Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan Düzenleyici T Hücresi Klonlarının Üretilmesi

1.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61075

⸱

17 Mayıs 2020

 , 
1Department of Medicine, Division of Rheumatology, New York University School of Medicine, 2Immunobiology and Immunotherapy in Chronic Diseases, Institute for Advanced Biosciences, Université Grenoble Alpes, Inserm U1209/CNRS UMR 5309, 3Etablissement Français du Sang Auvergne-Rhône-Alpes

Bu makalede

Özet

Bu protokol, Treg'e özgü demetillenmiş bölgede (TSDR) ve Treg'e özgü fenotipik özelliklerde stabil demetilasyon ile ultra yüksek saflıkta canlı insan Treg'inin üretilmesi için insan düzenleyici T hücrelerinin klonlanmasını ve genişletilmesini tanımlar.

Özet

İnsan düzenleyici T hücrelerinin (Treg), mevcut Treg zenginleştirme yöntemleri göz önüne alındığında, yüksek saflıkta izole edilmesi çok zordur. Bu yöntemler, farklı fizyolojik ve patolojik durumlarda değişen ekspresyon seviyelerine sahip çeşitli aktivasyona bağlı hücresel yüzey belirteçleri aracılığıyla Treg'in tanımlanmasına dayanmaktadır. Bu nedenle "Treg" olarak izole edilen popülasyonlar, bu hücrelerin kesin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonunu, genomik ve proteomik karakterizasyonunu, farklı sağlık ve hastalık durumlarında güvenilir sayımlarını ve ayrıca terapötik amaçlar için izolasyonlarını ve genişlemelerini engelleyen önemli sayıda Treg efektör olmayan hücre (yani Teff) içerir. Özellikle ikincisi, Treg ile ilgili hücresel bölmelerde (örneğin, CD4 + CD25 + T hücreleri) bulunan efektör hücrelerin yanlışlıkla genişlemesi, Treg bazlı immünoterapiyi etkisiz ve hatta zararlı hale getirebileceğinden, büyük bir engel olmaya devam etmektedir. Bu çalışma, Treg'in popülasyona dayalı izolasyonu ve genişlemesi ile ilgili sorunları ortadan kaldıran bir yöntem sunmaktadır ve Treg aday klonlarının üretilmesinin, yalnızca dikkatlice incelenmiş, monoklonal hücrelerin müteakip seçimi, kültürü ve genişletilmesi ile birlikte, aylarca kültürde tutulabilen ultra saf bir Treg hücre ürününün üretilmesini sağlar, olası terapötik uygulamalar da dahil olmak üzere bu hücrelerin aşağı akış araştırmasını sağlamak.

Giriş

Bu protokolün amacı, ultra yüksek saflıkta, klonal insan Treg'in in vitro yayılımını sağlamaktır. Treg ile zenginleştirilmiş popülasyonların izolasyonu ve müteakip klonlama, istenen Treg fenotiplerinin seçilmesine ve bu hücrelerin biyolojisinin daha fazla incelenmesi, potansiyel terapötik yararlılıklarının araştırılması ve diğer deneysel aşağı akış uygulamaları için genişletilmesine izin verir.

Treg'in klonlanması, poliklonal izolasyon ve genişleme yaklaşımlarından önemli ölçüde daha iyi Treg saflığı sağlayacaktır. Bunun nedeni, diğerlerinin yanı sıra FOXP3 eksprese eden (FOXP3intCD45RAnegCD25int) Treg olmayan ve CD4+ CD25+ FOXP3- Teff1 dahil olmak üzere saflaştırılmış popülasyondan benzer veya farklı fenotiplere sahip T efektör hücrelerinin güvenilir, kontrollü bir şekilde dışlanmasıdır. Bu yaklaşımla elde edilen klonal hücre hatları, çok uzun süreli genişlemeyi (yani birkaç ay) ve hücrelerin in vitro kültürünü pratik olarak imkansız veya en azından son derece zorlayıcı hale getiren, hızla genişleyen Treg olmayan klonlarla aşırı büyüme sorunuyla karşı karşıya kalmaz. Klonal Treg ayrıca, insan iyi niyetli doğal Treg 1,2,3,4'ü gösteren epigenetik özelliklerin değerlendirilmesi için standart olarak kabul edilen yöntemler de dahil olmak üzere, genişleme sonrası fenotipik özelliklerinin kapsamlı bir şekilde incelenmesine izin verir (örneğin, TSDR'de kararlı demetilasyon).

Treg genişlemesi esas olarak hem araştırma hem de terapötik amaçlar için poliklonal hücre genişlemesi şeklinde gerçekleştirilmiştir 5,6,7. Teff kontaminasyonu ile ilgili sorunlar, Treg hücre bazlı immünoterapi yaklaşımlarının başarılı bir şekilde uygulanmasının önünde önemli bir engeldir. Literatürde monoklonal Treg'i genişletmek/oluşturmak için önceki girişimler azdır ve uzun vadede Treg özelliklerinin bakımını göstermede başarısız olmuştur8.

Bu yöntem, iyi niyetli insan Treg'in hücresel, moleküler ve metabolik özelliklerini inceleyen herkesin ilgisini çekecektir. Özellikle bu protokolün kullanılmasıyla üretilen ultra saf Treg ürünü, genomik yaklaşımlar kullanılarak yapılan analizlere uygundur. Genel olarak insan Treg'ini karakterize eden nispeten düşük genişleme oranları göz önüne alındığında, bu yöntem, çok sayıda hücrenin hızlı bir şekilde genişlemesini arayanlar için sınırlı bir kullanım olabilir. Bununla birlikte, bu protokolle üretilen Treg'in son derece yüksek saflığı göz önüne alındığında, daha az sayıda Treg, üretilen ürünün genel baskılayıcı potansiyelini sınırlayan efektör hücreler içeren poliklonal hücre hatlarının daha büyük genişlemelerine benzer veya hatta daha iyi etkinliğe sahip olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol, insan örneklerinin kullanımını içeren araştırmaların etik olarak yürütülmesine ilişkin tüm kurumsal yönergeleri takip eder. İnsan hücreleri ve diğer insan kan ürünleri ile çalışma, en azından BLS-2 güvenlik yönergelerine uygun olarak en azından BSL-2 sertifikalı bir ortamda gerçekleştirilmelidir.

1. CD4 + CD127loCD25hi hücreleri için insan periferik kan mononükleer hücrelerinin önceden zenginleştirilmesi

DİKKAT: Baştan sona steril teknik kullanın. Sivri uçları hemen uygun bir kesici alet kabına atın. Atmadan önce kan ve/veya kan ürünleri ile temas eden her şeyi ağartın. Biyogüvenlik kabininde çalışın.

  1. Periferik kan alımlarından veya lökoferezden insan lökositleri (yani "lökopaklar") için önceden zenginleştirilmiş insan periferik kanı veya kan ürünleri elde edin. Hücreleri hemen işleyin.
    NOT: Gece boyunca depolamadan kaçınılamıyorsa, hücreleri oda sıcaklığında (RT) saklayın ve taşıyın. Soğuğa maruz kalmaktan kaçının.
  2. Periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC'ler) daha önce tarif edildiği gibi yoğunluk gradyan ortamı üzerinde gradyan santrifüjleme ile izole edin9.
  3. Bir hemositometre veya hücre sayacı kullanarak PBMC'leri dikkatlice sayın. Mümkünse, Treg izolasyonuna devam etmek için en az 300 x 106 PBMC kullanın.
  4. PBMC'leri 50 x 106 hücre / mL konsantrasyonda izolasyon tamponunda (fosfat tamponlu salin [PBS] içinde 1.5 mM EDTA ile% 2 havuzlanmış insan AB serumu [PHS-AB]) içinde yeniden askıya alın ve üreticinin talimatlarına göre manyetik ayırmaya devam edin kullanılan ayırma kiti. Örneğin, bir CD4 + CD127lo T hücre popülasyonunun negatif izolasyonu için manyetik hücre sıralaması (Malzeme Tablosu) kullanın, ardından CD25 + hücreleri için pozitif seçim sıralaması yapın.
    NOT: Treg'in manyetik saflaştırılması için kolon tabanlı ve kolonsuz yaklaşımlar dahil olmak üzere çeşitli ürünler kullanılabilir. Alternatif olarak, CD127loCD25yüksek CD4 + T hücreleri üzerinde geçit ile floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) yapılabilir. Bununla birlikte, standart FACS ekipmanı ile tam sterilite mümkün değildir, ancak önemli bir kontaminasyon riski oluşturur. Ek olarak, akışkan sistemi tarafından sağlanan hücresel stres ve hasar göz ardı edilemez ve alet lazerleri sonuçları etkileyebilir.
  5. Elde edilen Treg ile zenginleştirilmiş popülasyonu CD4, CD3, CD127 ve CD25 için boyama yoluyla saflık açısından kontrol edin (Şekil 1). Doğru bir sonuç elde etmek için, Malzeme Tablosunda belirtilenden gibi, sıralama kitinde kullanılandan farklı bir CD25 bağlanma alanını tanıyan bir anti-insan CD25 antikoru seçin. Nowatzky ve ark.10'da tarif edilene benzer standart bir yüzey boyama protokolü kullanarak hücreleri boyayın ve sabitleyin.

2. Bir CD127loCD25hi önceden zenginleştirilmiş insan CD4 + T hücresi süspansiyonundan Treg'in klonlanması

  1. Adım 1.4'te elde edilen Treg ile zenginleştirilmiş (CD4 + CD127loCD25hi) hücreleri T hücre ortamında ([TCM]; RPMI 1640, %5 PHS-AB, %1 streptomisin/penisilin, %1 HEPES, %1 esansiyel olmayan amino asitler ve %1 glutamin) ile 300 IU/mL insan rekombinant interlökin-2 (IL-2) (Malzeme Tablosu) ~1−3 x 106 hücre/mL konsantrasyon ve sayım. Devam etmeden önce en az üç ayrı hücre sayımı elde edin ve ortalama hücre sayılarını hesaplayın, çünkü doğru sayımlar kesinlikle çok önemlidir.
  2. İki konsantrasyonda tek hücreli bir hücre süspansiyonu hazırlayın: (1) 3 hücre / mL ve (2) 6 hücre / mL. 100 μL/kuyucuklu süspansiyon 1 ile beş yuvarlak tabanlı 96 kuyulu plaka ve süspansiyon 2 ile beş plaka yükleyin. Sırasıyla 0.3 ve 0.6 hücre / kuyu dağılımı sağlamak için plakaları yüklerken hücreleri süspansiyon halinde tutmaya büyük özen gösterin.
    NOT: Hücre konsantrasyonunu 1 hücreye/kuyuya çıkarmayın, çünkü bu, gerçek klonlar değil, oligoklonal hücre hatları elde etme riskini artırır.
  3. Adım 1.2'deki gibi yoğunluk gradyanlı santrifüjleme yoluyla elde edilen taze izole edilmiş insan allojenik PBMC'lerinden besleyici hücreleri hazırlayın.
  4. ~ 10 x 106 PBMC / mL konsantrasyonda 50 mL'lik bir polipropilen tüpte IL-2 olmadan TCM'de insan allojenik PBMC'lerini yeniden süspanse ederek ışınlama için klonlama plakası başına en az 10 x 106 besleyici hücre hazırlayın. Tüpü sıkıca kapatın ve bir gama ışınlayıcıda veya X-ışını tabanlı bir ışınlama cihazında 35 Gy ile ışınlayın.
    NOT: Işınlama, Teff'in proliferasyonunu kolaylaştıran besleyicilerden büyük miktarlarda sitokin salgılanmasını tetikler, ancak Treg genişlemesini olumsuz etkileyebilir. Bunlar daha sonra yıkanarak çıkarılacaktır.
  5. Işınlamadan sonra hücreleri 450 x g ve RT'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Hücreleri, ortam/PBS'nin peletlenmiş besleyici hücre hacminin en az 2 katını kullanarak IL-10 olmadan TCM'de yeniden süspanse ederek yıkayın.
    NOT: Klonlanacak donör hücrelerin insan lökosit antijeni (HLA) ekspresyon profilinin belirlenmesi önerilir. Bu, ilgili bir donörün türetildiği popülasyonda yaygın olan bir veya birkaç HLA tipi için basit boyama yoluyla yapılabilir (yani, HLA-A2 veya HLA-A24). Besleyici hücreler olarak kullanılan PBMC, besleyicilerin ışınlamaya bağlı apoptozundan önce hedef hücrelerin genleşme kültürlerinden yeniden tanımlanmasını/izolasyonunu sağlamak için bu HLA'yı eksprese etmemelidir.
  6. Işınlanmış ve yıkanmış besleyici hücreleri TCM'de 300 IU / mL IL-2 ile 1 x 106 hücre / mL konsantrasyonda yeniden süspanse edin.
  7. 4 μg/mL konsantrasyonda (kültürde gerekli konsantrasyonun 2 katı) fitohemaglutinin-L (PHA-L) (Malzeme Tablosu) ekleyin ve hızlı bir şekilde adım 2.8'e geçin.
  8. Kaplanmış Treg ile zenginleştirilmiş hücrelere 4 μg / mL PHA-L ve 300 IU / mL IL-2 ile 100 μL TCM'de 100.000 ışınlanmış besleyici hücre ekleyin, bu da toplam 200 μL hacim ve her kuyucukta 2 μg / mL PHA-L konsantrasyonu ile sonuçlanır. 5 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Besleyici hücrelerin Treg'e eklenmeden önce PHA-L'ye maruz kalma süresini gereken mutlak minimuma sınırlayın ve kaplanana kadar süspansiyon halinde tutun.
    NOT: İlk tohumlama adımında kültürde 2 μg/mL'lik bir PHA-L konsantrasyonu sağlayın, ancak Treg klonlarının müteakip genişlemesi üzerine daha düşük bir 1 μg/mL konsantrasyon kullanın. Boyunca 300 IU / mL IL-2 kullanın.
  9. 37 °C'de inkübe edin. TCM kullanarak ortamın% 50'sini 300 IU / mL IL-2 ile değiştirin, ancak 5-7. günlerde PHA-L olmadan.

3. Treg'in genişletilmesi ve kültürde klonların bakımı

  1. 12. günden başlayarak, çoğalan hücrelerin peletlerinin varlığı için kültürleri kontrol edin.
    NOT: Besleyici hücreler tarafından oluşturulan topaklar olacaktır, ancak mikroskobik incelemede bunlar küçük, yuvarlak, ölmekte olan veya ölü hücreler olarak görünecektir, oysa çoğalan T hücreleri boyut olarak daha büyük olacak, parlak kontrast ve sağlıklı görünüme sahip olacak ve genellikle makroskopik incelemede kahverengi görünen bitişik hücre kümeleri oluşturacaktır.
  2. Her 1-2 günde bir kültürleri incelemeye devam edin. Çoğalan geçici klonları tek kuyucuklara aktararak izole edin. Diğer kuyucuklardan kasıtsız hücre transferi olsa da, herhangi bir geçici veya yerleşik klonun çapraz kontaminasyonunu önlemek için her bir geçici klonu tek bir 96 kuyulu plakaya yerleştirin.
  3. Her 2-3 günde bir% 50 ortam değişikliği ile hücreleri koruyun ve gerektiği gibi bölün. Hücreleri yakından izleyin.
    NOT: Ortam değişikliklerini ve bölünmeyi geciktirmek hücrelere zarar verebilir ve "aşırı bölünme" çoğalmalarını durdurabilir ve hücre ölümüne neden olabilir.
  4. Adım 2.3-2.9'da tarif edildiği gibi ışınlanmış allojenik besleyicilerle hücreleri yeniden uyarın, ancak daha düşük PHA-L konsantrasyonları kullanın (ör., 300 IU / mL IL-2 ile TCM'de 1 μg / mL). Hücre boyutu küçüldüğünde ve hücreler, tipik olarak 2-3 hafta sonra olan uzun ovalin aksine yuvarlak hale geldiğinde yeniden uyarın.
    NOT: Orijinal klonlama kültürünü en az 6-8 hafta koruyun. 2 hafta içinde veya kısa bir süre sonra görünür hale gelen 'erken' klonların çoğu gerçek Treg değil, hızlı çoğalan Treg/Teff olmayan hücreler olma eğilimindedir ve bazılarının kültürde gözle görülür şekilde görünmesi 1 aydan fazla sürecek olan 'geç' hücrelere göre incelemede başarısız olma olasılığı daha yüksektir.

4. Geçici Treg klonlarının incelenmesi

  1. Monoklonalite ve TSDR metilasyon durumu için ~ 1 x 106 hücreye çoğaldıktan sonra geçici klonların incelemesine başlayın.
  2. İsteğe bağlı olarak, daha fazla değerlendirme için ilgilenenleri tanımlamak için CD3, CD4, CD127 ve CD25 için boyama yoluyla hücre genişlemelerini ön eleme yapın (yani, CD3 + CD4 + CD127loCD25hi) (Şekil 2).
  3. Ticari olarak temin edilebilen boyama antikorları setlerini kullanarak Vβ boyama ile hücresel üründe tek bir Vβ zincirinin varlığının tanımlanması yoluyla monoklonalite oluşturun (Malzeme Tablosu; Şekil 3) üreticinin talimatlarına uyarak. Güvenilir bir analiz için numuneleri bir akış sitometresinde çalıştırırken en az 1 x 106 olay elde ettiğinizden emin olun, böylece küçük kirletici popülasyonlar tespit edilebilir. Bir canlılık boyası kullanın.
  4. Ticari sağlayıcılar veya kurum içi11,12 tarafından değerlendirilen FOXP3 lokusunda TSDR metilasyon durumuna sahip olun. Yeterli sonuçlar için en az 1 x 105 hücre elde edin.
  5. Adım 4.3 ve 4.4'te Treg kimliği ve klonalitesi doğrulandıktan sonra, hücreleri kriyoprezervasyon yapın veya aşağı akış uygulamaları için kullanın.
    NOT: Alternatif, ancak çok daha az güvenilir inceleme yaklaşımları, FACS boyamaları 1,10 ve in vitro veya in vivo supresyon testleri13,14 ile Treg fenotipini belirlemektir. Treg baskılama testlerine aşırı güvenmekten kaçının13. Tahliller tipik olarak, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, üçüncü taraf antijen sunan hücrelerin varlığında yanıtlayıcı T hücreleri (yani, PBMC veya saflaştırılmış T hücreleri, bazen Treg tükenmiş) veya CD3 / CD28 ile dereceli sayılarda Treg'in kokültürüne dayanır. Bu tahlillerin birçoğunun ciddi sınırlamaları vardır ve Treg'in aracılık ettiği gerçek baskılama derecesini abartabilir veya hafife alabilir. TSDR metilasyon durumu, Treg fenotipinin veya "kimliğinin" en kesin / güvenilir ölçüsü olmaya devam etmektedir3,15,16. FOXP3'ün X kromozomu üzerinde bulunduğunu ve kadınlarda bir X kromozomunun DNA metilasyonu ile inaktive edildiğini ve bunun TSDR metilasyon analizinin sonuçlarını etkilediğini unutmayın.

5. Treg'in Kriyoprezervasyonu

NOT: Treg, DMSO ve PHS-AB ile başarılı bir kriyoprezervasyondan sonra uzun süreli saklanabilir.

  1. Hücreleri kriyoprezervasyon yapmak için gereken kriyoviyal sayısını belirleyin. Bu, kriyoprezervasyon yapılacak toplam nihai hücre süspansiyonu hacmine (mL cinsinden) eşittir, çünkü flakon başına 1 mL dondurulur. Pipetleme/yüzey geriliminden kaynaklanan kayıpları hesaba katmak için bu hacme %10'luk bir güvenlik payı ekleyin.
    NOT: Hücreler, tipik olarak 0.1−100 x 106 hücre / mL arasında olmak üzere geniş bir konsantrasyon aralığında kriyoprezervasyonla saklanabilir.
  2. Kriyovialleri etiketleyin.
  3. Çözelti A (SA) oluşturun:% 50 RPMI ve% 50 PHS-AB veya insan plazmasını karıştırın. Plazma kullanılıyorsa, 4 ° C'de 20 dakika boyunca 2.000 x g'da döndürün.
    NOT: SA hacmi, adım 5.1'de belirlendiği gibi kriyoprezervasyonla saklanacak hücre süspansiyonunun toplam nihai hacminin %75'i olmalıdır.
  4. Çözelti B (SB) oluşturun:% 60 (h / v) PBS veya RPMI ve% 40 (h / h) dimetil sülfoksit (DMSO) karıştırın.
    NOT: SB hacmi, adım 5.1'de belirlendiği gibi kriyoprezervasyonla saklanacak toplam nihai hücre süspansiyonu hacminin %25'i olmalıdır.
  5. Her iki çözeltiyi de 4 °C'ye soğutun.
  6. SB'nin tamamını eşit miktarda SA ile karıştırarak dondurma ortamını hazırlayın ve buz üzerinde tutun.
  7. Treg'i adım 4.5'ten itibaren 450 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca sıkın. Ortamı aspire edin ve atın ve kalan buz gibi SA'daki hücreleri yeniden askıya alın ve buz üzerinde tutun.
  8. Soğutulmuş dondurma ortamını 1: 1 oranında, tüpü sallarken buz üzerinde büyük bir tüpte SA'da yeniden süspanse edilen hücrelere yavaşça ekleyin.
  9. 1 mL / flakonda kriyoviyallere hızlı bir şekilde alikot edin. Kriyovialleri hemen RT'de bir dolap kutusuna yerleştirin ve gecikmeden -80 °C'lik bir dondurucuya aktarın. 24 saat sonra sıvıN2'ye aktarın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması, kararlı insan düzenleyici T hücresi klonlarının ve hatlarının üretilmesine yol açacaktır.

CD4 + CD127loCD25hi hücrelerinin ön seçimi/ön zenginleştirilmesi, çoğu insan Treg'ini içeren bir başlangıç popülasyonu elde etmek için basit bir yöntemdi (Şekil 1A-C). Tüm klonlar bir Treg fenotipi göstermedi. CD25hiCD127lo ekspresyonunun ölçülmesiyle klonla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, Treg içeren başlangıç popülasyonlarından sınırlayıcı bir seyreltme ve besleyici hücre bazlı genişleme yaklaşımında elde edilen hücrelerin izolasyonu, genişlemesi ve dikkatli bir şekilde incelenmesi yoluyla ultra saf insan düzenleyici T hücrelerinin yayılmasını tanımlar.

Bu yaklaşımdaki kritik adımlar şunlardır: 1) uygun bir başlangıç popülasyonunun seçimi. Genel olarak, insan PBMC'si içindeki CD4 + T hücrelerinin CD127loCD25<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu proje, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Göz Enstitüsü tarafından K08EY025324 Numaralı Ödül (Nowatzky) ve Judith ve Stewart Colton Otoimmünite Merkezi'nden (Nowatzky) Colton Scholar Ödülü ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.22 ve mikro; m Stericup, 500 mLMillipore5500Ortam saklama ve hazırlama
100x Esansiyel olmayan amino asitlerGibco11140-050Ortam bileşeni
15 mL konik santrifüj tüpleri (50/torba, 500'lük kutu)ThermoFisher Scientific339650
1M HEPESGibco15630-080Ortam bileşeni
25 ml Tek Kuyulu Pipet HavzasıFischer Scientific13-681-508
50 mL Konik Santrifüj Tüpü (25/manşon)ThermoFisher Scientific339652
50x Penisilin Streptomisin SolnCorning Corning, 30-001-ClMedya bileşeni
CryoTube Flakon Int İplik Yuvarlak Btm Starfoot PP Vidalı Durdurucu Steril PP 1.8 mLNalge Nunc377267
DMSOCorning25-950-CQC
EasySep İnsan CD25 pozitif seçim kitiKök Hücre Teknolojileri18231Alternatifler FACS veya MACS sütun tabanlı sıralamadır
EasySep İnsan CD4+CD127low T hücresi Ön Zenginleştirme KitiKök Hücre Teknolojileri19231Alternatifler FACS veya MACS sütun tabanlı sıralamadır
EasySep İnsan CD4+CD127lowCD25+ Düzenleyici T Hücre İzolasyon Kiti (madde 12'ye alternatif)Kök Hücre Teknolojileri18063Alternatifler şunlardır: FACS veya MACS sütun tabanlı sıralama
FicollGE Healthcare17-5442-03Lökoferez ürünlerinin periferik kanından PBMC saflaştırması; yoğunluk gradyan ortamı
İnsan AB Serumu (PHS-AB)Valley Biomedical IncHP1022Medya bileşeni
CANLI/ÖLÜ UV uyarımı için Sabitlenebilir Mavi Ölü Hücre Leke KitiThermo FischerL-34962Canlılık boyası
Fitohemaglutinin-L (PHA-L)Millipore/Sigma 11249738001T hücre stimülasyonu
Rekombinant IL-2 (ör., PROLEUKINâ )PrometheusT hücre stimülasyonu ve bakımı/ Medya bileşeni
RPMI 1640Gibco21870-076Medya bileşeni
Flowsitometri için boyama antikorları (Treg fenotiplemesi)Bkz. "Yorumlar"bakın "Yorumlar"Boyama antikorları şurada listelenmiştir: Nowatzky ve ark. (2019) PubMed PMID: 30584695; PubMed Merkezi PMCID: PMC6497402. EasySep İnsan CD25 pozitif seçim kitinin kullanılması durumunda, 2A3 veya BC96 anti-CD25 antikoru ile boyayın, örneğin: Brilliant Violet 421 anti-insan CD25 Antikoru (Biolegend; 302629)
TCR V ve beta; Repertuar Seti; IOTest Beta MarkBeckman CoulterPN IM3497Monoklonalite
Doku Kültürü Plakası, 96 Kuyulu, Düşük Buharlaşma Kapaklı U-Altiçin genişlemelerin incelenmesi Corning353077
a

Kaynaklar

  1. Miyara, M., et al. Functional delineation and differentiation dynamics of human CD4+ T cells expressing the FoxP3 transcription factor. Immunity. 30 (6), 899-911 (2009).
  2. Polansky, J. K., et al. DNA methylation controls Foxp3 gene expression. European Journal of Immunology. 38 (6), 1654-1663 (2008).
  3. Toker, A., et al. Active demethylation of the Foxp3 locus leads to the generation of stable regulatory T cells within the thymus. The Journal of Immunology. 190 (7), 3180-3188 (2013).
  4. Garg, G., et al. Blimp1 Prevents Methylation of Foxp3 and Loss of Regulatory T Cell Identity at Sites of Inflammation. Cell Reports. 26 (7), 1854-1868 (2019).
  5. Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117 (3), 1061-1070 (2011).
  6. Hippen, K. L., et al. Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity. Science Translational Medicine. 3 (83), 41(2011).
  7. Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Translational Medicine. 7 (315), 189(2015).
  8. Dromey, J. A., et al. Generation and expansion of regulatory human CD4(+) T-cell clones specific for pancreatic islet autoantigens. Journal of Autoimmunity. 36 (1), 47-55 (2011).
  9. Sabado, R. L., et al. Preparation of tumor antigen-loaded mature dendritic cells for immunotherapy. Journal of Visual Experiments. (78), e50085(2013).
  10. Nowatzky, J., Stagnar, C., Manches, O. OMIP-053: Identification, Classification, and Isolation of Major FoxP3 Expressing Human CD4(+) Treg Subsets. Cytometry A. 95 (3), 264-267 (2019).
  11. Zhang, Y., et al. Genome-wide DNA methylation analysis identifies hypomethylated genes regulated by FOXP3 in human regulatory T cells. Blood. 122 (16), 2823-2836 (2013).
  12. Spreafico, R., et al. A sensitive protocol for FOXP3 epigenetic analysis in scarce human samples. European Journal of Immunology. 44 (10), 3141-3143 (2014).
  13. Collison, L. W., Vignali, D. A. In vitro Treg suppression assays. Methods in Molecular Biology. 707, 21-37 (2011).
  14. Workman, C. J., et al. In vivo Treg suppression assays. Methods in Molecular Biology. 707, 119-156 (2011).
  15. Feng, Y., et al. Control of the inheritance of regulatory T cell identity by a cis element in the Foxp3 locus. Cell. 158 (4), 749-763 (2014).
  16. Toker, A., Huehn, J. To be or not to be a Treg cell: lineage decisions controlled by epigenetic mechanisms. Science Signaling. 4 (158), 4(2011).
  17. Liu, W., et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 203 (7), 1701-1711 (2006).
  18. Fuhrman, C. A., et al. Divergent Phenotypes of Human Regulatory T Cells Expressing the Receptors TIGIT and CD226. The Journal of Immunology. 195 (1), 145-155 (2015).
  19. Gu, J., et al. Human CD39(hi) regulatory T cells present stronger stability and function under inflammatory conditions. Cellular & Molecular Immunology. 14 (6), 521-528 (2017).
  20. Genevee, C., et al. An experimentally validated panel of subfamily-specific oligonucleotide primers (V alpha 1-w29/V beta 1-w24) for the study of human T cell receptor variable V gene segment usage by polymerase chain reaction. European Journal of Immunology. 22 (5), 1261-1269 (1992).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

D zenleyici T H creleriTreg zolasyonuTreg KlonlarH cre KlonlamaMonoklonal H crelerTreg EkspansiyonuTreg KarakterizasyonuTreg SaflTreg K lt rTreg Se imi

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.