Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Büyük Spermatositlerin 3D Konfokal Analizi için Tüm Kazdağları Drosophila Testlerinin İmmünostaining

4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61061

⸱

27 Ağustos 2020

 ,  , 
1CNRS, Institut Jacques Monod, Université de Paris, F 75006, Paris, France

Bu makalede

Özet

Burada, konfokal mikroskopi için uygun ve aynı zamanda tekrarlanabilir ve güvenilir etiketlemeye izin vermek için Drosophila testislerinin tüm montaj hazırlığı ve immünostainingi için geliştirilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokolü, büyük S4-S5 spermatositleri üzerindeki kolokalizasyon deneylerinin 3D gösterimi ve niceliği ile göstermektedir.

Özet

Drosophila testisleri kök hücre biyolojisi, nükleer mimari, meiosis ve sperm gelişimi dahil olmak üzere biyolojik süreçleri incelemek için güçlü bir model sistemidir. Bununla birlikte, tüm Drosophila testislerinin immünolabelingi genellikle antikor penetrasyonu nedeniyle lekelemenin önemli ölçüde homojen olmayanlığı ile ilişkilidir. Ezilmiş preparatlar, analizlerin 3D kalitesini azalttığı için sorunun sadece kısmen üstesinden gelmektedir. Burada, sıvı ortamda immünolabeling ile birlikte fiksasyon sırasında NP40 ve heptane kullanan tam montajlı bir protokol açıklıyoruz. Konfokal mikroskopiye uygun hacmi tekrarlanabilir ve güvenilir etiketleme ile birlikte korur. Konfokal bölümlerden spermatosit çekirdeğinin 3D rekonsesinin farklı örneklerini gösteriyoruz. İntra-ve inter-testes tekrarlanabilirliği, farklı genotiplerden tek hücreler arasındaki floresanların 3D nicelleştirilmesine ve karşılaştırılmasını sağlar. Bu protokolü ve testislerin en büyük hücreleri olan S4-S5 spermatositleri üzerindeki uygulamalarını göstermek için intranükleer MINT yapısının (Mad1 içeren Intra Nükleer Bölge) farklı bileşenlerinin yanı sıra nükleer gözenek kompleksi ile ilişkili iki bileşen kullandık.

Giriş

Drosophila testisleri nükleer mimarinin incelenmesi için değerli bir modeldir. Mitotik spermatogonyal hücrelerde, nükleer hacim büyük ölçüde kromatin tarafından işgal edilir. Bu hücreler dört tur bölünmeye uğrar ve 16 birincil spermatosit kisti üretir. Sonraki birkaç gün boyunca, spermatositler 6 gelişim aşamasından (S1-S6) geçer, hacim olarak büyük ölçüde artar, yaklaşık olarak 20 kat1,2. Nükleer morfolojilerini de değiştiriyorlar. Lamin Dm0 tarafından ortaya çıkan çekirdeğin ana hatları düzensiz hale gelir ve derin invaginasyonları gösterir1,3. Buna kromatin organizasyonu 1 , 4 ,5,6,7 'de kapsamlı gen ekspresyasyonu değişiklikleri ve modifikasyonları eşlikeder. Ara evre kromozomları, S4-S5 evresinde iyi tanımlanmıştır ve 2 büyük çift değerli otomoz ve çekirdekle sabitlenmiş X-Y çiftine karşılık gelen üç ayrı kütle oluşturur.

Mad1 başlangıçta mitotik kontrol noktasının önemli bir bileşeni olarak izole edildi(8'degözden geçirildi). Interfazda, öncelikle nükleer zarfta değil, aynı zamanda nükleoplazma9, 10,11'dede bulunur. Drosophila testislerinde, Mad1'in nükleoplazmada belirgin olduğunu, iki büyük otozomal kromatin kütlesi ile yakından ilişkili olduğunu ve XY kromatin ile daha az ölçüde ilişkili olduğunu bildirdik. Kromatinle ilişkili bu yapıyı MINT (Mad1 içeren IntraNükleer Bölge)12olarak tanımladık. Diğer dört protein spermatositlerdeki MINT'lerle ilişkiliydi: nükleoporin Mtor / Tpr, SUMO peptidaz Ulp1, mitotik kontrol noktası proteini Mad2 ve Polikomla benzeri bir kompleksin alt bireyi Raf212.

MINT'lerin tanımını tamamlamak için antikor kullanmamız gerekiyordu ve testislerde genellikle immünostaining ile karşılaşılan teknik sorunlarla karşı karşıya kaldık: testislerin derinliğinde, özellikle de büyük spermatositlerde önemli bir homojenlik ile sonuçlanan zayıf bir geçirgenlik. Squashed preparatları antikor erişimini artırdı, ancak sıkıştırılmış görüntülere yol açtı, 3D analizleri kısıtladı ve kolokalizasyon da dahil olmak üzerenicel floresan ölçümünü önledi. Antikor penetrasyonu sorunu da % 0.3 Na deoksikollat13gibi permeabilizasyon edici ajanlar tarafından ele alınabiliyordu, ancak bu prosedür elimizde tekrarlanabilir sonuçlar vermedi. Birçok ortak etiketleme deneyi yaptığımız için, permeabilizasyon protokolünü geliştirmeye baktık. % 1 NP40 artı heptan kombinasyonu, özellikle büyük spermatositlerin incelenmesinde daha fazla tekrarlanabilirlik ile sonuçlandı.

Bu protokol, süspansiyondaki testislerin sabitlenmesi ve immünostainingini gerçekleştirir, numune kalitesini artırır, tekrarlanabilirliği artırır ve konfokal mikroskopi için uygun hale getirir. Protokolü, bazı nükleer zarf proteinlerinin büyük spermatositlerin nükleoplazmik yapılarıyla olan mekansal ilişkilerini daha iyi tanımlamak için kullandık. Bu yöntem, spermatosit gelişimine eşlik eden değişikliklerin, örneğin kromatin, nükleoplazma ve nükleer gözenekler de dahil olmak üzere çekirdeğin dinamik yapısal değişikliklerinin daha iyi araştırılmasına izin verecektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Drosophila testis koleksiyonu

NOT: Genç erkekler (eklozyon sonrası 0-15 saat) diploid mikrop hücrelerini (spermatogonia ve spermatositler) incelemek için gereklidir.

  1. Spermatidler geliştirmeden kaynaklanan paraziti en aza indirmek için mümkün olduğunca genç sinekleri seçin.
  2. Karbondioksite kısa bir süre maruz kalarak sinekleri uyuşturun ve bir sineklik pedine aktarın14,15.
  3. Bir diseksiyon mikroskobu (10x büyütme) altında, başı çıkarmak için tokmak kullanın.
  4. Siyah bir arka plan desteği üzerine silikon kaplı cam kaydırakta 5 ila 10 kafa kesilmiş sinekleri 100 μL Ringer tamponu (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, komple protein inhibitörü, pH 6.8) aktarın.
  5. 40x büyütmede mikroskobun parçalanmasıyla, toraks ile karın arasında bir sinek tutmak için bir çift 5 numaralı toparlama kullanın ve diğer toparlamalarla birlikte karnı torakstan çekin. Testisleri ve bitişik dokuları sinek karkası15'ten hızla izole edin ve ringer tamponunun yeni bir damlasına aynı slaytta yerleştirin.
  6. Tüm testisler hazır olduğunda, testisleri kalan dokulardan (aksesuar bezi ve dış cinsel organ) temizleyin.
  7. Parçalanmış testisleri içeren damladan fazla tamponu çıkarın. Tipik olarak, 200 μL ucun üzerine monte edilmiş 10 μL uçlu bir p200 pipet kullanın. Bu, sıvı fazlalığının küçük bir diyafram açıklığından çıkarılmasını sağlar. Parçalanmış testisleri içeren damlanın üzerine% 4 paraformaldehit fiksatif bir damla yerleştirin ve ardından testisleri hızlı bir şekilde taze fiksatif çözelti içeren bir tüpe aktarın.

2. Paraformaldehit fiksasyonu

  1. Kullanımdan hemen önce 2 mL fiksatif çözelti hazırlayın: 2 mL silikonlu mikrosenj tüpte 30 μL NP40% 20 artı 1200 μL hepatik ile fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltilmiş% 4 paraformaldehitin 600 μL'si. 600 μL aliquots olarak hazırlanan ve -20 °C'de depolanan PBS'de %4 paraformaldehit kullanın.
    Dikkat: Heptan ve paraformaldehit toksiktir ve duman kaputunda ele alınmalıdır. Ev sahibi enstitünün yönetmeliklerine göre bunları atın.
  2. Testleri geniş diyafram ucuna sahip bir p200 mikropipette kullanarak PFA/NP40/heptane çözeltisine aktarın. Tüpü elle 30 sn boyunca yukarı ve aşağı sallayın. Testisleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca döner karıştırıcıya sabitleye devam edin.
  3. Döner karıştırıcıyı durdurun ve faz ayrımına izin vermek ve testislerin tüpün dibine yerleşmesini sağlamak için tüpü bir tüp rafı içine yerleştirin.
  4. Tüm heptane ve fiksatif çözeltiyi çıkarın ve testisleri 1x PBS ile üç kez hızlı bir şekilde durulayın.
  5. Temiz bir 200 μL bireysel tüpe aktarın. Kullanılan antikor miktarlarını en aza indirmek için bu küçük tüplerdeki tüm inkübasyonları gerçekleştirin.
  6. Hem P200 hem de P10 ucu takılı 200 μL mikropipette kullanarak fazla tamponu çıkarın. Testisleri aspire etmemeye dikkat edin.
  7. Tüm numuneler hazır olana kadar testisleri buz üzerinde 1x PBS'de tutun.

3. Çözeltide antikor lekesi

  1. PBS'yi atın ve hücre zarlarını permeabilize etmek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca testisleri% 0,3 PBS-T'de bırakın.
  2. Aynı tamponda önceden inkübasyon artı 1 saat boyunca% 5 normal keçi serumu (NGS).
  3. %0,3 PBS-T artı %5 NGS(Malzeme Tablosu)ile seyreltilmiş birincil antikorun 200 μL'sini ekleyin.
  4. Birincil antikoru bir gecede 4 °C'de (veya oda sıcaklığında) bir rocker üzerinde hafif ajitasyonla kuluçkaya yatırın.
  5. Oda sıcaklığında bir rocker üzerinde 15 dakika boyunca% 0.3 PBS-T'de 3 kez yıkayın. Testislerin yerçekimi ile tüpün dibine yerleşmesine izin verin.
  6. DyLight konjuge serisinden 1:500 seyreltilmiş 200 μL ikincil antikor ekleyin.
  7. İkincil antikorun oda sıcaklığında 4 saat boyunca karanlık bir odada kuluçkaya yatırın.
  8. Oda sıcaklığında bir rocker üzerinde 15 dakika boyunca% 0.3 PBS-T'de yıkayın. Daha sonra her seferinde oda sıcaklığında bir rocker üzerinde 30 dakika boyunca% 0.2 PBS-T ve% 0.1 PBS-T ile tekrarlayın. Deterjanı çıkarmak için 30 dakika boyunca 1x PBS'de son bir yıkama yapın.
  9. 15 dakika boyunca 1x PBS'de 1 μg/mL'de 180 μL DAPI çözeltisi ekleyin. Stok çözeltisi H2O'da 10 mg/mL'dir. PBS'de stok çözeltisi yapmaktan kaçının, bu da daha büyük spermatositlerde dağınık kromatin üzerindeki DAPI boyama sinyalini azaltabilir.
  10. Her biri 5 dakika boyunca 3x yıkayın.
  11. Temiz bir slayt üzerinde bir daire çizmek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın.
  12. Testisleri aspire edin ve slayda koyun. Geniş diyafram ucunun %0,1 PBS-T ile önceden durulanmasını test etmenin uyrmaya yapışmasını önler. Fazla PBS'yi kaldırın.
  13. Citifluor AF1'den bir damla (yaklaşık 100 μL) ekleyin.
  14. Hava kabarcıklarını hapsetmekten kaçınmaya dikkat ederek, dokunun üzerine hafifçe bir cam kapak yerleştirin.
  15. Kapak kapağını şeffaf oje kullanarak kaydırağa kapatın.
  16. Slaytları mikroskopta gözlemleyin.

4. Kolokalizasyon analizleri

  1. Konfokal görüntüler elde edin. Z çözünürlüğünde 0,5 veya 1 μm çözünürlüğünde zeiss LSM 710 konfokal mikroskop (63x Plan Apokromatik yağ) kullandık.
  2. Bağımsız testislerden farklı hücreler seçin.
  3. Görüntüleri işleme yazılımına (örneğin, imaris) içe aktarın.
  4. Komşu çekirdeği dışlamak için çekirdeği manuel segmentasyonla tanımlayın. Coloc yazılımını kullanın; Pearson'ın korelasyon katsayılarını (PCC' ler) 2 florofor arasındaki tüm hacimde toplar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Drosophila testislerinin yeterli lekelenmesine yönelik en büyük engel, ezilmiş preparatlar kullanılarak kısmen çözülmüş olan ancak 3D analizlerin (örneğin 3D temsili veya kolokalizasyon ölçüsü) kısıtlanması pahasına antikorların sınırlı penetrability'dir. Prosedür tek tip etiketlemeye izin veriyor ve testislerin tüm hücrelerinin hacmini koruyor. Burada yöntemin illüstrasyonunu S4-S5 spermatositlerinin 3D temsiline odakladık, çünkü en büyük hücrelerdir ve böylece ezilme deformasyonuna karşı daha hassastırlar. Nükleoporinl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, tüm mount yetişkin Drosophila testislerinin başarılı bir şekilde immünoblabeling için bir yöntem sağlar. Diğer prosedürlerde bildirildiği gibi, spermatositleri engelleme riski taşıyan spermin varlığını en aza indirmek için genç erkeklerin kullanılması gerekir (hatta eklosyondan sonra yaşı 20 saatten daha az bir süreye kısalttık). Diseksiyon hızlı olmalı ve antikor seyreltmesi sinyal-gürültü oranını optimize etmek için ayarlanmalıdır21,22,<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Antikorlar için P. Verrijzer, J. Johansen H., Okhura ve sinekler için A. Debec, Bloomington ve Viyana stok merkezlerine teşekkür ederiz. Öneriler ve teşvik edici tartışmalar için C. Jackson'a teşekkürler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Drosophila srains
ketelGFP y; ketelGFP/y+CyOA. Debec'ten Hediye (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, Fransa)
Mad1-GFPJ Cell Sci. 2011 15 Mayıs; 124(Pt 10):1664-71.
Mtor RNAi VdrcID 110218Viyana Drosophila RNAi Merkezi
Malzemeler
DAPI ThermoD1306Stok çözeltisi H2O
Dumont # 5 İnce Forseps Güzel Bilim Araçları
MBP Geniş Delikli PipetUçları Fisherbrand11917744Geniş diyafram ucu
Thermo Scientific  0.2 mL Bireysel TüpThermoAB-0620
2 ml mikro santrifüj tüpleri SigmaT3531-200EA Silikonize 2ml tüp
Citifluor AF1CitifluorAF1
Dakopen SigmaZ377821-1EA 
Normal Keçi Serumu (NGS)SigmaNS02L-1ML
Paraformaldehit% 4SigmaP6148-500G ve nbsp;paraformaldehit (% 4) PBS 1X ; alikot 600 ml 
PBS 1XThermo14190094DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok
%0,1 (%0,2 veya %0,3) PBS-T PBS 1X  %0.1 (%0.2 veya %0.3) Triton X-100
Triton X-100 içeren, moleküler biyoloji için, SigmaT8787
Antikorlar
GFP güçlendiriciChromotekgba4881/200
Fare anti-Mtor1/40 J. Johansen'den hediye, Iowa Eyalet Üniversitesi
Sıçan anti-Nup62H. Ohkura'dan 1/200 hediye (Edinburgh Üniversitesi, İngiltere
Gine domuzu anti-Ulp1C. P. Verrijzer, Erasmus Üniversitesi, Rotterdam'dan 1/200 hediye
Tavşan anti-Raf2C. P. Verrijzer, Erasmus Üniversitesi, Rotterdam'dan 1/200 hediye
DyLight konjuge serisi Thermo1/500 Eşek anti-(kobay, fare, & nbsp; tavşan veya sıçan) ikinci antikor olarak
,

Kaynaklar

  1. Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).
  2. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells. Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).
  3. Fabbretti, F., et al. Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0151231(2016).
  4. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinas-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-148 (1993).
  5. Hiller, M., et al. Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program. Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).
  6. Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation. Science. 310 (5749), 869-872 (2005).
  7. White-Cooper, H., Davidson, I. Unique aspects of transcription regulation in male germ cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).
  8. Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51(2018).
  9. Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores. Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).
  10. Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase. Journal of Cell Science. 114, Pt 5 953-963 (2001).
  11. Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
  12. Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila. Open Biology. 8 (10), (2018).
  13. Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development. Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).
  14. Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
  15. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), e2641(2011).
  16. Gigliotti, S., et al. Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene. Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).
  17. Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling. Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).
  18. Fawcett, D. W., Chemes, H. E. Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells. Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).
  19. Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).
  20. White-Cooper, H. Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).
  21. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. 2011 (10), Cold Spring Harbor Protocols. 1273-1275 (2011).
  22. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. 2012 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 102-104 (2012).
  23. White-Cooper, H. Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis. Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).
  24. Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).
  25. Theofel, I., et al. tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation. Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).
  26. Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes. Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

T m Yuva BoyamaKonfokal Mikroskopimm n etiketleme ProtokolNP40 Heptan FiksasyonuAntikor Penetrasyonu3D Rekonstr ksiyonSpermatosit ekirdekleriFloresan KantifikasyonuKolokalizasyon Analizi
Büyük Spermatositlerin 3D Konfokal Analizi için Tüm Kazdağları Drosophila Testlerinin İmmünostaining
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.