Lanthipeptide sentezleri peptit doğal ürünlerin biyosentezi sırasında katalizör multistep reaksiyonları. Burada, lanteptid sentezlerinin konformasyonel dinamiklerini ve peptit doğal ürün biyosentezinde yer alan diğer benzer enzimleri incelemek için bunların kullanılabileceği sürekli, aşağıdan yukarıya, hidrojen-döteryum değişim kütle spektrometresi (HDX-MS) iş akışını açıklıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Peptit Biyosintetik Enzimleri Araştırmak için Hidrojen-Döteryum Değişim Kütle Spektrometresi (HDX-MS) Platformu
Bu makalede
Özet
Özet
Hidrojen-döteryum değişim kütle spektrometresi (HDX-MS), enzim konformasyon değişikliklerinin ve enzim-substrat etkileşimlerinin biyofiziksel karakterizasyonu için güçlü bir yöntemdir. HDX-MS, birçok faydası arasında sadece az miktarda malzeme tüketir, enzim/substrat etiketlemesine gerek kalmadan yakın yerel koşullar altında gerçekleştirilebilir ve büyük enzimler ve multiprotein kompleksleri için bile enzim konformasyonsal dinamikleri−hakkında mekansal olarak çözülmüş bilgiler sağlayabilir. Yöntem, ilgi çekici enzimin D2O'da hazırlanan tampona seyreltilmesiyle başlatılır. Bu, peptit bağı amidlerinde (N-H) protiyumun döteryum (N-D) ile değişimini tetikler. İstenilen değişim zaman noktalarında reaksiyon aliquotları söndürülür, enzim peptitlere proteoliz edilir, peptitler ultra performanslı sıvı kromatografisi (UPLC) ile ayrılır ve her peptitin kütleslerindeki değişim (hidrojenin döteryum ile değişimi nedeniyle) MS tarafından kaydedilir. Her peptit tarafından döteryum alımı miktarı, bu peptitin yerel hidrojen yapıştırma ortamına bağlıdır. Enzim değişim döteryumunun çok dinamik bölgelerinde çok hızlı bir şekilde bulunan peptitler bulunurken, iyi sıralanmış bölgelerden elde edilen peptitler çok daha yavaş bir değişime uğrar. Bu şekilde, HDX oranı lokal enzim konformasyon dinamiklerini rapor eder. Farklı ligandların varlığında döteryum alma seviyelerine pertürbasyonlar daha sonra ligand bağlama alanlarını haritalamak, allosterik ağları tanımlamak ve enzim fonksiyonundaki konformasyonel dinamiklerin rolünü anlamak için kullanılabilir. Burada, lanteptid adı verilen bir tür peptit doğal ürünün biyosentezini daha iyi anlamak için HDX-MS'i nasıl kullandığımızı gösteriyoruz. Lanthipeptides, geleneksel yapısal biyoloji yaklaşımlarıyla incelenmesi zor olan büyük, çok işlevli, konformasyonel dinamik enzimler tarafından çeviri sonrası değiştirilen genetik olarak kodlanmış peptitlerdir. HDX-MS, bu tür enzimlerin mekanistik özelliklerini araştırmak için ideal ve uyarlanabilir bir platform sağlar.
Giriş
Proteinler, femtosaniye ölçeğindeki bağ titreşiminden, birçok saniye içinde meydana gelebilecek tüm protein etki alanlarının yeniden düzenlenmesine kadar zaman ölçeklerinde farklı konformasyonları örnekleyen yapısal olarak dinamik moleküllerdir1. Bu konformasyonsal dalgalanmalar genellikle enzim/protein fonksiyonunun kritik yönleridir. Örneğin, ligand bağlamanın neden olduğu konformasyonel değişiklikler, kataliz için gerekli aktif saha kalıntılarını düzenleyerek, sıralı kinetik mekanizmalarda substrat bağlama bölgelerini tanımlayarak, reaktif ara maddeleri ortamdan koruyarak veya allosterik ağlar aracılığıyla enzim fonksiyonunu modüle ederek enzim fonksiyonunu modüle etmek için genellikle kritik öneme sahiptir. Son çalışmalar ayrıca, konformasyonel dinamiklerin evrim boyunca korunabileceğini ve korunmuş moleküler hareketlere pertürbasyonların substrat özgüllüğündeki değişiklikler ve yeni enzim fonksiyonlarının ortaya çıkması ile ilişkili olabileceğini göstermiştir2,3.
Son yıllarda, hidrojen-döteryum değişim kütle spektrometresi (HDX-MS), protein konformasyonel manzaraların ligand bağlama veya mutajensis 4 ,5,6,7gibi pertürbasyonlara nasıl tepki verdiğini araştırmak için güçlü bir teknik olarak hızla ortaya çıkmıştır. Tipik bir HDX-MS deneyinde (Şekil 1), D2O'da hazırlanan tampona bir ilgi proteini yerleştirilir, bu da çözücü değiştirilebilir protonların döter ile değiştirilmesini tetikler. Peptit bağlarının amid moiety'nin değişim oranı, pH'a, yerel amino asit dizisine ve amide8'inyerel yapısal ortamına bağlıdır. Hidrojen yapıştırma etkileşimleri yapan amidler (α-helices ve β yapraklarında bulunanlar gibi) proteinin toplu çözücüye maruz kalan yapılandırılmamış bölgelerindeki ortalardan daha yavaş değiş tokuş eder. Bu nedenle, döteryum alımının kapsamı enzimin yapısının bir yansımasıdır. Konformasyonsal olarak dinamik olan veya ligand bağlanması üzerine yapısal geçişler geçiren enzimlerin ölçülebilir bir HDX yanıtı vermesinin beklenebilir olması beklenir.
Yapılandırılmış bir amidin yavaş döviz kurunun mekanistik temeli Şekil 2 5,8,9'da gösterilmiştir. HDX'e tabi tutulabilmesi için, yapılandırılmış bölgenin öncelikle, hdx değişimini belirli bir asit / baz kimyasal mekanizma ile katalİze eden çözücü moleküllerinin değiştirilebilir amide erişebilmesi için geçici olarak açılmış bir uygunluğu örneklemesi gerekir. Sonuçta, kimyasal döviz kurunun(kkimyası)göreli büyüklükleri ve katlama ve yeniden katlama oranları (kaçık ve kkapanış) deneyde ölçülen HDX oranını belirler5,8. Bu basit kinetik modelden, döteryum alımının kapsamının alttaki konformasyonsal dinamikleri yansıtacağı açıktır (kaçık ve kkapanışıile tanımlandığı gibi). Çoğu HDX-MS deneyi, değişim reaksiyonunu takiben, ilgi proteininin peptitlere sindirildiği ve her peptit tarafından döteryum alımının kütle7'debir artış olarak ölçüldüğü aşağıdan yukarıya bir iş akışında gerçekleştirilir. Bu şekilde, HDX-MS, pertürbasyonların enzim konformasyonel dinamiklerin peptitlerin yerel mekansal ölçeğinde eşlenmesine izin verir ve araştırmacının pertürbasyonun ilgi enziminin farklı bölgelerindeki dinamikleri nasıl değiştirdiğini değerlendirmesini sağlar.
HDX-MS yaklaşımının protein yapısal dinamiklerini aydınlatıcı avantajları çoktur. İlk olarak, yöntem küçük miktarlarda yerli proteinle veya kuaterner yapıya sahip sistemlerde protein kompleksleri üzerindegerçekleştirilebilir 10. Aşağıdan yukarıya HDX-MS iş akışı, ilgi protein dizisini kapsayan yeterli sayıda güvenle tanımlanmış peptit sağladığı sürece, testte kullanılan enzim preparatının yüksek orandasaflaştırılması11,12, için bile gerekli değildir. Ayrıca, HDX-MS, tek moleküllü floresan çalışmalarında kullanılacağı gibi bölgeye özgü protein etiketlemesine gerek kalmadan yakın yerel koşullar altında konformasyonsal dinamikler hakkında bilgi sağlayabilir13ve araştırılabilen protein veya protein kompleksinin boyut sınırı yoktur (nükleer manyetik rezonans [NMR] spektroskopisi gibi yaklaşımları zorlaştırır)7,14. Son olarak, X-ışını kristalografisi 15 , 16,17,18ile incelenmesi zor olan özünde düzensiz proteinleri incelemek için zaman çözümlenmiş HDX-MS yöntemleri kullanılabilir. HDX-MS'in ana sınırlaması, verilerin düşük yapısal çözünürlükte olmasıdır. HDX-MS verileri, konformasyonsal dinamiklerin nerede değiştiğine işaret etmek ve birleştirilmiş konformasyon değişikliklerini ortaya çıkarmak için yararlıdır, ancak genellikle gözlemlenen değişimi yönlendiren hassas moleküler mekanizma hakkında çok fazla bilgi sağlamaz. Elektron yakalama ayrışma yöntemlerinin protein HDX-MS verileriyle kombinasyonundaki son gelişmeler, değişim alanlarının tek amino asit kalıntıları19ile eşlenmesi için umut vaat etmektedir, ancak HDX-MS verileri tarafından iletilen yapısal modellere netlik sağlamak için biyokimyasal ve yapısal çalışmaların takip edilmesi hala sıklıkla gereklidir.
Aşağıda, hdx-ms test geliştirilmesi için ayrıntılı bir protokol20. Aşağıda sunulan numune hazırlama protokolleri genellikle sulu tamponlarda iyi çözünürlük gösteren herhangi bir protein için geçerli olmalıdır. Proteinler için deterjan veya fosfolipidler21, 22, 23, 24varlığında test edilmesi gerekenden daha özel numune hazırlama yöntemleri ve HDX-MS iş akışları mevcuttur. HDX-MS veri toplama için enstrümantal ayarlar, sıvı kromatografi sistemine bağlı olarak yüksek çözünürlüklü dörtlü uçuş süresi kütle spektrometresi için açıklanmıştır. Benzer karmaşıklık ve çözünürlük verileri, piyasada bulunan bir dizi sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) sisteminden herhangi birinde toplanabilir. Ticari olarak kullanılabilen bir yazılım paketi kullanılarak veri işlemenin önemli yönleri de sağlanır. Ayrıca, daha geniş HDX-MS topluluğu12tarafından yapılan önerilerle tutarlı veri toplama ve analiz kılavuzları sunuyoruz. Açıklanan protokol, bir antimikrobiyal peptit doğal ürününün multistep olgunlaşmasını katalize eden bir lantiipeptid sentezi olan HalM2'nin dinamik yapısal özelliklerini incelemek için kullanılır20. HDX-MS'in alt tabaka bağlama sitelerini ve önceki karakterizasyondan kaçan allosterik özellikleri ortaya çıkarmak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Protein HDX-MS ile ilgili diğer birkaç protokol son yıllarda yayınlanmıştır25,26. Mevcut çalışma ile birlikte, bu önceki katkılar okuyucuya deneysel tasarımda biraz esneklik sağlamalıdır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Kısırlaştırılmış reaktiflerin ve enzim stok çözeltilerinin hazırlanması
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Proteolitik sindirimin kalitesini ve her örnek enjeksiyon kümesi için iş akışının tekrarlanabilirliğini değerlendirmek gerekir. Bu nedenle, HDX-MS tahlillerini yapmadan önce, ilgi çekici proteinin proteolizi, ters faz sıvı kromatografisi ve gaz fazı iyon hareketliliği kullanılarak peptitlerin ayrılması ve MS kullanılarak peptitlerin tespiti için etkili koşulların oluşturulması esastır. Bu amaçla öncelikle ilgi çekici proteine yönelik referans örnekleri (döteryum yokluğunda toplanır) araştırılmalıdır (bölüm 3).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokolde sunulan HDX-MS iş akışı, proteinlerdeki yapısal dinamik elemanların mekansal dağılımını haritalamak ve bu dinamiklerin pertürbasyona (ligand bağlama, enzim mutagenezi vb.) yanıt olarak nasıl değiştiğini araştırmak için son derece sağlam bir platform sağlar. HDX-MS, konformasyonsal dinamikleri araştırmak için yaygın olarak kullanılan diğer yapısal biyoloji yaklaşımlarına göre birkaç farklı avantaja sahiptir. En önemlisi, sadece az miktarda proteine ihtiyaç vardır. Burada açıklanan iş akışını kullanarak, 1 μM...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Açıklayacak bir şeyimiz yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendisliği Araştırma Konseyi, Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, Kanada İnovasyon Vakfı ve McGill Üniversitesi başlangıç fonları tarafından desteklendi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktifler< / güçlü > | |||
| [glu-1] -fibrinopeptid B (Glu-Fib) | BioBasic | NA | |
| 0.5 mL Amicon Ultracel 10k santrifüj filtrasyon cihazı (Millipore) | Milipore Sigma | UFC501096 | |
| asetonitril | Fisher | A955-1 | |
| AMP-PNP | SIGMA | A2647-25MG | |
| ATP | SIGMA | a2383-5G | |
| D2O | ALDRICH | 435767-100G | |
| formik asit | Thermo Fisher | 28905 | |
| guanidin-HCl | VWR | 97063-764 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Magnezyum klorür | SiGMA-Aldrich | 63068-250G | |
| Potasyum klorür | BioBasic | PB0440 | |
| potasyum fosfat | BioBasic | PB0445 | |
| TCEP Hydrochloride | TRC Canada | T012500 | peptidi istek üzerine sentezlendi |
| Malzeme Adı/ Ekipman< / strong> | Company< / strong> | Katalog Numarası< / strong> | Yorumlar / strong<> |
| software | |||
| Deuteros | Andy MC Lau, et al | sürüm 1.08 | |
| DynamX | Waters | sürüm 3.0 | |
| MassLynx | Waters | sürüm 4.1 | |
| Protein Lynx Global Server (PLGS) | Waters | sürüm 3.0.3 | |
| PyMOL | Schrö dinger | sürüm 2.2.2 | |
| Malzemenin / Ekipmanın Adı | Company | Katalog Numarası | Yorumlar/Açıklama |
| Alet ve ekipman | |||
| ACQUITY UPLC BEH C18 analitik Kolon | Sular | 186002346 | |
| ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Ön Sütun | Suları | 186003978 | |
| ACQUITY UPLC M-Sınıfı HDX Sistem | Suları | ||
| HDX Yöneticisi | Sular | ||
| mikrouçlu pH elektrodu | Thermo Fisher | 13-620-291 | |
| Waters Enzymate BEH sütunu veya Pepsin solumn | Sular | 186007233 | |
| Sular Synapt G2-Si | Suları |
Kaynaklar
- Karplus, M., McCammon, J. A. Molecular dynamics simulations of biomolecules. Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).
- Campbell, E., et al. The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function. Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).
- Tokuriki, N., Tawfik, D. S. Protein dynamism and evolvability. Science. 324 (5924), 203-207 (2009).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25 (1), 158-170 (2006).
- Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224(2011).
- Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (4), 214(1991).
- Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Science. 2 (4), 522(1993).
- Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
- Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
- Xiao, K., et al. Revealing the architecture of protein complexes by an orthogonal approach combining HDXMS, CXMS, and disulfide trapping. Nature Protocols. 13 (6), 1403-1428 (2018).
- Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
- Masson, G. R., et al. Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments. Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).
- Liu, J., et al. An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore. Scientific Reports. 5, 16883(2015).
- Marion, D., et al. Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta. Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).
- Balasubramaniam, D., Komives, E. A. Hydrogen-exchange mass spectrometry for the study of intrinsic disorder in proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1834 (6), 1202-1209 (2013).
- Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
- Keppel, T. R., Howard, B. A., Weis, D. D. Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry. Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).
- Mitchell, J. L., et al. Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein. Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
- Habibi, Y., Uggowitzer, K. A., Issak, H., Thibodeaux, C. J. Insights into the Dynamic Structural Properties of a Lanthipeptide Synthetase using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14661-14672 (2019).
- Hebling, C. M., et al. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (13), 5415-5419 (2010).
- Duc, N. M., et al. Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).
- Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
- Reading, E., et al. Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions. Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).
- Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (81), e50839(2013).
- Lento, C., et al. Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464(2017).
- Schowen, K. B., Schowen, R. L. Solvent isotope effects on enzyme systems. Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).
- Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry. Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).
- Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071(2011).
- Burkitt, W., O'Connor, G. Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).
- Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
