Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

MeCP2 Protein Varyantları için Elektrokemilüminesans Bazlı Bir Test

28K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61054

⸱

22 Mayıs 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Genetics, Center for Pathobiochemistry and Genetics, Medical University of Vienna (MUV), 2Murdoch Children's Research Institute and Department of Paediatrics, University of Melbourne, Discipline of Child & Adolescent Health, Sydney Medical School, 3Department of Medical Chemistry and Pathobiochemistry, Medical University of Vienna

Bu makalede

Özet

Elektrokemilüminesans immünoassay (ECLIA), geniş bir çalışma aralığında düşük intra ve inter-assay hatası ile yüksek nicel, doğru ve tekrarlanabilir ölçümler üreten endojen ve eksojen olarak uygulanan MeCP2 protein varyantlarının kantitatif tespiti için yeni bir yaklaşımdır. Burada, 96-iyi formatta MeCP2-ECLIA için protokol açıklanmıştır.

Özet

ECLIA, endojen ve rekombinant protein miktarlarını 96-iyi formatta ölçebilen çok yönlü bir yöntemdir. ECLIA verimliliğini göstermek için bu analiz, fare beyin dokusundaki MeCP2'nin içsel düzeylerini ve insan dermal fibroblastlarında TAT-MeCP2 alımını analiz etmek için kullanılmıştır. MeCP2-ECLIA, düşük intra ve inter-assay hatası ile son derece doğru ve tekrarlanabilir ölçümler üretir. Özetle, yüksek iş itme ekranlarında kullanılabilen MeCP2 protein varyantlarının değerlendirilmesi için nicel bir yöntem geliştirdik.

Giriş

Elektrokemilüminesans immünoassay (ECLIA), elektrokimyasal olarak uyarıldığında lüminesans yayan etiketleri kullanan bir işleme dayanmaktadır. Bu temel sanayi ve akademik araştırma, gıda endüstrisi nin yanı sıra klinik tanı1biyolojik analitlerin kantitatif tespiti için geniş bir uygulama tekniğidir. Genellikle karbon mürekkep elektrotlu tek kullanımlık 96 kuyuluk bir plaka kullanılır. Bu elektrotlar immünoassay için katı faz taşıyıcı olarak hareket. İkincil bir antikor elektromilüminesans etikete konjuge edilir ve sisteme elektrik uygulandığında kimyasal etiketin ışık salınımı tetiklenir. Ultra düşük gürültü şarj lı bir cihaz (CCD) ışık yoğunluğunu kaydeder ve bu durum, yakalama antikoruna bağlı antijenle doğru orantılıdır ve bu da numunenin hedeflenen analitinin sayısallaştırılmasıile sonuçlanır2. Enzime bağlı immünosorbent çıktısı (ELISA) ile karşılaştırıldığında, ECLIA daha yüksek duyarlılık ve tekrarlanabilirlik yanı sıra daha iyi otomasyon vetutarlılık3 sunduğu için avantajlı olarak kabul edilir.

Burada insan ve mürin kökenli örneklerde metil-CpG bağlayıcı protein 2 (MeCP2) düzeyleri nin yanı sıra yeni geliştirilen ECLIA sistemini kullanarak rekombinant proteinin farklı varyantlarını analiz ettik. MecP2, metillenmiş DNA dizileri ile etkileşime girdiği bilinen X'e bağlı bir nükleik asit bağlayıcı proteindir. Bu protein gen ekspresyonunun düzenlenmesinde yer almıştır4,5. Bu proteini kodlayan gendeki fonksiyon kaybı mutasyonları, ciddi bir nörogelişimsel bozukluk olan Rett sendromuna (RTT) neden olan başlıca suçlulardır6. Başka bir MeCP2 ile ilgili bozukluk, MECP2 çoğaltma sendromu, aynı zamanda RTT ile örtüşebilir nörolojik belirtilere yol açar7. Özellikle, erkekler çoğunlukla MECP2 çoğaltma sendromu6,,7etkilenir ken özellikle, kadınlar çoğunlukla RTT etkilenir.

Bu bozukluklar merkezi sinir sisteminde (CNS) sırasıyla yetersiz veya fazla MeCP2 düzeyleri ile ilişkilidir. Bu nedenle, CNS artan MeCP2 düzeylerini içeren RTT için tedavi seçenekleri MeCP27aşırı ile ilişkili zararlı etkileri önlemek gerekir. Bu nedenle, ECLIA sistemi tarafından sağlanan MeCP2 protein düzeylerinin son derece hassas ve doğru bir niceliği, RTT'nin ilerlemesi ve MECP2 tekrar sendromu araştırması için çok önemlidir. İnsan hücre hatları ve fare doku örneklerinden endojen ve eksojen MeCP2 düzeylerinin kesin ölçümleri ve insan MeCP2 izoform B 'den (izoform e1 olarak da bilinir) oluşan rekombinant protein ve kan-beyin bariyerini aşma potansiyeline sahip minimal N-terminal HIV-TAT transdüksiyon etki alanı (TAT-MeCP2) bu çalışmada8,sunulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Araştırma amaçlı cilt biyopsisi alımı için onay Westmead, Avustralya Çocuk Hastanesi İnsan Araştırma Etik Komitesi'nden alındı. Hayvan deneyleri için onay, yerel hayvan refahı yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilen Avusturya Federal Bilim, Araştırma ve Ekonomi Bakanlığı'ndan alındı (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).

NOT: ECLIA sisteminin prensibi Şekil 1'degösterilmiştir.

1. Antikor seçimi

  1. Çeşitli MeCP2 antikorları bir dizi için sinyal-gürültü oranı değerlendirmek ve birincil fare monoklonal MeCP2 antikor kombinasyonu içinde en iyi sinyal gücü ve en yüksek özgüllük belirlemek (klon Mec-168) ve tavşan poliklonal MeCP2 algılama antikor (özel yapılmış). İkincil antikor için, aynı zamanda deneysel olarak doğrulanmış bir sisteme özgü antikor(Malzeme Tablosu)kullanın.
    NOT: Tablo 1, MeCP2-ECLIA gelişimi sırasında doğrulanmış tüm antikorların ve test edilmiş seyreltme aralıklarına genel bir bakış sunar.
IşlevAdıKlonSeyreltme
BirincilFare, MeCP2 karşıtıMec-1681:500−1:10.000
BirincilFare, MeCP2 karşıtı4B61:250−1:4,000
BirincilFare, MeCP2 karşıtıErkekler-81:500−1:4,000
BirincilFare, MeCP2 karşıtı1B111:500−1:4,000
BirincilTavşan, anti-MeCP2D4F31:500−1:4,000
IkincilTavşan, anti-MeCP2Poliklonal1:2.000−1:20.000
IkincilTavşan, anti-MeCP2Poliklonal1:2.000−1:20.000
AlgılamaSULFO-TAG anti-tavşan etiketliPoliklonal1:500−1:1.000

Tablo 1: Antikorlar ve kullanılan çalışma seyreltmeleri listesi.

  1. Alternatif olarak, geleneksel ELISA ile iyi çalışan mecp2 antikorlarının her bir çiftini kullanın.

2. TAT-MeCP2 füzyon proteini ile HDF tedavisi

NOT: TAT-MeCP2, Escherichia coli ile rekombinant olarak ifade edilmiş ve daha önce8'de açıklandığı gibi standart kromatografik teknikler kullanılarak saflaştırılmış ve -80 °C'de depolanmıştır.

  1. Plaka 1 x 106 insan dermal fibroblast (HDF) hücreleri 100 mm tabaklarda ve hücreleri bir gecede 37 °C'de %5 CO2 ile %90 biraraya gelene kadar büyütür.
  2. Bir şişe TAT-MeCP2 füzyon proteinini çıkar. Buz üzerinde çözülün ve yavaşça karıştırın.
  3. TAT-MeCP2'yi 50 mL HDF kültür medyasında 500 nM'lik son konsantrasyona seyreltin.
  4. Ortamı 100 mm'lik tabaklardan çıkarın ve hücreleri 37 °C'de 500 nM TAT-MeCP2 ile 24 saate kadar çeşitli kuluçka süreleri için kuluçkaya yatırın.
  5. TAT-MeCP2 çözeltisini hücrelerden çıkarın. Hücreleri önceden ısıtılmış Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile 2 kat yıkayın.
  6. Hücreleri 2 mL %0,05 tripsin-EDTA çözeltisi ile 37 °C10'da5 dk tedavi edin.
  7. Tripsini inaktive etmek ve hücreleri 15 mL tüplerde toplamak için 6 mL HDF kültür ortamı ekleyin.
  8. Hücreyi 500 x g'da oda sıcaklığında 5 dk santrifüj ile peletleyin.
  9. Supernatant çıkarın ve buz gibi DPBS ile hücreleri 2x yıkayın. Peleti buz üzerinde saklayın ve numune hazırlamaya devam edin.

3. Örnek hazırlama

  1. HDF lysates
    1. Suzuki ve ark.11'egöre sitoplazmik ve nükleer hücre altı bölmelerine subsellüler fraksiyonu için REAP yöntemini kullanarak MeCP2'nin en yüksek protein düzeylerini belirleyin. Kesirlendirmeyi deney başına en fazla altı örnekle sınırlandırın.
  2. Fare beyin lysates
    1. Her hipotonik lisis reaktifi ve ekstraksiyon tamponunun 100 mL'sini hazırlayın.
      1. Hipotonik lisis reaktifi için 10 mM HEPES, 1,5 mM magnezyum klorür ve 10 mM potasyum klorür karıştırın.
      2. Ekstraksiyon tamponu için, iyi karıştırın 20 mM HEPES, 1.5 mM magnezyum klorür, 0.42 M sodyum klorür, 0.2 mM EDTA, ve 25% (v / v) gliserol.
      3. Her iki arabellekteki pH'ı 7,9 olarak ayarlayın.
      4. Her iki tampona da 1 mM dithiothreitol (DTT) ve 1x proteaz inhibitör kokteyli ekleyin. Kullanmadan önce buz üzerinde soğutun.
    2. Toplam fare beyninin 100 mg'ını askıya alın (zorlanma: C57BL/6J, yabani tip erkek ve dişi ve B6.129P2(C)-Mecp2tm1.1Bird/J, hemizygous erkek ve heterozigot kadın; yaş: 4−8 haftalık) 1 mL buz gibi hipotonik lisis reaktifinde.
    3. Homogenizer A (gevşek, büyük açıklık için) ve B (sıkı, küçük açıklık için), sırasıyla 15 vuruş ile önceden soğutulmuş dounce tüm cam doku homogenizer ile beyni homojenize.
    4. Homojenize edilmiş hücreleri temiz bir tüpe ve 4 °C'de 20 dk için 10.000 x g'de santrifüje aktarın. Supernatant atın (veya daha fazla kullanım için sitoplazmatik fraksiyonu olarak tutun).
    5. 100 mg başlangıç malzemesi başına 140 μL çıkarma tamponu içinde peleti yeniden askıya alın. Tüpü önceden soğutulmuş bir termoblok içine yerleştirin ve 4 °C'de 30 dk hafifçe karıştırın.
    6. Tüpü 16.000 g'da 10 dakika 4 °C'de santrifüj edin. Supernatant'ı (yani nükleer fraksiyonu) yeni bir önceden soğutulmuş tüpe aktarın ve kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
      NOT: Fare beyni ve HDF'lerden elde edilen lysatların protein konsantrasyonu BCA protein teşbiile değerlendirilebilir.

4. MeCP2-ECLIA protokolü

  1. Yıkama çözeltisinin hazırlanması, tampon ve artüytümün engellenmesi (gün 1)
    1. PBS çözeltisinde %0,05 Ara 20 hazırlamak için 500 ila 1 L PBS arasında 500 l'lik PBS ekleyin, şiddetle karıştırın ve "yıkama solüsyonu" olarak etiketlendirin.
      NOT: Sadece taze hazırlanmış yıkama tamponu kullanıldığından emin olun.
    2. Fosfat tamponlu salinde (PBS) %3 bloker A(Malzeme Tablosu)blokaj çözeltisi hazırlayın. Hafifçe karıştırarak karıştırın, sterilize filtre ve en fazla iki hafta boyunca kullanıma kadar buzdolabında saklayın.
    3. 10 mL PBS'ye 5 mL engelleme çözeltisi ekleyerek, atojen dilüent çözeltisi (PBS'de %1 bloker A) hazırlayın.
  2. Yüksek bağlama plakalarının kaplaması
    1. 96-iyi çok dizili tek nokta yüksek bağlama plaka sı.
      NOT: Yüksek bağlama plakaları daha büyük bir bağlama kapasitesine ve dolayısıyla hidrofobik yüzeylere sahip standart plakalardan daha büyük bir dinamik aralıktadır.
    2. Monoklonal fare anti-MeCP2 antikorunu buz üzerinde eritin ve antikordan 0.67 μL'lik pbs (PBS'de 1:6.000 antikor seyreltme) ile karıştırın. Girdap iyi karıştırmak ve "kaplama çözeltisi" olarak tüp etiket antikor çözeltisi.
    3. Çok kanallı bir pipettor kullanarak her kuyunun alt köşesinde 25 μL kaplama çözeltisi dikkatlice dağıtın; buna çözelti kaplama yöntemi denir. Kaplama çözeltisinin her kuyunun altını kapladığından emin olmak için her iki taraftaki 96 kuyulu tablaya hafifçe dokunun.
    4. Plakayı yapışkan folyo ile kapatın ve tabağı buzdolabında gece leme (12−16 saat) 4 °C'de inküleyin.
  3. Engelleme (gün 2)
    1. Buzdolabından tabağı çıkarın ve folyo çıkarın.
    2. Antikor kaplama çözeltisini atık sepetine basarak çıkarın ve kuyulardan tüm kaplama çözümlerini çıkarmak için plakayı kağıt havluya dokunun.
    3. Kuyu başına 125 μL engelleme çözeltisi ekleyin. Plakayı tekrar kapatın ve yörüngesel bir mikroplaka çalkalayıcısının üzerine yerleştirin.
    4. 800 rpm sürekli sallayarak oda sıcaklığında 90 dakika boyunca plaka kuluçka.
  4. Standartların ve numunelerin hazırlıkları
    1. Kuluçka süresi boyunca MeCP2 ve/veya TAT-MeCP2 protein standartlarını ve çeşitli numuneleri hazırlayın.
      NOT: Standart seyreltme için kullanılan lysis tamponu, analiz edilen numunelerde kullanılanla aynı olmalıdır.
    2. Bir şişe MePC2 ve/veya TAT-MeCP2 protein stok çözeltisi (250 μg/mL), fare beyin lisatları ve -80 °C'den HDF lysates alın. Onları buzda erit.
    3. Standart stok çözeltisini (MeCP2 ve/veya TAT-MeCP2) temiz tüplerde Tablo 2'yegöre seyreltin.
    4. Örnekleri lysis tamponunda şu şekilde seyreltin: 25 μL lysis tamponu başına 1−20 μg fare beyni lysate ve 25 μL lysis tamponbaşına 0,25−1 g HDF lysate. Her numunenin yeterli hacimli hazırlayın triplicate analizi yürütmek için.
StandartKonsantrasyonSeyreltme
Standart 11.800 ng/mL1.08 μL Standart stok çözeltisi + 148,92 μL Lysis tampon
Standart 2600 ng/mL50 μL Standart 1 + 100 μL Lysis tampon
Standart 3200 ng/mL50 μL Standart 2 + 100 μL Lysis tampon
Standart 466,67 ng/mL50 μL Standart 3 + 100 μL Lysis tampon
Standart 522.22 ng/mL50 μL Standart 4 + 100 μL Lysis tampon
Standart 67.41 ng/mL50 μL Standart 5 + 100 μL Lysis tampon
Standart 72.47 ng/mL50 μL Standart 6 + 100 μL Lysis tampon
Standart 80.82 ng/mL50 μL Standart 7 + 100 μL Lysis tampon
Standart 90.27 ng/mL50 μL Standart 8 + 100 μL Lysis tampon
Standart 100 ng/mL150 μL Lysis tamponu

Tablo 2: Standart seri 0 ile 1.800 ng/mL arasındadır.

  1. Numunelerin ve standart çözümlerin eklenmesi
    1. Atık sepetine basarak engelleme çözeltisini çıkarın ve kuyulardan tüm engelleme çözümlerini çıkarmak için plakayı kağıt havluya dokunun.
    2. Yıkama çözeltisini ekleyerek ve hemen çıkararak plakayı 3x 150 μL yıkama çözeltisi ile yıkayın.
    3. Tek bir kanallı pipet kullanarak kuyunun alt köşesine 25 ul standart ve numune ekleyin.
    4. Plakayı kapatın ve 800 rpm'de sürekli sallayarak oda sıcaklığında 4 saat boyunca plakayı kuluçkaya yatırın.
  2. Etiketsiz algılama antikor
    1. Çok klonal tavşan anti-MeCP2 antikorbuz üzerinde eritin. Antikor 1:6,000'i tazyikli seyreltme çözeltisi.
    2. Atık sepetine basarak standartları ve numuneleri çıkarın ve plakayı kağıt havluya dokunun.
    3. Yıkama çözeltisini ekleyerek ve hemen çıkararak plakayı 3x 150 μL yıkama çözeltisi ile yıkayın.
    4. Çok kanallı pipettor ile her kuyuya 25 μL etiketsiz algılama antikorekleyin. Plakayı kapatın ve oda sıcaklığında 800 rpm'de sürekli sallayarak 1 saat kuluçkaya yatırın.
  3. Spesifik konjuge antikor
    1. Buzdolabından belirli ikincil antikor(Malzeme Tablosu)alın ve buz üzerine yerleştirin. Antikor 1:666.67'yi tazyik seyreltme çözeltisinde seyreltin ve hafifçe karıştırın.
    2. Atık sepetine basarak ücretsiz etiketsiz ikincil antikor çıkarın ve bir kağıt havlu üzerinde plaka dokunun.
    3. Yıkama çözeltisini ekleyerek ve hemen çıkararak plakayı 3x 150 μL yıkama çözeltisi ile yıkayın.
    4. Çok kanallı pipettor ile her kuyuya 25°L spesifik konjuge antikor(Malzeme Tablosu)ekleyin. Oda sıcaklığında 800 rpm sürekli sallayarak 1 saat için plaka ve kuluçka mühür.
  4. Plakayı okuma
    1. Ücretsiz konjuge antikor(Tablo Malzemeler)atık sepeti içine flicking ve bir kağıt havlu üzerinde plaka dokunun çıkarın.
    2. Plakayı 150 μL yıkama çözeltisi ile 3x yıkayın.
    3. 150 μL 1x Tris tabanlı Altın okuma tamponu ekleyin(Tablo Malzemeler)plaka ışık üretimi için bir co-reatoant olarak tripropylamin içeren sürfaktan ile. Ters pipetleme teknikleri kullanarak herhangi bir hava kabarcıkları kaçının.
    4. Plakayı mikro plaka algılama platformuna(Malzeme Tablosu)yerleştirin ve hemen ölçüme başlayın. 96-iyi plaka edinimi için ayarları kullanın.
    5. Elektromilüminesans sinyallerini, yerleşik bir CCD kamera ile elektrokemilüminesans algılama sisteminde(Malzeme Tablosu)yakalayın ve göreceli ışık birimlerine (RLU) karşılık gelen ve ışığın yoğunluğuyla doğru orantılı olan sinyal sayılarını kaydedin.
      NOT: Elektrokimyasal stimülasyon üzerine karbon elektrota bağlanan rutenyum etiketi 620 nm'de parlak ışık yayır. Alet eşliğinde yazılım(Malzeme Tablosu)ile verileri analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

ECLIA sisteminin prensibi Şekil 1'deaçıklanmıştır. İki MeCP2 varyantı için standart eğriler Şekil 2'degösterilmiştir. Çok çeşitli konsantrasyonlarda (1−1.800 ng/mL) doğru niceleme mümkün oldu. Şekil 3'tefare beyni ve HDF'lerden elde edilen LYSAt'ların MeCP2 düzeyleri analiz edildi. Beyinde mecp2 ekspresyonu heterozigot, yabani tip ve nakavt farelerden karşılaştırıldı, Şekil 3B'de

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Endojen MeCP2, rekombinant MeCP2 ve TAT-MeCP2 düzeylerini ölçmek için 96 kuyulu bir eclia plaka geliştirilmiştir. Bu MeCP2 protein fonksiyonukaybı RTT sendromu yol açtığı gösterilmiştir6, hangi tedavi şu anda semptom yönetimi ve fizik tedavi ile sınırlıdır. Bir umut verici tedavi cadde sözde protein replasman tedavisi, MeCP2 düzeyleri kendi ihtiyaç duydukları konsantrasyon12kadar titrated olabilir12 ,13,14

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Eclia aletine verdiği destekten dolayı Dr. Brigitte Sturm'a çok müteşekkiriz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,4-Dithiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD9779Hipotonik lizis reaktifi, Ekstraksiyon Tamponu
Bio-Rad Protein Testi Boya Reaktif KonsantresiBio-Rad Laboratories Inc.500-0006Numune hazırlama
Algılama AB SULFO-TAG etiketli anti-tavşanMeso Scale DiagnosticsR32AB-1Antikor
Keşif tezgahı 4.0Meso Scale DiscoveryYazılımı
DMEM (1X)gibco by Life Technologies41966-029Numune hazırlama
Dulbecco' s PBS (steril)Sigma-AldrichD8537-500MLNumune hazırlama, Yıkama solüsyonu, Kaplama solüsyonu
EDTASigma-AldrichEDSEkstraksiyon Tamponu
Fetal Sığır SerumuSigma-AldrichF9665Numune hazırlama
GliserolSigma-AldrichG2025Ekstraksiyon Tamponu
Altın Okuma Tamponu T (1x) yüzey aktif maddeMeso Scale ile TeşhisR92TGMeCP2 ECLIA protokolü
HEPESSigma-AldrichH3375Hipotonik lizis reaktifi, Ekstraksiyon Tamponu
KIMBLE Dounce doku öğütücü setiSigma-AldrichD8938Numune hazırlama
Laboratuvar Çalkalayıcı, sallanma hareketi (düşük hız)GFL3014MeCP2 ECLIA protokolü
Magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl*6H20)Sigma-AldrichM2670Hipotonik lizis reaktifi, Ekstraksiyon Tamponu
MeCP2 (İnsan) Rekombinant Protein (P01)Abnova CorporationH00004204-P01Hücre tedavisi
Microseal B contasıBio-Rad Laboratories Inc.Farede
üretilen Monoklonal Anti-MeCP2, klon Mec-168, saflaştırılmış immünoglobulinSigma-AldrichM6818-100UL'de plaka sızdırmazlığı için MSB1001; RRID:AB_262075Antikor, Kaplama çözeltisi
MSD Engelleyici AMeso Terazi TeşhisiR93BA-4Engelleyici
MSD SECTOR Imager 2400Meso Terazi TeşhisiI30AA-0MeCP2 ECLIA protokolü
Çok Dizili 96 Kuyulu Plaka MesoTerazi TeşhisiLife Technologies tarafından L15XB-3/L11BX-3MeCP2 ECLIA protokolü
Penisilin-Streptomisingibco15140122Numune hazırlama
Poliklonal Anti-MeCP2, tavşanEurogentec S.A.özel tasarlanmışAntikor
Potasyum klorür (KCl)Merck KGaA1049361000Hipotonik lizis reaktifi
Birincil AB Faresi, anti-MeCP2 (1B11)Sigma-AldrichSAB1404063; RRID: AB_10737296Antikoru
Birincil AB Faresi, anti-MeCP2 (4B6)Sigma-AldrichWH0004204M1; RRID: AB_1842411Antikor
Birincil AB Faresi, anti-MeCP2 (Mec-168)Sigma-AldrichM6818; RRID: AB_262075Antikor
Birincil AB Faresi, anti-MeCP2 (Erkekler-8)Sigma-AldrichM7443; RRID: AB_477235Antikor
Birincil AB Tavşanı, anti-MeCP2 (D4F3)Hücre Sinyal Teknolojisi3456S; RRID: AB_2143849Antikor
Proteaz İnhibitörü Kokteyli (100X)Sigma-Aldrich8340Hipotonik lizis reaktifi, Ekstraksiyon Tamponu
İkincil AB, Tavşan, anti-MeCP2Eurogentec SAözelAntikor
İkincil AB, Tavşan, anti-MeCP2Merck07-013Antikor
Sodyum klorür (NaCl)Sigma-AldrichS3014Ekstraksiyon Tamponu
SULFO-TAG Etiketli Anti-Tavşan Antikoru (keçi)Antikor
TAT-MeCP2 füzyon proteinişirket içi üretim
Tripsin EDTA %0.25 (1X)gibco by Life Technologies25200-056Hücre tedavisi
Tween 20Sigma-AldrichP9416Yıkama solüsyonu
'da üretilmiştir. W0015528S Meso Ölçeği Teşhisi Hücre tedavisi

Kaynaklar

  1. Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).
  2. Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
  3. Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
  4. Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17(2017).
  5. Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
  6. Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
  7. Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
  8. Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929(2019).
  9. Laccone, F. A. Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , Canada. CA2647125C (2007).
  10. Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
  11. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294(2010).
  12. Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
  13. Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
  14. Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
  15. Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
  16. Van Esch, H. MECP2 Duplication Syndrome. Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).
  17. Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
  18. Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Elektrokimil minesans DeneyiMeCP2 Protein Kantifikasyonu96 Kuyucuklu FormatWestern Blot Kar la t rmasELISA Kar la t rmasTween 20 Y kama Sol syonuBlocker A Bloklama Sol syonuMonoklonal Anti MeCP2 AntikoruOrbital Mikroplaka alkalay cTris Base Gold Okuma Tamponu
MeCP2 Protein Varyantları için Elektrokemilüminesans Bazlı Bir Test
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.