Zaman Atlamalı Floresan Mikroskopi kullanarak Bakteriyel Predator Bdellovibrio bakteriovorus Yaşam Döngüsünün Canlı Hücre Görüntüleme

Łukasz Makowski; Damian Trojanowski; Jolanta Zakrzewska-Czerwińska

doi:10.3791/61105

Method Article

Zaman Atlamalı Floresan Mikroskopi kullanarak Bakteriyel Predator Bdellovibrio bakteriovorus Yaşam Döngüsünün Canlı Hücre Görüntüleme

DOI:

10.3791/61105

⸱

May 8th, 2020

Łukasz Makowski¹ , Damian Trojanowski¹ , Jolanta Zakrzewska-Czerwińska¹

¹Department of Molecular Microbiology, Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan bir agarose ped ve hücre görüntüleme yemekleri ile birlikte zaman atlamalı floresan mikroskobu kullanarak yırtıcı bakteri Bdellovibrio bakteriovorus tam yaşam döngüsünün izlenmesi açıklayan bir protokoldür.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bdellovibrio bakteriovorus, zararlı patojenler de dahil olmak üzere diğer gram-negatif bakterileri öldüren küçük bir gram-negatif, zorunlu yırtıcı bakteridir. Bu nedenle, yaşayan bir antibiyotik olarak kabul edilir. Yaşayan bir antibiyotik olarak B. bakteriovorus uygulamak için, öncelikle karmaşık yaşam döngüsünün önemli aşamalarını anlamak için gereklidir, av içinde özellikle çoğalması. Şimdiye kadar, yırtıcı yaşam döngüsünün birbirini izleyen aşamalarını gerçek zamanlı olarak izlemek zor olmuştur. Burada sunulan B. bakteriovorustam yaşam döngüsünün gerçek zamanlı görüntüleme için kapsamlı bir protokol , özellikle ev sahibi içinde büyüme sırasında. Bu amaçla, bir agarose ped oluşan bir sistem hücre görüntüleme yemekleri ile birlikte kullanılır, hangi yırtıcı hücreler agarose ped altında serbestçe hareket edebilir ise hareketsiz av hücreleri bdelloplastlar oluşturmak edebiliyoruz. DNA polimeraz III'ün floresan etiketli β-subunit'ini üreten bir suş uygulaması, B. bakteriovorus yaşam döngüsünün üreme aşamasında kromozom replikasyonunun izlenmesini sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bdellovibrio bakteriovorus klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa ve Shigella flexneri^1,^,²^,³gibi zararlı patojenler de dahil olmak üzere diğer gram-negatif bakteriler, avlar gram-negatif bakteri küçük (0.3-0.5 μm 0.5-1.4 μm) gram-negatif bakteri olduğunu . B. bakteriovorus patojenleri öldürdüğünden, bakteriyel enfeksiyonlarla mücadele de uygulanabilecek potansiyel bir canlı antibiyotik olarak kabul edilir, özellikle de çoklu ilaca dirençli suşların neden olduğu antibiyotikler.

B. bakteriovorus iki....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mikroskobik analiz için B. bakteriovorus lysate hazırlanması

250 mL'lik bir şişede, 1 mL taze 24 h B. bacteriovorus kültürünü birleştirerek ortak kültürü kurmak (örn. HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) ve 3 mL gecelik av kültürü (örneğin, E. coli S17-1 pZMR100) 50 mL Ca-HEPES tampon (25 mM HEPES, 2 mM CaCl₂ [pH = 7.6]) gerektiğinde antibiyotik ile takviye (burada, 50 g/mLkanac).
30 °C'de 24 saat boyunca 200 rpm'de sallayarak birlikteliği kuluçkaya yatırın.
Av hücrelerinin sıvı monte faz kontrastlı mikroskopi ile tamamen lysed olup olmadığını kontrol edin. Bu noktada çok sayıda hareketli atak f....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan TLFM tabanlı sistem, B. bacteriovorus hücrelerinin zaman içinde izlenmesini sağlar(Şekil 3, Film 1) ve karmaşık yırtıcı yaşam döngüsünün her aşaması hakkında değerli bilgiler sağlar. PilZ-mCherry füzyonu tüm yırtıcı hücrenin saldırı evresinde ve büyüme evresinin erken evresinde etiketlenmesini sağlar(Şekil 3). Saldırıdan replikorfaza geçiş sadece konak bdelloplast oluşumu tarafından değil, aynı zamanda DnaN-mNeonGreen floresan.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaşayan bir antibiyotik olarak B. bakteriovorus kullanarak artan ilgi nedeniyle, yırtıcı yaşam döngüsü gözlemlemek için yeni araçlar, özellikle yırtıcı-patojen etkileşimleri, ihtiyaç vardır. Sunulan protokol, özellikle ev sahibi nin içinde büyümesi sırasında, tüm B. bakteriovorus yaşam döngüsünü gerçek zamanlı olarak izlemek için kullanılır. Ayrıca, DNA polimeraz III holoenzimfloresan etiketli beta kıskacı üreten bir suş uygulaması B. bakteriovorusüreme aşaması boyunca kromozom replikasyon prog.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Bilim Merkezi hibe Opus tarafından desteklenmiştir 2018/29/B/NZ6/00539 J.Z.C.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Santrifüj	MPW MED. INSTRUMENTS	MPW-260R	Rotor ref. 12183
SertifikalıMoleküler Biyoloji agaroz	BIO-RAD	161-3100	agaroz pedi için düşük floresan agaroz
Fiji	ImageJ	https://imagej.net/Fiji	Açık kaynaklı görüntü işleme paketi
Cam Alt Çanak 35 mm	ibidi	81218-200	kaplamasız cam
Mikroskop	GE	DeltaVision Elite Mikrotitre	Aşaması, nihai odak lazer modülü, DV Elite CoolSnap HQ2 Kamera, SSI montajı FP DV, kit obj. Oly 100x yağ 1.4 NA, prizma Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V
Minisart Filtre 0.45 & mikro; m	Sartorius	16555----------K	Selüloz Asetat, Steril, Luer Lock Outlet
Start SoftWoRx	GE		Üretici tarafından sağlanan görüntüleme yazılımı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Shatzkes, K., et al. Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs. mBio. 7 (6), (2016).
Iebba, V., et al. Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Stap....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Zaman Atlamalı Floresan Mikroskopi kullanarak Bakteriyel Predator Bdellovibrio bakteriovorus Yaşam Döngüsünün Canlı Hücre Görüntüleme

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles