Burada sunulan bir agarose ped ve hücre görüntüleme yemekleri ile birlikte zaman atlamalı floresan mikroskobu kullanarak yırtıcı bakteri Bdellovibrio bakteriovorus tam yaşam döngüsünün izlenmesi açıklayan bir protokoldür.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Zaman Atlamalı Floresan Mikroskopi kullanarak Bakteriyel Predator Bdellovibrio bakteriovorus Yaşam Döngüsünün Canlı Hücre Görüntüleme
Bu makalede
Özet
Özet
Bdellovibrio bakteriovorus, zararlı patojenler de dahil olmak üzere diğer gram-negatif bakterileri öldüren küçük bir gram-negatif, zorunlu yırtıcı bakteridir. Bu nedenle, yaşayan bir antibiyotik olarak kabul edilir. Yaşayan bir antibiyotik olarak B. bakteriovorus uygulamak için, öncelikle karmaşık yaşam döngüsünün önemli aşamalarını anlamak için gereklidir, av içinde özellikle çoğalması. Şimdiye kadar, yırtıcı yaşam döngüsünün birbirini izleyen aşamalarını gerçek zamanlı olarak izlemek zor olmuştur. Burada sunulan B. bakteriovorustam yaşam döngüsünün gerçek zamanlı görüntüleme için kapsamlı bir protokol , özellikle ev sahibi içinde büyüme sırasında. Bu amaçla, bir agarose ped oluşan bir sistem hücre görüntüleme yemekleri ile birlikte kullanılır, hangi yırtıcı hücreler agarose ped altında serbestçe hareket edebilir ise hareketsiz av hücreleri bdelloplastlar oluşturmak edebiliyoruz. DNA polimeraz III'ün floresan etiketli β-subunit'ini üreten bir suş uygulaması, B. bakteriovorus yaşam döngüsünün üreme aşamasında kromozom replikasyonunun izlenmesini sağlar.
Giriş
Bdellovibrio bakteriovorus klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa ve Shigella flexneri1,,2,3gibi zararlı patojenler de dahil olmak üzere diğer gram-negatif bakteriler, avlar gram-negatif bakteri küçük (0.3-0.5 μm 0.5-1.4 μm) gram-negatif bakteri olduğunu . B. bakteriovorus patojenleri öldürdüğünden, bakteriyel enfeksiyonlarla mücadele de uygulanabilecek potansiyel bir canlı antibiyotik olarak kabul edilir, özellikle de çoklu ilaca dirençli suşların neden olduğu antibiyotikler.
B. bakteriovorus iki aşamadan oluşan kendine özgü bir yaşam döngüsü sergiler: serbest yaşayan non-replicative saldırı fazı ve hücre içi üreme evresi(Şekil 1). Serbest yaşam evresinde, 160 m/s'ye varan hızlarda hareket eden bu son derece hareketli bakteri avını arar. Avın dış zarına bağlandıktan sonra periplazmaya4,5girer. İnperiplazmik üreme evresi sırasında, B. bacteriovorus konağın makromoleküllerini alçaltmak ve kendi büyümesi için yeniden kullanmak için hidrolitik enzimlerin bir bolluk kullanır. Periplazmayı istila ettikten kısa bir süre sonra, konak hücre ölür ve bdelloplast adı verilen küresel bir yapıya dönüşür ve içinde yırtıcı hücre kromozomlarını uzatır ve çoğaltır. Çoğaltma işlemi çoğaltma kökenli başlar (oriC)6 ve kromozom un birkaç kopya tamamen sentezlenene kadar devameder 7. İlginçtir, her kromozomun replikasyonu hücre bölünmesi tarafından takip edilmez. Bunun yerine, yırtıcı uzun, multinükleoid ve ipliksi bir hücre oluşturmak için uzatır. Besin tükenmesi üzerine, filament senkron septasyon uğrar ve döl hücreleri bdelloplast serbest bırakılır8.
B. bakteriovorus bakteriyel enfeksiyonlara karşı yaşayan bir antibiyotik olarak kullanılabilir önce, onun yaşam döngüsünün önemli aşamalarını anlamak için çok önemlidir, özellikle av içinde çoğalması ile ilgili olanlar. B. bakteriovorus'un canlı hücre görüntülemesi, karmaşık yaşam döngüsü sırasında yırtıcının ve avının çeşitli morfolojik formları nedeniyle zor olmuştur. Şimdiye kadar, B. bakteriovorus ve konak hücre arasındaki etkileşimler ağırlıklı olarak elektron mikroskobu ve snap-shot analizi 2 tarafından incelenmiştir,,9,10, her ikisi de sınırlamalar var, özellikle de yırtıcı yaşam döngüsünün ardışık aşamalarını izlemek için kullanılır. Bu yöntemler B. bakteriovorus hücrelerinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini sağlar ve saldırı veya büyüme aşamasında küçük bir yırtıcının gözlemini sağlar. Ancak, her iki yaşam döngüsü aşamalarında tek B. bakteriovorus hücrelerinin izlenmesine izin vermezler.
Burada sunulan b. bakteriovorustam yaşam döngüsünü izlemek için zaman atlamalı floresan mikroskop (TLFM) kullanmak için kapsamlı bir protokoldür. Agarose pedden oluşan bir sistem, hücre görüntüleme çanaklarıyla birlikte kullanılır, bu da yırtıcı hücrelerin agarose pedin altında serbestçe hareket edebilmesi ve hareketsiz av hücrelerinin bdelloplastlar oluşturabildiği bir yerdir(Şekil 2). Bu kurulum hem E. coli hem de B. bacteriovorus'unspesifik suşlarına göre hazırlanır, ancak protokol kullanıcının bireysel suşlarına uyacak şekilde kolayca değiştirilebilir (örn. farklı seçim işaretleri taşıyan proteinler, farklı floroforlarla kaynaşmış proteinler, vb.).
Bu durumda, saldırı aşamasında B. bakteriovorus görselleştirmek için, belirli bir gerginlik (HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) sitoplazmaik protein, PilZ (istek üzerine laboratuvarda mevcut) bir floresan etiketli sürümünü ifade inşa edilmiştir7. Bu suşu ayrıca DNA polimeraz III holoenziminin bir alt birimi olan ve floresan proteinle kaynaşmış DnaN (β-sürgülü kıskaç) üretir. Bu, bdelloplastlar içinde büyüdükçe yırtıcı hücrelerin içinde devam eden DNA replikasyonunun izlenmesini sağlar.
Görüntü edinimi için kullanılan açıklanan protokol ve yazılım, belirli bir üretici tarafından sağlanan ters bir mikroskopa atıfta bulunsa da (bkz. Malzemeler Tablosu),bu teknik, çevre odası veya diğer harici ısıtma tutucusu yla donatılmış ve hızlandırılmış görüntüleme yeteneğine sahip ters mikroskop için ayarlanabilir. Veri analizi için, kullanıcılar tek tek çıktı biçimleriyle uyumlu herhangi bir kullanılabilir yazılım seçebilir.
Şekil 1: E. coli'de ana hücre olarak B. bakteriovorus yaşam döngüsü. Saldırı evresinde, serbest yüzen bir B. bakteriovorus hücresi konakçı E. coli hücreyi arar ve ona bağlanır. İstiladan sonra yırtıcı hücre avın periplazmasında lokalize olur, konak hücrenin şeklini değiştirir ve bir bdelloplast oluşturur. Üreme evresi bdelloplast oluşumu ile başlar. Yırtıcı hücre av hücresini sindirir ve kendi yapılarını oluşturmak için basit bileşikleri yeniden kullanır. B. bakteriovorus konak periplazmı içinde uzun bir tek filament olarak büyür. Av hücresinin kaynakları tükendiğinde, B. bakteriovorus filamenti senkronize olarak septates ve singeny hücreleri oluşturur. Döl hücreleri kamçılarını geliştirdikten sonra bdelloplastı lyse olarak verirler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Mikroskobik analiz için B. bakteriovorus lysate hazırlanması
- 250 mL'lik bir şişede, 1 mL taze 24 h B. bacteriovorus kültürünü birleştirerek ortak kültürü kurmak (örn. HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) ve 3 mL gecelik av kültürü (örneğin, E. coli S17-1 pZMR100) 50 mL Ca-HEPES tampon (25 mM HEPES, 2 mM CaCl2 [pH = 7.6]) gerektiğinde antibiyotik ile takviye (burada, 50 g/mLkanac).
- 30 °C'de 24 saat boyunca 200 rpm'de sallayarak birlikteliği kuluçkaya yatırın.
- Av hücrelerinin sıvı monte faz kontrastlı mikroskopi ile tamamen lysed olup olmadığını kontrol edin. Bu noktada çok sayıda hareketli atak fazı B. bakteriovorus hücresi bulunmalı ve E. coli hücresi veya bdelloplast görünmemelidir.
- Kalan ana bilgisayar hücrelerini çıkarmak için B. bakteriovorus kültürünü 0,45 m'lik gözenek boyutu filtresinden filtreleyin. Yırtıcı hücreler (0.3-0.5 μm x 0.5-1.4 μm) serbestçe 0.45 m gözenekleri nüfuz ederken, ana bilgisayar hücreleri filtre yüzeyinde tutulur.
- Yırtıcı hücreleri toplamak için 20 dk 2469 x g ve 30°C'de 50 mL konik bir tüpte filtratı aşağı doğru çevirin. B. bakteriovorus peletini 3 mL Ca-HEPES tamponunda yeniden askıya alın (yaklaşık 0,2'nin son OD600'üne) ve 30 dakika boyunca 30 °C ve 200 rpm'de kuluçkaya yatırın.
2. B. bakteriovorus invazyonu için konak hücrelerin hazırlanması
- 10 mL YT ortasını (%0.8 Bacto tripton) aşılamak için ev sahibi suşların tek bir kolonisini kullanın(E. coli S17-1 pZMR100, eşit olmayan büyüklükteki bdelloplastların oluşumuyla sonuçlanan çeşitli hücre boyutları nedeniyle tavsiye edilir. %0.5 maya ekstresi, %0.5 NaCl [pH = 7.5]) gerekirse antibiyotiklerle desteklenmiştir (burada 50 g/mL kanamisin). Kültür hücreleri bir gecede 37 °C ve 180 rpm.
- Geceleme 2 mL E. coli kültürü (OD600 ~ 3.0) oda sıcaklığında 2 mL test tüpü ve santrifüj ve 5 dakika için 2469 x g aktarın. Ca-HEPES tamponunun 200 μL'lik kısmını yeniden askıya alın.
3. Mikroskobun kurulumu (bkz. Malzeme Tablosu)
- Kullanmadan önce en az 1 saat boyunca 100x yağ daldırma hedefi ile 30 °C'ye kadar mikroskobik bir hazneönceden ısıtın. Bu adım, deneme sırasında odağı koruma hatalarını önlemek için gereklidir.
- Hem mikroskop hem de mikroskopi otomasyonu açın. Kontrol yazılımını başlangıç olarak ve brightfield/DIC/faz kontrastı ve floresan görüntüleri elde etmek için uygun filtreleri seçin , gerektiği gibi (burada: BF görüntüleri, GFP/mCherry polikromik filtre ve mCherry ve GFP için emisyon/uyarma).
4. Hızlandırılmış floresan mikroskobu için düzenlerin montajı
- Ca-HEPES tampon 20 mL ile düşük floresan moleküler sınıf agarose 200 mg karıştırın (1% son agarose konsantrasyonu) ve bir mikrodalga içinde agarose çözünür. Toplu iş katılaşmadan sonra birkaç kez yeniden kullanılabilir, bu nedenle ısıtma adımını tekrarlayın.
- 35 mm cam dipli bir tabağa 3 mL eritilmiş agarose dökün(Malzeme Tablosu). Agarose'un katılamasını bekleyin.
- Bir laboratuvar mikro-spatula kullanarak, agarose pedin orta direğini bozmadan 35 mm'lik çanaktan agarose pedi dikkatlice çıkarın. Pedalt tarafını yukarı bakacak şekilde çevirin ve petri kabı nın kapağına yerleştirin(Şekil 2).
- 5 μL konsantre E. coli süspansiyonu döndürülen pedin üzerine koyun ve bir aşılama döngüsü kullanarak merkezi direğe yayılmış hücreleri. E. colikaplı yüzeye 5 μL konsantre B. bakteriovorus süspansiyonu (OD600~ 0.2) ekleyin. Hücreleri yaymayın.
- Agarose jeli hızlı bir şekilde 35 mm cam alt tabağa geri döndürün (üst tarafı aşağı bakacak şekilde), sonra bir kapakla kaplayın. Gerekirse, yavaşça plaka karşı agar bastırarak herhangi bir hava kabarcıkları kaldırın.
Şekil 2: Deneysel iş akışının şematik tasviri. Agarose ped 35 mm çanak kaldırılır ve alt tarafı yukarı dönük şekilde çevrilmiş. Yırtıcı hücrelerin taze süspansiyonlar ve av hücrelerinin gece kültürü "alt" tarafı kaplamak için çevrilmiş ped yerleştirilir. Agarose ped daha sonra orijinal yönünü döndürülür ve mikroskop odasında ters mikroskop aşamasıüzerine monte edilir 35 mm çanak, geri yerleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
5. Hızlandırılmış floresan mikroskopinin iletimi
- 35 mm'lik kabı Petri kabının tutucuya, deney sırasında hareket etmeyecek şekilde yerleştirin. 35 mm'lik yemeğin dibine ve hedefe bir damla daldırma yağı (1,518 kırılma indisi) yerleştirin.
- Tutucuyu mikroskop odasındaki ters mikroskop sahnesine monte edin.
- Zaman içinde birden çok aşama pozisyonunda birden çok görüntü toplamak için mikroskop kontrol yazılımındaki seçenekleri ayarlayın.
- Büyütme (100x) ve polikromik lens (GFP/mCherry) ayarlayın. Bir göz parçası ve brightfield (BF) kullanarak, odak düzlemi bulmak ve nokta listesi yöneticisi açın.
- Sahneyi hareket ettirerek ve mikroskop yazılımındaki her pozisyonun koordinatlarını işaretle düğmesine tıklayarak depolayarak en az 10 ilgi çekici pozisyon seçin. Fotobeyaztma ve fototoksisiteyi önlemek için birbirine yakın konumlardan kaçının. Kamera valfini göz parçasından monitöre çevirin ve odak düzlemini ayarlayarak ve nokta listesi yöneticisindeki Nokta Yı değiştir düğmesini tıklatarak her noktayı kalibre edin.
- Deneme tasarımcısını açın ve her sekmedeki tüm deneysel parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın:
- Z-istifleme kutusunun işaretini aç.
- Floresan kanalları seçin ve en iyi aydınlatma ayarlarını ayarlayın. Burada aşağıdaki ayarlar kullanılmıştır: mCherry kanalı için, mCherry filtre setleri (EX575/25; EM625/45), P yoğunluk ve 200 ms maruz kalma süresi; GFP kanalı için, GFP filtre seti (EX475/28; EM525/48), P yoğunluk ve 80 ms; ve BF görüntüler için, POL kanal, 5% yoğunluk ve 50 ms.
- Görüntüleri edinme ile denemenin toplam süresi arasındaki aralıkları seçin. Burada deneyin 10 saat boyunca 5 dk aralıklarla gerçekleştirildi.
- Seçilen konumlar için odak bakımını etkinleştirin (burada kullanılan sistem için, UltimateFocus onay kutusuyla Koru odağı işaretleyerek).
- Görüntü dosyalarının otomatik olarak kaydedilmesi gereken veri klasörünü seçin.
- Mikroskop yazılım denetimindeki tüm ayarları yeniden denetleyin ve hızlandırılmış denemeyi başlatın.
- Denemenin ilk saatinden sonra, tüm sahne pozisyonlarının hala odakta olup olmadığını kontrol edin. Gerekirse, görüntü edinme arasındaki zaman aralıkları sırasında odak ayarlayın.
- Zaman atlamalı deney tamamlandığında, Petri kabını çıkarın ve biyogüvenlik protokolüne göre 35 mm'lik kabı agarose pedle birlikte kullanın.
NOT: Adım 5.2'den sonra atılan tüm adımlar DeltaVision Elite kullanıcıları için özeldir. Diğer sistemleri kullanan araştırmacıların ayarları tek tek sistemlere göre ayarlamaları gerekir.
6. Fiji yazılımı kullanarak hızlandırılmış görüntülerin işlenmesi ve film üretimi
- Deneysel verileri Fiji yazılımıyla yüklü bir bilgisayara aktarın. Fiji programını başlatın ve Dosya'yı kullanarak bir resim açın | Resim dosyasını sürükleyip Fiji'ye bırakarak veya açarak açın.
- Bio-Formats Alma Seçenekleri,yığın görüntüleme seçenekleri Hyperstack ile görünüm yığını nı seçin, renk seçenekleri bileşik renk moduna tıklayın ve Otomatik Ölçekişaretleyin.
- Görüntü yığınları arasında kaydırarak, hücrelerin ve bdelloplastların deney boyunca odakta kalıp kalmadığı konusunda değerlendirin. DnaN-mNeonGreen gelen yeşil floresan lekeler büyüme aşaması boyunca bdelloplasts içinde B. bakteriovorus hücreleri içinde mevcut olup olmadığını kontrol edin, ve yırtıcı yaşam döngüsünün tüm aşamalarında görselleştirilmiş olabilir emin olun.
- Belirli bir B. bacteriovorus hücre /bdelloplast analiz etmek için, Fiji menüsünde seçim araçları kullanarak işaretlemek(Dikdörtgen, Oval, Çokgen, veya Freehand). Resim kullanarak seçilen bölgeyi çoğaltma | Yinelenen veya Ctrl + Shift + Dkullanarak .
- Her floresan kanalının parlaklığını ve kontrastını aşağıdaki gibi ayarlayın:
- Tek bir kanal seçmek Channel tools için Resim | Renk | Kanal araçları veya Ctrl + Shift + Z ve ilgi kanalı seçin(Kanal 1: mCherry, Kanal 2: mNeonGreen, Kanal 3: brightfield).
- Resim'de B&C menüsünü açarak floresan kanaldaki görüntülerin parlaklığını ve kontrastını ayarlama | Ayarla | Parlaklık/Kontrast veya Ctrl + Shift + C'yetıklayarak .
- Analyze kullanarak ölçek çubuğu ekleme | Araçlar | Ölçek çubuğu. Resimler 'e tıklayarak resimlere zaman damgası ekleyin | Yığınlar | Zaman Damgası.
- Değiştirilmiş görüntüleri kaydetmek için Dosya | As'ı kaydedin ve görüntü dizisi olarak kaydetmek için TIFF'i, film üretmek için AVI'yi veya geçerli çerçevenin tek bir görüntüsünü kaydetmek için PNG'yi seçin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Açıklanan TLFM tabanlı sistem, B. bacteriovorus hücrelerinin zaman içinde izlenmesini sağlar(Şekil 3, Film 1) ve karmaşık yırtıcı yaşam döngüsünün her aşaması hakkında değerli bilgiler sağlar. PilZ-mCherry füzyonu tüm yırtıcı hücrenin saldırı evresinde ve büyüme evresinin erken evresinde etiketlenmesini sağlar(Şekil 3). Saldırıdan replikorfaza geçiş sadece konak bdelloplast oluşumu tarafından değil, aynı zamanda DnaN-mNeonGreen floresan...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Yaşayan bir antibiyotik olarak B. bakteriovorus kullanarak artan ilgi nedeniyle, yırtıcı yaşam döngüsü gözlemlemek için yeni araçlar, özellikle yırtıcı-patojen etkileşimleri, ihtiyaç vardır. Sunulan protokol, özellikle ev sahibi nin içinde büyümesi sırasında, tüm B. bakteriovorus yaşam döngüsünü gerçek zamanlı olarak izlemek için kullanılır. Ayrıca, DNA polimeraz III holoenzimfloresan etiketli beta kıskacı üreten bir suş uygulaması B. bakteriovorusüreme aşaması boyunca kromozom replikasyon prog...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Bilim Merkezi hibe Opus tarafından desteklenmiştir 2018/29/B/NZ6/00539 J.Z.C.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Santrifüj | MPW MED. INSTRUMENTS | MPW-260R | Rotor ref. 12183 |
| SertifikalıMoleküler Biyoloji agaroz | BIO-RAD | 161-3100 | agaroz pedi için düşük floresan agaroz |
| Fiji | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | Açık kaynaklı görüntü işleme paketi |
| Cam Alt Çanak 35 mm | ibidi | 81218-200 | kaplamasız cam |
| Mikroskop | GE | DeltaVision Elite Mikrotitre | Aşaması, nihai odak lazer modülü, DV Elite CoolSnap HQ2 Kamera, SSI montajı FP DV, kit obj. Oly 100x yağ 1.4 NA, prizma Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V |
| Minisart Filtre 0.45 & mikro; m | Sartorius | 16555----------K | Selüloz Asetat, Steril, Luer Lock Outlet |
| Start SoftWoRx | GE | Üretici tarafından sağlanan görüntüleme yazılımı |
Kaynaklar
- Shatzkes, K., et al. Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs. mBio. 7 (6), (2016).
- Iebba, V., et al. Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Cystic fibrosis isolates. Frontiers in Microbiology. 5, (2014).
- Willis, A. R., et al. Injections of Predatory Bacteria Work Alongside Host Immune Cells to Treat Shigella Infection in Zebrafish Larvae. Current biology: CB. 26 (24), 3343-3351 (2016).
- Lambert, C., et al. Characterizing the flagellar filament and the role of motility in bacterial prey-penetration by Bdellovibrio bacteriovorus. Molecular Microbiology. 60 (2), 274-286 (2006).
- Lambert, C., et al. A Predatory Patchwork: Membrane and Surface Structures of Bdellovibrio bacteriovorus. Advances in Microbial Physiology. 54, 313-361 (2008).
- Makowski, Ł, et al. Initiation of Chromosomal Replication in Predatory Bacterium Bdellovibrio bacteriovorus. Frontiers in Microbiology. 7, 1898(2016).
- Makowski, Ł, et al. Dynamics of Chromosome Replication and Its Relationship to Predatory Attack Lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus. Applied and Environmental Microbiology. 85 (14), (2019).
- Fenton, A. K., Kanna, M., Woods, R. D., Aizawa, S. I., Sockett, R. E. Shadowing the actions of a predator: backlit fluorescent microscopy reveals synchronous nonbinary septation of predatory Bdellovibrio inside prey and exit through discrete bdelloplast pores. Journal of Bacteriology. 192 (24), 6329-6335 (2010).
- Kuru, E., et al. Fluorescent D-amino-acids reveal bi-cellular cell wall modifications important for Bdellovibrio bacteriovorus predation. Nature Microbiology. 2 (12), 1648-1657 (2017).
- Dashiff, A., Junka, R. A., Libera, M., Kadouri, D. E. Predation of human pathogens by the predatory bacteria Micavibrio aeruginosavorus and Bdellovibrio bacteriovorus. Journal of Applied Microbiology. 110 (2), 431-444 (2011).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
