Astrositler serebral korteksi düzgün bir şekilde döşer ve karmaşık morfolojilerinin analizini hücresel düzeyde zorlaştırır. Burada sağlanan protokol, kortikal astrositleri ayırmak ve hacimlerini ve morfolojilerini kullanıcı dostu bir görüntü analizi ardışık düzeni ile analiz etmek için rahim elektroporasyonunu temel alan çok renkli etiketleme kullanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kortikal Fare Astrositlerini Bireyselleştirmek için Çok Elbiseli Genom Bütünleştirici Renk (MAGIC) İşaretçilerinin Utero Elektroporasyonunda
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Fare serebral korteksinde bulunan protoplazmik astrositler (PrA) sıkıca yan yana getirilir ve yetişkin aşamalarında görünüşte sürekli üç boyutlu bir matris oluşturur. Şimdiye kadar, hiçbir immünostaining stratejisi onları ayıramaz ve morfolojilerini olgun hayvanlarda ve kortikogenezi boyunca segmentlere ayıramaz. Kortikal PrA, dorsal palyumda bulunan progenitörlerden kaynaklanır ve bütünleştirici vektörlerin utero elektroporasyonunda kullanılarak kolayca hedeflenebilir. Bu hücreleri, belirli hücre altı bölmelere hitap eden farklı floresan proteinleri (mavi, siyan, sarı ve kırmızı) stochastically ifade etmek için piggyBac / Tol2 transpozisyonuna ve Cre /lox rekombinasyonuna dayanan çok adresli genom bütünleştirici renk (MAGIC) İşaretleyici stratejisi ile etiketlemek için bir protokol sunulmaktadır. Bu çok renkli kader haritalama stratejisi, gliogenez başlamadan önce yakındaki kortikal progenitörleri renk belirteçlerinin kombinasyonlarıyla işaretlemeyi ve bireysel hücre düzeyinde embriyonikten yetişkin aşamalarına kadar astrositler de dahil olmak üzere soyundan gelenleri izlemeyi sağlar. Çok Elbiseli Genom Bütünleştirici Renk İşaretleyicileri (MAGIC Markers veya MM) tarafından sağlanan elektroporlu vektörlerin ve renk kontrastlarının konsantrasyonunu ayarlayarak elde edilen yarı seyrek etiketleme, yoğun anatomik düzenlemelerine rağmen astrositleri bireyselleştirmeyi ve bölgelerini ve karmaşık morfolojilerini ayırmayı sağlar. Burada sunulan, elektroporasyon prosedürünün ayrıntılarını, konfokal mikroskopi ile çok kanallı görüntü yığınlarının alımını ve deneycinin bireysel PrA hacmini ve morfolojisini değerlendirmesini sağlayacak bilgisayar destekli üç boyutlu segmentasyonu içeren kapsamlı bir deneysel iş akışı sunulmaktadır. Özetle, MAGIC Marker'ların elektroporasyon, çok sayıda astrositleri ayrı ayrı etiketlemek ve anatomik özelliklerine farklı gelişim aşamalarında erişmek için uygun bir yöntem sağlar. Bu teknik, transgenik muhabir çizgilerine sahip karmaşık haçlara başvurmadan çeşitli fare modellerinde kortikal astrosit morfolojik özelliklerini analiz etmek için yararlı olacaktır.
Giriş
Astrositler beyin gelişiminde ve fizyolojisinde çok sayıda hayati fonksiyon oynar1. Besin alımını ve kan akışını düzenledikleri kan-beyin bariyerindeki rollerinin yanı sıra, nöronal aktiviteyi ve davranışı değiştirebilecek nöromodülatörler üretirken sinaps oluşumuna ve işlevine aktif olarak katkıda bulunurlar2. Ayrıca, astrosit disfonksiyonu çeşitli nörolojik bozukluklara katkıda bulunur3. Serebral kortekste bulunan astrositler, nöronal süreçlerle kapsamlı temas sağlayan ayrıntılı bir morfoloji gösterir. Devre fonksiyonu için gerekli olan bu kontaklar, hücre yapıştırma proteinleri aracılığıyla ast....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Burada açıklanan tüm hayvan prosedürleri kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvan protokolleri Charles Darwin hayvan deney etik kurulu (CEEACD/N°5) tarafından onaylanmıştır.
1. Utero elektroporasyonda MAGIC İşaretleyiciler için endotoksin içermeyen plazmidlerin hazırlanması
- Bakteriyel dönüşüm
- Buz üzerinde, -70 °C'de depolanan DH5 alfa yetkin hücrelerini çözün.
- Uygun antibiyotiği (100 μg/mL ampisilin veya 50 μg/mL kanamycin) içeren agar plakalarını 37 °C'de ısıtın.
- 10 μL çözülmüş DH5 alfa yetkin hücrelerinde 1 μL 5–50 ng MAGIC Markers plazmid DNA ekleyin ve karıştırmadan 10 dakika....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Embriyonik kortikal progenitörlerde MAGIC İşaretleyicilerin elektroporasyonu, astrositlerin serebral korteks gelişiminin erken ve geç aşamalarından itibaren etiketlenmesini sağlar (Şekil 1). Bu astrositler tüm kortikal katmanlarda çeşitli postnatal evrelerde (P4, P7, P21) bulundu ve tüm serebral kortekse geniş bir şekilde dağıldılar. 20x 0.8 NA (veya daha yüksek NA) hedefiyle elde edilen ve Z-stack rekonstrüksiyonları olarak monte edilen karo konfokal görüntülerle değerlendirildiler (
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Kortikal progenitörlerdeki MAGIC Marker'ların utero elektroporasyonunda (İEÜ) (Şekil 1) doğum sonrası serebral korteks boyunca astrositlerin farklı postnatal aşamalarda etiketlenmesini sağladı (P4-P7-P21, Şekil 2). İlginçtir ki, E13.5'ten E15.5'e gerçekleştirilen elektroporasyon kortikal astrositler14ile ilgili benzer etiketleme desenleri verdiğinden, İEÜ'nün aşaması kritik değildir. Bununla birlikte, etiketli piramidal nöronların kortika.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
S. Fouquet'e ve Institut de la Vision ve Institut des Neurosciences de Montpellier'in (MRI ve RAM) görüntüleme ve hayvan çekirdeği tesislerine teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Région Ile-de-France ve Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer'dan S.C'a ve Université Paris-Saclay'dan (Initiatives Doctorales Interdisciplinaires) L.A.'ye burslarla, Avrupa Araştırma Konseyi'nden (ERC-SG 336331, PI J. Valette) - E.H., Agence Nationale de la Recherche tarafından ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (Fransa BioImaging) sözleşmeleri kapsamında , Fondation pour la Recherche Médicale (Ref. DBI20141231328), ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1.1 Bakteri dönüşümü | |||
| Ampisilin | Euromedex | EU0400-C | |
| DH5 alfa yetkin hücreler | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Buz kutusu | Dutscher | 139959 | |
| Kanamisin | Sigma | 60615 | |
| LB Agar | Sigma | L2897 | |
| SOC medium | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Steril petri kabı- 10 cm | Thermo Fisher | 150350 | |
| Su banyosu | VWR | 462-0556H | |
| 1.2 Plazmit kültürü | |||
| 14 ml kültür tüpü | Dutscher | 187262 | |
| Cam erlenmeyer- 2L | Fisher Scientitic | 11383454 | |
| LB medium | Sigma | L3522 | |
| 1.3 Plazmid DNA hazırlama | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| 2.1 Çözeltilerin hazırlanması | |||
| 26 G x 1/2 iğne | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 G x 1/2 iğne | Terumo | 8AN3013R1 | |
| Hızlı Yeşil | Sigma Aldrich | F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Tek kullanımlık polipropilen şırınga, 1 mL | Dutscher | 50002 | |
| 2.2 Ameliyat materyalinin hazırlanması | |||
| Adson Forseps - DeBakey Deseni- 12.5 cm | FST | 11617-12 | |
| Kemerli Uçlu Forseps- 10 cm | FST | 11071-10 | |
| Cam boncuk sterilizatörü Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| Cam mikropipet 1 mm çap | FHC | 10-10-L | |
| Graefe Forseps - Titanyum 1 mm Uçlar Hafif Eğri - 10 cm | FST | 11651-10 | |
| Graefe Forseps - Titanyum 1 mm Uçlar Düz- 10 cm | FST | 11650-10 | |
| İris Makası - Hassas Düz- 9 cm | FST | 14060-09 | |
| Laboratuvar bandı | Fisher Scientitic | 11730454 | |
| Mikroenjektör | INJECT+MATIC | Katalog numarası | |
| Olsen-Hegar İğne Tutucu - 12 cm | FST | 12002-12 | |
| Fiber optik | VWR | 631-1806 | |
| Plastik kaplı teknik inceleme | Distrimed | 700103 | |
| Signagel elektrot jeli | Free-Med | 15-60 | |
| Steril Petri kabı - 35 mm | Dutscher | 056714 | |
| Sterilizatör, cam kuru boncuk, Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 Gebe dişi farenin hazırlanması | |||
| Alkol pedi | Alcomed | 1731000 | |
| Buprecare | Axience | 0.3 mg / ml | |
| Kompres | tRAFFIN | 70189 | |
| Ketamin | Merial | Imalgene 1000 | |
| Oküler jel | tvm lab | Ocry-jel | |
| RjOrl:İSVİÇRE fareleri | Janvier Labs | ||
| Vetadine,% 10 çözelti | Vetoquinol | 4337400113B | |
| Isıtma pedi | Harvard Aparatı | 72-0493 | |
| Xylazine | Bayer | Rompun% 2 | |
| 3.2 Elektroporasyon | |||
| Emilebilir sütür Boyut 4-0 45 cm Sütür 1-İğne 19 mm Uzunluk 3/8 Daire Ters | Novosyn | C0068220 | |
| Electroporateur Sonidel | Sonidel | NEPA 21 | |
| Steril transfer pipetleri (ayrı ayrı sarılmış) | Dutscher | 043202S | |
| 3 mm platinyum disk elektrotlu cımbız | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 Doku toplama ve kesit alma | |||
| 24 oyuklu plaka | Falcon | 353047 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U/P0014 | |
| Lamel | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X), kalsiyum yok, magnezyum yok | Fisher Scientific | 11540486 | |
| Oje | EMS | 72180 | |
| Slayt | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| Vibratom | Leica | VT1000S | |
| 5. Çok kanallı konfokal görüntüleme | |||
| 20X yağ NA 0.85 | Olympus | ||
| Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu | Olympus | FV1000 | |
| Plan Apochromat 20x/0.8 M27 | Carl Zeiss | ||
| 6. Astrosit bölgesel hacim segmentasyonu | |||
| IMARIS 8.3 ve sonraki sürümleri | Bitplane | ||
| 7. Astrosit arborizasyon izleme | |||
| 3D Görselleştirme Destekli Analiz yazılım paketi (Vaa3D) | HHMI - Janelia Araştırma Kampüsü / Allen Beyin Bilimi |
Kaynaklar
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nature Reviews Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit acti....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
