Method Article

Host Aralığı ve Görsel Seçimi Kullanarak Rekombinant Poxviruses Hızlı, Sorunsuz Nesil

DOI:

10.3791/61049

⸱

May 24th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medial Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of California Davis, 2Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch at Galveston

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu konak aralığı seçimi ve rekombinant virüslerin görsel kimlik kullanarak "scarless" rekombinant vaccinia virüsler oluşturmak için bir yöntemdir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vaccinia virüsü (VACV) variola virüsünün (VARV) kökünün kazınmasına yardımcı oldu. Vacv, aşı olarak ilk kullanımından bu yana terapötik aşılar için vektör ve onkolitik virüs olarak geliştirilmiştir. Bu uygulamalar, VACV'un kolayca manipüle edilen genomundan ve çeşitli terapötik uygulamalarla rekombinant virüsler oluşturmak için olağanüstü bir platform olarak geniş ana bilgisayar aralığından yararlanır. Marker seçimi yöntemleri ve geçici baskın seçki dahil olmak üzere rekombinant VACV oluşturmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Burada, rekombinant virüslerin görsel tanımlaması ile birleştiğinde bir ana dizi seçim yöntemi nin bir iyileştirmesi salıyoruz. Yöntemimiz, iki VACV PKR antagonistinden biri olan mCherry etiketli E3L'yi ifade eden floresan füzyon geni ile birleşen konak antiviral protein kiazaz R (PKR) tarafından oluşturulan seçici basınçtan yararlanır. Kaset, ilgi geni ve mCherry-E3L füzyon uvacv genomundan elde edilen diziler ile çevrilidir. İlgi geni ve mCherry-E3L arasında homolog rekombinasyon ve seçim den sonra mCherry-E3L geni kaybıteşvik etmek için, 3 'kol ilk ~ 150 nükleotitler aynı daha küçük bir bölgedir. Bu yöntemin, mutant virüsler için ilaç seçimi veya kapsamlı tarama gerektirmeden çeşitli hücre tiplerinde verimli ve sorunsuz rVACV üretimine izin verdiğini gösteriyoruz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vaccinia virüsü (VACV) bir insan patojeni ilk başarılı eradikasyon için aracı oldu, variola virüsü (VARV), doğadan. Variola virüsünün yok edilmesinden bu yana, VACV dahil olmak üzere poxviruses hem insan hem de hayvan tıbbı için yararlı terapötik virüsler olmaya devam edilmiştir. Örneğin, bir VACV tabanlı kuduz virüsü aşısıAvrupa'da sylvatic kuduz bulaşmasını önlemede çok etkili olmuştur 1 ve Amerika Birleşik Devletleri2. Daha yakın zamanda, anti-tümör molekülleri çeşitli ifade rekombinant poxviruses (örneğin, tek zincirli antikorlar veya insan eritropoietin) onkolitik ajanlar olarak teşvik başarı gördük

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Rekombinasyon vektörü oluşturma

  1. Seçim kasetini oluşturmak için astarlar tasarlayın. Birkaç online astar tasarım araçları herhangi birini kullanarak, aynı zamanda Gibson montaj olarak adlandırılan DNA moleküllerinin izomal enzimatik montaj kolaylaştırmak için komşu amplicons ve vektör ile örtüşen dizileri ile her bir amplicon tasarım.
    NOT: Bu protokol geleneksel kısıtlama endonükleaz bazlı klonlama yöntemleri kullanılarak da tamamlanabilir. Bu durumda, çakışan diziler yerine uygun kısıtlama siteleri ile tasarım astarları.
  2. 1.1 adımda tasarlanan astarları kullanarak, PCR aşağıdaki elementleri 5' ila 3'(Şekil 1):~500....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1'de diyagramlanan yordamı, Hem PKR antagonistleri E3L hem de K3L'den yoksun bir VACV oluşturmak için, E3L'yi K3L (vP872) için silinmiş bir virüste EGFP ile değiştirerek kullandık. Şekil 2 PKR yetkili RK13 hücrelerinde kırmızı floresan plaklar mCherry-E3L viral ekspresyonu gösteren yanı sıra RK13 +E3L+K3L hücrelerinde e3L kaybını ve mCherry-E3L seçim belirteci çöküşünü doğrulayan EGFP'yi göstermektedir. Şekil 3 bu rekombinant .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada son rekombinant virüs yabancı DNA tutmadan rekombinant vaccinia virüsleri oluşturmak için geçici bir marker seçim stratejisi 32 bir varyasyonu sıyoruz. Stratejimiz, antibiyotikler gibi diğer seçici basınç biçimleri yerine ev sahibi antiviral protein PKR aracılığındaki seçici basıncı kullanır. Konak antiviral genlerin kullanımı hücrelerde kimyasal kaynaklı fenotipik değişiklikler olasılığını ortadan kaldırır, ya da seçim ilaçları nedeniyle mutasyon riskinin artması. Ayrıca, ilaç seçiminden f.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu proje Ulusal Sağlık Enstitüleri (AI114851) tarafından SR'ye finanse edilmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2X-Q5 Master MixNEBM0492LPCR Ampisilin'de kullanılan yüksek kaliteli polimeraz
ThermoFisher Scientific11593027Bakteriyel seçici ajan
Tek Kullanımlık Hücre SıyırıcılarThermoFisher Scientific08-100-242Enfekte hücreleri hasat etmek için hücre sıyırıcı
EVOS FL Auto 2 Hücre görüntüleme sistemiThermoFisher ScientificAMAFD2000Floresan mikroskop
EVOS Işık Küpü, GFPThermoFisherAMEP4651GFP Küpü
EVOS Işık Küpü, RFPThermoFisherAMEP4652RFP Küpü
GenJetSignaGen LaboratuvarlarıSL100489Transfeksiyon reaktifi
Luria Bertani (LB) Et suyuGibco10855021Bakteri üreme ortamı
Monarch DNA jel ekstraksiyon kitiAmplikonları ve doğrusallaştırılmış vektörleri saflaştırmak için kullanılanT1020L
Monarch Plazmid Miniprep kitiNEBT1010LMiniprep kiti, plazmitleri saflaştırmak için kullanılır
RNA ve DNA konsantrasyonunu ölçmek için kullanılanNanoDrop OneThermoFisher ScientificND-ONE-W
NEBuilder Master MixNEBE2621LRekombinasyon vektörü Q500 Sonicator'ı oluşturmak için kullanılan izotermal enzimatik montaj kiti
SonicaQ500-110Virüs lizatları için sonikatör
RK13 hücreleriATCCCCL-37Tavşan böbrek hücreleri
VWR Multiwell Hücre Kültürü plakalarıVWR10062-892Hücre kültürü plakaları
NEB Jel saflaştırma kiti Spektrofotometre

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brochier, B., et al. Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine. Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).
  2. Pastoret, P. P., Brochier, B. The development and ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Recombinant Vaccinia VirusHost Range SelectionFluorescent Marker SelectionHomologous RecombinationmCherry E3L FusionPKR Competent CellsPlaque PurificationFluorescence MicroscopyPoxvirus ModificationVaccine Production

Related Articles