3 mL) 0.2 x 106 hücre/mL yoğunluğunda.
    5. Hücreleri 9-11 gün boyunca Aşama 3 medyasında tutun, 5 günde bir ortam değiştirin.
      NOT: Aşama 3'ten 3.4.1-3.4.5 adımları her 3-4 günde bir tekrarlanabilir ve orijinal EB plakasından 3 aya kadar alınan süspansiyon hücreleri tekrarlanabilir.
  5. Makrofaj polarizasyonu
    1. Makrofajları M(LPS + IFNg) fenotiplerine etkinleştirmek için, 48 saat boyunca LPS (son konsantrasyon: 100 ng/mL) ve IFNg (son konsantrasyon: 10 U/mL) ile hücreleri uyarın. Hücreleri M(IL4) fenotipine etkinleştirmek için IL4 (son konsantrasyon: 20 ng/mL) ile hücreleri uyarın. M(IL10) fenotipini etkinleştirmek için IL10 (son konsantrasyon: 5 ng/mL) ile makrofajları uyarır.

4. iPSC kaynaklı Makrofajlar Kalite Kontrol Kontrolü

  1. Hematopoetik süspansiyon hücrelerinin sayısını bir hematositometre ile sayarak 6 iyi eBs plaka başına üretilen belirlemek.
  2. Makrofaj morfolojisini daha önce açıklandığı gibi değerlendirin (örn. ticari kit boyama)8,9.
  3. Daha önceaçıklandığıgibi gen ekspresyonu analizleri ve akış sitometrisi kullanarak makrofaj spesifik belirteçlerin ve polarizasyon belirteçlerinin ekspresyonunu sapta.9
    1. Makrofajların 6 kuyuplaka bir kuyuüzerinde akış sitometri deneyleriçin, olgunlaşma ortamı aspire ederek hücreleri hasat, 2 mL PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca enzimsiz hücre ayrışma tampon 2 mL ile kuluçka (RT). Pipet yukarı ve aşağı tekrar tekrar ayırmak ve makrofajlar hasat.
    2. Hücreleri hematositometreli olarak sayın ve %2 BSA, 0,5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA)-PBS çözeltisinin 80 μL'sinde yeniden askıya alın.
    3. 20 μL MACS insan FC engelleyici ekleyin.
    4. 20 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka ve ışıktan koruyun.
    5. Hücre konsantrasyonunu 1 x 106 makrofaj/mL'ye getirmek için %2 BSA, 0,5 mM EDTA PBS çözeltisi için uygun hacim ekleyin.
    6. 1 x 105 hücreyi 100 μL%2 BSA, 0,5 mM EDTA PBS çözeltisi ile ilgili antikor (aşağıdaki NOTa bakınız) ve 15 dakika boyunca RT ışıktan korunan kuluçkaya yatırın.
    7. 1x %2 BSA, 0,5 mM EDTA PBS en az 100 μL ile yıkayın.
    8. Hücreleri 200 μL %2 BSA, 0.5 mM EDTA PBS'de yeniden askıya alın.
    9. 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, seyreltilmiş 1:1,000) canlı ölü boya olarak ekleyin. Kuluçka 3 dk.
    10. Akış sitometri analizleri için, ana popülasyon, sonra tek hücreler ve canlı hücreler üzerinde kapı. Canlı hücre popülasyonunda makrofajile ilişkili belirteç ifadesi belirgindir (Şekil 3A).
      NOT: Antikorlar makrofajlar türetmek için kullanılan her hücre hattı için dikkatle titre edilmelidir. Sonuçlar bölümünde sunulan antikorlar Malzeme Tablosu'ndayer almaktadır. SFCi55 türetilmiş makrofajlar akış sitometri tahlilleri için seyreltme faktörü de dahildir.

5. Yüksek Throughput Fagositositöz Tsöz

  1. Hasat iPSC kaynaklı makrofajlar (iPSC-DMs) medya aspirating tarafından, buz gibi enzim serbest hücre ayrışma tampon ekleyerek, ve 5 dk. Tekrar tekrar pipetleme makrofajlar toplamak.
  2. Plaka 8 x 104 iPSC-DMs bir görüntüleme doku kültürü sınıf 96 kuyu plakaları bir kuyuda (örneğin, Cellcarrier Ultra, Perkin Elmer) en az 2 gün önce sahne 3 medya 200 μL yüksek iş bölümü görüntüleme.
  3. PHrodoGreen Zymosan-A Biyopartiküllerini 2 mL PBS ("Çözüm 1") halinde bir şişeyi yeniden sulayarak hazırlayın. 10 s için girdap çözeltisi.
  4. 2 mL PBS boncuk süspansiyonuna daha fazla PBS ("Çözüm 2") ile seyreltin.
  5. Sonicate Solution 2 for 8 s ve girdap çözeltisi 10 s. 4 °C'de saklayın. Bu çözüm adım 5.11'de kullanılacaktır.
  6. Kaplamalı iPSC-DM'lerin ortamını çıkarın ve PBS ile yıkayın.
  7. Hoechst 33342 içeren bir PBS çözeltisi ile leke iPSC-DMs 1:20 seyreltilmiş. 37 °C'de 20 dk kuluçka.
  8. Hücreleri PBS ile yıkayın.
  9. 1:1.000 seyreltilmiş derin kırmızı plazma membran lekeiçeren bir PBS Solüsyonu ile leke (Malzeme Tablosubakınız). 37 °C'de 30 dk kuluçka.
  10. Hücreleri PBS ile yıkayın.
  11. iPSC-DM'lerin her kuyuya 4 °C'de tutulan 100 μL boncuk çözeltisi ekleyin. Plakalar görüntüleme için hazır.
  12. Yüksek içerikli görüntüleme sistemi kullanarak plakayı görüntüleyin ve kuyunun iyi bir temsilini elde etmek için kuyu boyunca üç veya daha fazla alan edinin.
  13. Columbus yazılımı (Yüksek İçerikli Görüntüleme analiz sistemi yazılımı) kullanarak fagositoz ölçmek. Belirli bir algoritma net görüntü toplu çözümleme için geliştirilebilir:
    1. Mavi yoğunluğu nu ölçün ve yazılımda mavi sinyalin çekirdekleri gösterdiğini tanımlayın.
    2. Kırmızı yoğunluğu ölçün ve yazılımda kırmızı sinyalin sitoplazmayı gösterdiğini tanımlayın.
    3. Çekirdek ve sitoplazmanın bir hücreye karşılık geldiğini tanımlayın.
    4. Hücrelerdeki yeşil yoğunluğu ölçün ve bir hücreyi fagositik olarak değerlendirmek için katı bir kesme/eşik değeri belirleyin.
    5. Fagositik hücre fraksiyonu ve hücre başına ortalama fagositik indeks ölçün. Boncuk renk yoğunluğu boncuk sayısı ile orantılı olduğundan, fagositik aktivite yutulan boncuk sayısı ile ölçülebilir.
    6. Algoritmayı/ardışık lığı her alandaki ve elde edilen tüm zaman noktalarına uygulayarak hücrelerin fagositik yeteneklerini belirlemek için sağlam ve tarafsız bir toplu iş yaklaşımına olanak sağlar.
      NOT: Columbus hücre fenotipleme ve fonksiyonel test için hücre segmentasyon analizi sunan yüksek içerik analizi yazılımıdır.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farklılaşma progresyonu, makrofaj sayısı ve morfoloji
Sunulan sonuçlar açıklanan ve çalışmalar8,9,,10,26bir dizi kullanılan SFCi55 insan iPSC hattının farklılaşmasından. MAKROFAJLARA doğru IPSC farklılaşma süreci optik mikroskopi ile izlenebilir. iPSC kolonileri, embriyoloid cisimler (EBs), hematopoetik süspansiyon hücreleri ve olgun makrofajlar morfolojik olarak farklıydı(Şekil 2A). Olgun makrofaj morfolojisi santrifüjlü sitospin preparatlarının boyanması ile daha da doğrulanabilir. IPSC kaynaklı makrofajlar büyüktü ve tek küçük oval şekilli çekirdekleri ve birçok vezikül içeren bol sitoplazmaya sahipti(Şekil 2B).

Hematopoetik süspansiyon hücrelerinin ilk 2 haftası (gün 16-28) bir tam 6 kuyu plakası ortalama 2,59 x 106 ± 0,54 hücre içeriyordu. 28. günden sonra, 6 kuyu luk EB'ler başına ortalama 4.64 x10 6 ± 0.94 süspansiyon hücresi üretildi. 80. günden itibaren, EB'ler tükendikçe süspansiyon hücrelerinin sayısı düşmeye başladı (Şekil 2C). Sayılar 6 kuyudaki EB'ler başına hasat başına 3 x 106 öncüllerin altına düştükten sonra farklılaşma protokolünün durdurulması önerilir.

IPSC türetilmiş makrofaj hücre yüzey işaretleri ifadesi
Akış sitometriinsan makrofajlarının fenotipini değerlendirmek için kullanılan en yaygın yöntem olmaya devam etmektedir. Hücre yüzeyi belirteç ekspresyonunu değerlendirmek için gating stratejisi, boyut ve granüleritlik gibi fiziksel parametreleri kullanarak hücrelerin ana popülasyonunun gating ve ardından tek hücreleri ve daha sonra canlı hücreleri gating oluşur(Şekil 3A). Olgun iPSC kaynaklı makrofajlar soy belirteci CD45 ve makrofaj olgunlaşma marker 25F9 ifade etmeli ve monosit / olgunlaşmamış makrofaj marker CD93 için negatif olmalıdır. Bu bizim gözlemler(Şekil 3A)ile tutarlıdır. IPSC kaynaklı makrofajlar da soy miyeloid belirteçleri CD11b, CD14, CD43, CD64, CD115, CD163 ve CD169(Şekil 3B)için pozitifti. Onlar immün modülasyon marker CD86 için pozitif, ve bunların küçük bir kısmı kemoin reseptörleri CX3CR1, CCR2, CCR5 ve CCR8 saf durumda ifade(Şekil 3B). Arsalar daha önce laboratuvarımız8tarafından yayınlanan verilerden elde edilmiştir.

iPSC kaynaklı makrofajlar fagositoz ve polarizasyon
Konak savunma ve doku homeostaz makrofajlar önemli özelliklerinden biri fagositoz patojenler, apoptotik hücreler ve enkaz onlarınyeteneğidir 27. Fagositositaz oranı yakından belirli fenotipik devletler28ile ilişkilidir. iPSC-DM fagositik yeteneğini değerlendirmek için PerkinElmer Operet Mikroskobu ve pHrodo Zymosan biyopartiküllerini (pH duyarlı boya konjujları) kullanan yüksek içerikli görüntüleme sistemi yaklaşımı8,9,11 kullandık. Biyopartiküller kültürlere eklendiğinde floresan değildi(Şekil 4A) ancak hücre içi asidik pH'da floresan parlak yeşil(Şekil 4B). Canlı görüntüleme Operet mikroskobu, toplam 175 dk boyunca boncuk ilaveedildikten sonra her 5 dakikada bir görüntülenecek şekilde ayarlanmıştı. Daha sonra Columbus platformunda, fagositositli boncukların ve her hücrenin yuttuğu boncuk sayısının bir ölçüsü olan fagositik indeksin oranını temsil eden fagositik fraksiyon açısından etkinliği ölçmek için yüksek bir iş bölümü ve tarafsız görüntü analizi boru hattı kullanılmıştır.

Makrofajlar çevresel ipuçlarına bağlı olarak fenotiplerini değiştirebilir ve yanıt verebilir. Çevresel uyaranlara tepki verme ve değiştirme yeteneklerini değerlendirmek için, iPSC-DM'ler LPS ve IFNg, IL4 veya IL10 ile tedavi edilebilir. Tedavinin 48 saat sonra, onlar fenotip değişti, burada M (LPS + IFNg), M (IL4) ve M (IL10), sırasıyla29olarak anılacaktır. Gen ekspresyonu analizi makrofajların polarizasyon durumunu test etmek için yararlı bir araçtır. LPS ve IFNg stimülasyonu üzerine, makrofajlar CD40, VCAM1ve TNFA genlerinin mRNA ekspresyonunu yükseltmiştir (Şekil 5A). IL4 stimülasyonu üzerine, cd68, CD84ve MRC1 (Şekil 5B)genlerin mRNA ekspresyonu hücreleri yukarı düzenlenmiştir. IL10 stimülasyonu üzerine, iPSC-DMs MRC1 upregulated ekspresyonu (Şekil 5B). Fagositoksis açısından, LPS + IFNg veya IL4 ile tedavi edilen makrofajlar naif makrofajlara kıyasla fagositik hücrelerin önemli ölçüde daha düşük bir yüzdesini gösterdi. IL10 ile tedavi edilen iPSC-DM'lerde fagositik hücrelerin ve fagositik indekslerin artmış bir yüzdesi saptanmıştır(Şekil 5C–E).

iPSC'nin makrofajlara farklılaşması; akış diyagramı; BMP4, VEGF, SCF, IL3, CSF1 protokolleri.
Şekil 1: Olgun fonksiyonel makrofajlara göre iPSC farklılaşmasının grafik özeti. Biorender ile çizilmiş diyagram. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Hücre farklılaşma süreci: mikroskop görüntüleri, hücre kültürleri; Büyüme grafiği öncü sayıları gösterir.
Şekil 2: makrofajlara ve iPSC-DM numarası na ve morfolojiye doğru iPSC farklılaşması. (A) (soldan sağa) elde edilen Parlak Alan görüntüleri: BIR IPSC kolonisi, embriyoid cisimler (EBs), hasat süspansiyon hücreleri ve olgun makrofajlar. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Kwik-diff kiti ile boyanmış makrofaj sitospinlerinin görüntüsü. Ölçek çubuğu = 25 μm. (C) Hasat başına toplanan süspansiyon hücrelerinin sayısı 6 kuyu luk EB'ler. Arsa gösterir ortalama + SEM; (n = 6 biyolojik olarak bağımsız deneyler). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

İmmün analiz için hücre sıralama işlemi ve soy işaretleyici histogramları ile akış sitometri diyagramı.
Şekil 3: Makrofaj hücre yüzey marker fenotip. (A) Olgun iPSC kaynaklı makrofajların analizi için gating stratejisi. Tek, canlı hücreler geçitli, daha sonra hücre yüzey işaretleri CD45, CD93 ve 25F9 ifadesi için analiz edildi. Hücre yüzey idikatörlerinin kapıları floresan eksi bir (FMO) kontrolleri kullanılarak çizilmiştir. (B) soy ve miyeloid belirteçler, immün modülasyon belirteçleri, olgunlaşma belirteçleri ve kemokin reseptörleri için iPSC-DM (mavi) ve izotip kontrolleri (gri) tek lekeler için temsili akış sitometri histogramları. Çizimler, CD105 ve CD206 (n = 3) hariç tüm soy ve miyeloid belirteçler için n = 5 biyolojik olarak bağımsız deneyleri temsil eder; olgunlaşma işaretleri (n = 5); immün modülasyon belirteçleri (n = 3); ve kemokin reseptörleri (n = 3). Çizimler daha önce yayımlanmış verileri8kullanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Zaman içinde mikroskopi görüntüleri, fagositik fraksiyon ve indeks çizelgeleri ile fagositoz süreci.
Şekil 4: IPSC-DM polarizasyon ve fagositoz tahlilleri. IPSC-DMs(A)temsili görüntüler zymosan pHrodo yeşil boncuk eklenmesinden hemen sonra ve (B) boncuk eklenmesinden sonra 175 dk. Mavi hücrelerin çekirdeklerini temsil eder; kırmızı hücrelerin sitoplazmasını temsil eder. Yeşil yutulan boncukları temsil eder (Ölçek çubuğu = 20 μm). (C) Fagositik makrofajların fraksiyonu ve (D) fagositik indeks/fagositik makrofaj başına yeşil yoğunluk zaman içinde naif durumda (n = 6 biyolojik olarak bağımsız deneyler). Çizimler ortalama değeri gösterir ve çubuklar SEM temsil eder. Çizimler daha önce yayımlanmışverileri8 kullanın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Makrofajlarda gen ekspresyon analizi; Çubuk grafikler, konfokal mikroskopi, fagositik aktivite grafikleri.
Şekil 5: iPSC-DM polarizasyon durumlarının değerlendirilmesi. (A) M(LPS+IFNΥ) ifadesini değerlendirmek için naif ve polarize iPSC-DM'lerin RT-PCR analizlerinin göreli niceliği; (B) M(IL4) ve M (IL10)ile ilişkili genler (n = 6 biyolojik olarak bağımsız deneyler; Tek yönlü ANOVA ve Holm-Sidak'ın test sonrası çoklu karşılaştırmaları. Polarize gruplar istatistiksel olarak sadece naif grupla karşılaştırıldı). Çizimler ortalama değeri gösterir ve hata çubukları standart sapmayı temsil eder. ND in plots = transkript algılanmadı. Bu çizimler için veriler daha önce8yayınlanmıştır . (C) iPSC-DMs'nin temsili görüntüleri 175 dk ile tedavi edilen iPSC-DM'lerden pHrodo boncuklarının eklenmesinden sonra (soldan sağa): sitokin, LPS+IFN-Y, IL-4 ve IL-10 (Ölçek çubuğu = 20 μm). (D) Fagositik makrofajların fraksiyonu ve (E) fagositik indeks/yeşil yoğunluk fagositik makrofaj başına naif ve polarize makrofaj tedavileri 175 dk boncuk eklenmesinden sonra (n = 12 biyolojik olarak bağımsız deneyler, tek yönlü ANOVA ve Holm-Sidak'ın test sonrası çoklu karşılaştırmaları. Polarize gruplar istatistiksel olarak sadece naif grupla karşılaştırıldı). Çizimler ortalama değeri gösterir ve hata çubukları standart sapmayı temsil eder (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan iPSC-DM'lerin üretimi için protokol sağlamdır ve nispeten az sayıda iPSC'den çok sayıda homojen hücre nin üretilemesine olanak sağlar. Yaklaşık 1 x 106 iPSC'nin ilk farklılaşmasından sonra, sonraki kültürler 2-3 aya kadar her 4 günde bir hasat edilebilir ve bu da bu süre içinde en az 6,5 x 107 makrofaj üretimine yol açabilir. Bu in vitro-oluşturulan insan makrofajlar morfolojik birincil insan makrofajlar benzer, anahtar makrofaj hücre yüzey belirteçleri ifade, ve fagositik aktivite sergiler. Makrofaj farklılaşması için protokol tekrarlanabilir ve diğer hiPSC ve hESC hücre hatlarına uygulanabilir, ancak makrofaj öncülerinin ilk hasadının kesin zamanlaması ve oluşturulabilen hücrelerin mutlak sayıları iPSC çizgileri arasında değişir.

Genetik olarak manipüle edilmiş iPSC'lerden makrofajlar üretilebildiği gösterilmiştir. Örneğin, kurucu CAG organizatörü kontrolü altında floresan muhabiri ZsGreen oluşan bir transgen kaset SFCi55 iPSC hattının AAVS1 locus içine yerleştirildi, ve daha sonra bu iPSC hattı ZsGreen ifade makrofajlar8içine ayırt edilebilir gösterildi . Bu floresan makrofajlar ileride hastalık modellerinde terapötik makrofajların göçve stabilitesini izlemek için kullanılabilir. Başka bir çalışmada, makrofajlar genetik tamoksifen kaynaklı transkripsiyon faktörü ifade etmek için manipüle edilmiş bir iPSC hattı oluşturuldu, KLF1. IPSC kaynaklı makrofajlarda KLF1 aktivasyonu, eritroid adasının makrofajlarına benzer bir fenotip ile makrofajüretimi ile sonuçlandı9. Potansiyel olarak, bu strateji genetik olarak iPSC kaynaklı makrofajların karaciğerin Kupffer hücreleri veya cildin Langerhans hücreleri gibi dokuya özgü makrofaj popülasyonları ile ilişkili fenotiplere programedilmesi için kullanılabilir. Bu hücre türlerini tanımlayan anahtar transkripsiyon faktörleri tanımlandıktan sonra bu mümkün olacaktır.

Protokol açısından, iPSC'lerin başlangıç popülasyonunun durumunun başarılı bir farklılaşma için kritik öneme sahip olduğunu belirtmek çok önemlidir. İnsan iPSC kültürleri çeşitli pasajlar üzerinde karyotipik anormal alt popülasyonları ile istila edilebilir, bu nedenle genom kalite kontrolüne tabi tutulan iPSC stoklarının ve büyük toplu ana stokların sağlam kürasyonu önerilir. Elimizde, burada açıklanan bakım protokolleri sürekli kültürde 2 aya kadar karyotipik normal iPSC'leri koruyabilir, ancak bu farklı hücre hatları ve farklı laboratuvarlarda değişebilir. Sorunlarla karşılaşılırsa, her farklılaşma denemesi için yeni bir farklılaşmamış iPSC şişesi kullanılması tavsiye edilir. Buna ek olarak, farklılaşmamış iPSC'lerin başlangıç kültürü en fazla% 80 eşzamanlı olmalıdır. EB kaplama aşamasında, sadece 10-15 EBs bir kuyu başına kaplanmış olmalıdır 6 iyi doku kültürü plaka, ve bu EBs kuyu boyunca eşit olarak yayılır önemlidir. Kuyunun merkezinde daha fazla sayıda EB ve/veya EB'nin kümelenmeleri, üretilen makrofaj ların sayısı üzerinde olumsuz bir etki yaratmıştı. Eb kültürlerinden monosit benzeri progenitor süspansiyon hücrelerinin toplanması ve eB'lerin kaplamalı kültür plakalarının yüzeyine yapışmasını rahatsız etmemek için ortam yenilenirken ve toplanırken dikkatli olunmalıdır. Üretilen hematopoetik süspansiyon hücrelerinin sayısı her hasatta kademeli olarak artar ve 40-72 gün arasında en iyi üretim le birlikte farklılaşma(Şekil 2). Üretim 68 gün sonra giderek azalır ve plakalar 2,5 ay sonra egzoz eğilimindedir, kesin zamanlama iPSC hattına bağlı olarak değişebilir rağmen.

Protokolümüzün bir sınırlaması, Evre 2'nin sonunda oluşan hematopoetik süspansiyon hücrelerinin kriyokorunmuş olmasıdır. WNT'nin eksojen aktivasyonuna dayanan protokoller kriyopreservation sonrası %40 iyileşme hızı rapor eder, ancak bu protokoller yalnızca bir hücre hasadını rapor eder, bu nedenle oluşturulan makrofajların mutlak sayısı30'dur. Burada açıklanan protokol, EB'lerin oluşumu yoluyla endojen sinyalizasyon indükleyen, çok daha yüksek bir toplam makrofaj verim üreten, iki haftada bir hasat edilebilir.

Özetle, fonksiyonel iPSC kaynaklı makrofajların üretimi için ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Sağlık ve hastalıkta makrofaj biyolojisini incelemek için iPSC kaynaklı makrofajlarla in vitro deneylerin kurulması, monosit kaynaklı makrofajlar (MdM) ile yapılan deneylere göre birçok avantaja sahiptir. Bu avantajlar malzemeye erişilebilirlik kolaylığı (örneğin, hiçbir donör gereklidir), makrofajlar çok büyük miktarda üretilebilir ve uygulanabilir ve nispeten genetik olarak değiştirilmiş makrofajlar üretmek için basittir. Ayrıca, iPSC kaynaklı makrofajlar doku yerleşik makrofaj biyolojisi çalışması için daha iyi bir kaynak olabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan etmek için çıkar çatışması yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz akış sitometri, Eoghan O'Duibhir ve Bertrand Vernay mikroskopi ile yardım için Fiona Rossi ve Claire Cryer teşekkür ederiz. Bu çalışma CONACYT (M.L.-Y.), Wellcome Trust (102610) ve Innovate UK (L.M.F), Wellcome Trust Doktora öğrencisiliği (A.M), MRC Hassas Tıp Öğrenciliği (T.V) tarafından finanse edilmiştir. L.C. ve J.W.P. Wellcome Trust (101067/Z/13/Z), Medical Research Council (MR/N022556/1) ve COST Action BM1404 Mye-EUNITER (http://www.mye-euniter.eu) tarafından desteklendi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2-Merkaptoetanol (50 mM)İnvitrojen31350010
Abtibody CD64-APC -CY7Biyoefsane305026Seyreltme faktörü: 1:100
Antikor 25F9-EFLUOR 660Ebioscience15599866Seyreltme faktörü: 1:20
Antikor CCR2-PE-CY7Biyoefsane357212Seyreltme faktörü: 1:100
Antikor CCR5 PE Biyoefsane313707Seyreltme faktörü: 1:100
Antikor CCR8 PEBiolegend360603Seyreltme faktörü: 1:100
Antikor CD11b-PEBiolegend301305Seyreltme faktörü: 1:50
Antikor CD14-APCEbioscience10669167Seyreltme faktörü: 1:20
Antikor CD163-PE-CY7BIolegend333614Seyreltme faktörü: 1:25
Antikor CD169-APCBiolegend346007Seyreltme faktörü: 1:25
Antikor CD206-PEBiolegend321106Seyreltme faktörü: 1:100
Antikor CD209-PE-CY7Biolegend3310114Seyreltme faktörü: 1:100
Antikor CD274-PE-CY7Biyoefsane329718Seyreltme faktörü: 1:100
Antikor CD43-PEEbioscience10854419Seyreltme faktörü: 1:100
Antikor CD45-APCEbioscience15577936Seyreltme faktörü: 1:20
Antikor CD86-APCBiolegend305412Seyreltme faktörü: 1:100
Antikor CD93-PEEbioscience10804637Seyreltme faktörü: 1:100
Antikor CX3CR1-PEBiolegend307650Seyreltme faktörü: 1:100
Antikor HLA-DR-BV650Biyoefsane307650Seyreltme faktörü: 1:100
Antiboy CD115-PEBiolegend347308Seyreltme faktörü: 1:40
Hücre Ayrışma Tamponu, enzim içermeyenThermofisher13151014
Hücre Ayrışma Tamponu, enzim içermez, PBSGibco13151014
CellCarrier-96 Ultra Mikroplakalar, doku kültürü ile işlenmiş, siyah, 96 oyukluPerkinElmer6055302
CellMask Koyu Kırmızı Plazma Membran LekesiThermofisherC10046Kriyoprezervasyon ortamı
Cryostor CS10SigmaC2874
CTS CELLstart SubstratInvitrogenA1014201Kök hücre substratı
DAPIMerckD9542-1MGNihai konsantrasyon 1 & mu; g/mL
DPBS, kalsiyum, magnezyum (500 mL)Thermofisher14040091
FcR Bloke Edici Reaktif, insanMACS Miltenyi Biotec130-059-901
FGF-Temel (AA 10-155) Rekombinant İnsan ProteiniThermofisherPHG0021
GlutaMAX TakviyesiThermofisher35050061
İnsan Rekombinant IFNYThermofisher14-8319-80
İnsan Serumu AlbüminumIrvine Scientific9988
E. Coli Sigma'dan Lipopolisakkarit (LPS)L2630
NucBlue (Hoechst33342)ThermofisherR37605
pHrodo Yeşil Zymosan Fagositoz için Biyopartiküller KonjugatıThermofisherP35365
Domuz Derisi JelatinSigmaG9136
Rekombinant İnsan BMP4 Protein R& D314-BP-010
Rekombinant İnsan IL10Preprotech200-10
Rekombinant İnsan IL3Preprotech200-03-10
Rekombinant İnsan IL4Preprotech200-04
Rekombinant İnsan MCSF (taşıyıcısız) 100 & mu; gBiolegend574806
Rekombinant İnsan VEGF Proteini R& D293-VE-010
Kaya İnhibitörü Y-27632MerckSCM075
SCF (C-Kit Ligandı) Rekombinant İnsanProteini ThermofisherPHC2111
StemPro hESC SFMThermofisherA1000701
EZPassage Tek Kullanımlık Kök Hücre Geçiş AracıThermofisher23181010
Ultra düşük bağlantı plakaları: Hücre kültürü çok kuyulu plaka, 6 oyuklu, hücre yıldızı hücre itici yüzeyGreiner657970
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020
X-Vivo 15 500 mL şişeLonzaBE02-060F
StemPro

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  3. Focosi, D., Amabile, G. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Red Blood Cells and Platelet Concentrates: From Bench to Bedside. Cells. 7 (1), (2017).
  4. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. IPS cells: A game changer for future medicine. EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  5. Lachmann, N., et al. Large-Scale Hematopoietic Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Provides Granulocytes or Macrophages for Cell Replacement Therapies. Stem Cell Reports. 4 (2), 282-296 (2015).
  6. Kuhn, A., et al. TALEN-mediated functional correction of human iPSC-derived macrophages in context of hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
  7. Ackermann, M., et al. Ex vivo Generation of Genetically Modified Macrophages from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 44 (3), 135-142 (2017).
  8. Lopez-Yrigoyen, M., et al. A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), (2018).
  9. Lopez-Yrigoyen, M., et al. Genetic programming of macrophages generates an in vitro model for the human erythroid island niche. Nature Communications. 10 (1), 881(2019).
  10. Cassetta, L., et al. Human Tumor-Associated Macrophage and Monocyte Transcriptional Landscapes Reveal Cancer-Specific Reprogramming, Biomarkers, and Therapeutic Targets. Cancer Cell. 35 (4), 588-602 (2019).
  11. Haideri, S. S., et al. Injection of embryonic stem cell derived macrophages ameliorates fibrosis in a murine model of liver injury. NPJ Regenerative Medicine. 2, 1-10 (2017).
  12. van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PLoS One. 8 (8), 71098(2013).
  13. Pandya, H., et al. Differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells to microglia-like cells. Nature Neuroscience. 20 (5), 753-759 (2017).
  14. Douvaras, P., et al. Directed Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Microglia. Stem Cell Reports. 8 (6), 1516-1524 (2017).
  15. Heideveld, E., et al. Methods for macrophage differentiation and in vitro generation of human tumor associated-like macrophages. Methods in Enzymology. , 1-18 (2019).
  16. Leary, A. G., et al. Synergism between interleukin-6 and interleukin-3 in supporting proliferation of human hematopoietic stem cells: comparison with interleukin-1 alpha. Blood. 71 (6), 1759-1763 (1988).
  17. Robin, C., et al. An Unexpected Role for IL-3 in the Embryonic Development of Hematopoietic Stem Cells. Developmental Cell. 11 (2), 171-180 (2006).
  18. Moldenhauer, A. Hematopoietic progenitor cells and interleukin-stimulated endothelium: Expansion and differentiation of myeloid precursors. BMC Immunology. 9, 56(2008).
  19. Kodama, H., Nose, M., Shumpei Niida, S., Yarnasakit, A. Essential Role of Macrophage Colony-Stimulating Factor in the Osteoclast Differentiation Supported by Stromal Cells. Brief Definitive Report. , 1291-1294 (1991).
  20. Bender, A. T., Ostenson, C. L., Giordano, D., Beavo, J. A. Differentiation of human monocytes in vitro with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and macrophage colony-stimulating factor produces distinct changes in cGMP phosphodiesterase expression. Cellular Signalling. 16 (3), 365-374 (2004).
  21. Klimchenko, O., et al. Monocytic cells derived from human embryonic stem cells and fetal liver share common differentiation pathways and homeostatic functions. Blood. 117 (11), 3065-3075 (2011).
  22. Alasoo, K., et al. Transcriptional profiling of macrophages derived from monocytes and iPS cells identifies a conserved response to LPS and novel alternative transcription. Scientific Reports. , August 1-15 (2015).
  23. Buchrieser, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Macrophages Share Ontogeny with MYB-Independent Tissue-Resident Macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
  24. Vanhee, S., et al. In vitro human embryonic stem cell hematopoiesis mimics MYB-independent yolk sac hematopoiesis. Haematologica. 100 (2), 157-166 (2015).
  25. Abud, E. M., et al. iPSC-Derived Human Microglia-like Cells to Study Neurological Diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
  26. Yang, C. -T., et al. Activation of KLF1 Enhances the Differentiation and Maturation of Red Blood Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).
  27. Karavitis, J., Kovacs, E. J. Macrophage phagocytosis: effects of environmental pollutants, alcohol, cigarette smoke, and other external factors. Journal of Leukocyte Biology. 90 (6), 1065-1078 (2011).
  28. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
  29. Murray, P. J., et al. Macrophage Activation and Polarization: Nomenclature and Experimental Guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  30. Cao, X., et al. Differentiation and Functional Comparison of Monocytes and Macrophages from hiPSCs with Peripheral Blood Derivatives. Stem Cell Reports. 12, 1282-1297 (2019).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

iPSC K kenli MakrofajlarAk SitometrisiFagositoz AktivitesiH cre DiferansiyasyonuGenetik Manip lasyonCD45 Mark r25F9 Mark rY ksek erikli G r nt leme

İlgili makaleler