Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bir Sıçan Modelinde Odaklanmış Ultrason Kullanarak Konuma Özgü Kan Beyin Bariyeri Açılışına Tezgah Üstü Yaklaşım

4.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61113

⸱

13 Haziran 2020

 ,  ,  , 
1Department of Radiology, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Neurobiology, University of Alabama at Birmingham

Bu makalede

Özet

Mikrobubble ajanları ile odaklanmış ultrason odaklama odak ve geçici kan beyin bariyeri açabilirsiniz. Bu teknik, kan beyin bariyeri boyunca çok çeşitli ajanlar sunmak için kullanılmıştır. Bu makale, MRI kılavuzu olsun veya olmadan kemirgen beynine lokalize teslimat için ayrıntılı bir protokol sağlar.

Özet

Stereotaksik cerrahi, kemirgen beynine lokalize ilaç ve gen iletimi için altın standarttır. Bu teknik, bir hedef beyin bölgesine hassas lokalizasyon ve hedef yan etkilerin azaltılması da dahil olmak üzere sistemik teslimata göre birçok avantaja sahiptir. Bununla birlikte, stereotaksik cerrahi, çevirisel etkinliğini sınırlayan, uzun iyileşme süreleri gerektiren ve birden fazla beyin bölgesini hedeflerken zorluklar sağlayan son derece invazivdir. Odaklanmış ultrason (FUS), milimetre büyüklüğündeki bölgelerde kan beyin bariyerini (BBB) geçici olarak açmak için dolaşımdaki mikrobubbles ile birlikte kullanılabilir. Bu, normalde BBB'den geçemeyen sistemik olarak teslim edilen ajanların intrakraniyal lokalizasyonuna izin verir. Bu teknik stereotaksik cerrahiye noninvaziv bir alternatif sağlar. Bununla birlikte, bugüne kadar bu teknik, ekipmana ve standart yöntemlere sınırlı erişim nedeniyle nörobilim laboratuvarlarında henüz yaygın olarak benimsenmemiştir. Bu protokolün genel amacı, FUS BBB açılışına (BBBO) uygun fiyatlı ve tekrarlanabilir ve bu nedenle herhangi bir laboratuvar tarafından kolayca benimsenebilecek bir tezgah üstü yaklaşım sağlamaktır.

Giriş

Temel nörobilimdeki birçok keşfet rağmen, nörogelişimsel ve nörodejeneratif bozukluklar için ortaya çıkan tedavilerin sayısı nispeten sınırlı kalır1,2. Nörolojik bozukluklarda yer alan genlerin, moleküllerin ve hücresel devrelerin daha derin bir şekilde anlaşılması, mevcut tekniklerle insanlarda gerçekleşmez umut verici tedaviler önermektedir3. Etkili tedaviler genellikle beyin penetrable ve4,5 ,6,7,8olma ihtiyacı ile sınırlıdır. Bununla birlikte, belirli beyin bölgelerine lokalize ilaç teslimatının mevcut yöntemleri (örneğin, enjeksiyon veya kavun yoluyla doğum) invazivdir ve kafatasında bir açıklık yapılmasını gerektirir9. Bu ameliyatın invazivliği, insan beynine lokalize doğumun rutin kullanımını önler. Ek olarak, doku hasarı ve ortaya çıkan enflamatuar yanıtlar, intraserebral enjeksiyona dayanan temel ve preklinik çalışmalar için her yerde bulunan kafa karıştırıcıdır10. Ajanları kan beyin bariyeri (BBB) boyunca invaziv olarak teslim etme ve belirli beyin bölgelerine hedefleme yeteneği, nörolojik bozuklukların tedavileri üzerinde muazzam bir etkiye sahip olabilirken, aynı zamanda klinik öncesi araştırmalar için güçlü bir araştırma aracı sağlayabilir.

BBB genelinde minimum doku hasarı ile hedeflenen bir taşıma yöntemi, BBB 11, 12 , 13 , 14,15,16'yıodaklamak ve geçici olarak açmak için mikrobubbles ile birlikte transkraniyal odaklı ultrasondur (FUS). FUS BBB açılımı nörodejeneratif bozuklukların tedavisinde son zamanlarda ilgi gördü, nörotrofik faktörler 17 , 18 , 19 , gen tedavileri 20,21,22,antikorlar23,nörotransmitterler24ve nanopartiküller25 , 26,27,28,29 gibi beyin bölgelerini hedeflemek için terapötikleri lokalize ederek inme ve glioma . Geniş uygulama yelpazesi ve noninvaziv yapısıile 30,31, FUS BBB açıklığı rutin stereotaksik intrakraniyal enjeksiyonlara ideal bir alternatiftir. Ayrıca, insanlarda mevcut kullanımı nedeniyle30,32, bu tekniği kullanan preklinik araştırmalar son derece çevirisel olarak kabul edilebilir. Bununla birlikte, FUS BBB açılışı, erişilebilirlik eksikliği nedeniyle temel bilim ve preklinik araştırmalarda henüz yaygın bir teknik olmamıştır. Bu nedenle, bu tekniği kurmak isteyen laboratuvarlar için bir başlangıç noktası olarak FUS BBB açılışına tezgah üstü bir yaklaşım için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Bu çalışmalar ya yüksek güçlü hava destekli FUS spesifik ultrason dönüştürücü ya da düşük güçlü sönümlenmiş odaklanmış ultrasonik daldırma dönüştürücü ile yürütüldü. Dönüştürücüler, reaktif yükler için tasarlanmış bir RF güç amplifikatörü ve standart bir tezgah üstü fonksiyon jeneratörü tarafından tahrik edildi. Bu öğelerin ayrıntıları Malzeme Tablosu'nda bulunabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneysel işlemler UAB Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) yönergelerine uygun olarak yapılmıştır.

1. Odaklanmış ultrason sürüş ekipmanı kurulumu

  1. (1) ultrason dönüştürücünün girişini RF amplifikatörü çıkışına ve (2) RF amplifikatörün girişini fonksiyon jeneratörünün çıkışına bağlamak için 50 Ohm koaksiyel BNC kablosu kullanın.
  2. Fonksiyon üreteci modunu %1 görev döngüsü ile saniyede bir kez sinüzoid patlamasına ayarlayın.
    1. 50 dB RF amplifikatörle kullanılan 0,8 inç odak mesafesine sahip sönümlenmiş 1 MHz düşük güçlü daldırma dönüştürücüsü için başlangıç ayarlarını şu şekilde ayarlayın: 1 MHz sinüs dalgası, 1 V tepe noktası ile tepe noktası, 10k döngüsü, 1 s aralık (veya dönem).
    2. Hava destekli, 1.1 MHz yüksek güçlü dönüştürücü için, ilk ayarları şu şekilde ayarlayın: 1.1 MHz sinüs dalgası, 50 mV tepe noktası pik, 11k döngüler, 1 s aralık.
      NOT: Dönüştürücüleri su altında kalmadıkça çalıştırmayın. Ultrason odağına bir el veya başka bir vücut parçası yerleştirmeyin veya çalışırken dönüştürücü yüze dokunmayın.

2. Odaklanmış ultrason tezgah üstü kurulumu

  1. Stereotaksik çerçeveyi ve stereotaktik çerçeve tutucuyu 3D olarak yazdırın.
  2. Dönüştürücüsünü PVC boru tutan bir kelepçe kullanarak XYZ konumlayıcıya bağlayın (Şekil 1a). Kelepçeyi X ekseni kaydırağı üzerine cıvatalayın ve bir kanat somunu ile kilitleyin.
    1. Yüksek güçlü ultrason dönüştürücü kullanıyorsanız, eşleşen bir çift mıknatıs kullanarak PVC boruya takın. Bir mıknatısın bir deliği olduğundan ve diğerinin eşleşen bir çıkıntıya sahip olduğundan emin olun. PVC borunun altını kapın ve mıknatıslardan birini epoksi kullanarak takın (bkz. Şekil 1b).
    2. İkinci mıknatısı epoksi kullanarak yüksek güçlü ultrason dönüştürücünün üst merkezine takın. Dönüştürücünün tam merkezinde olduğundan emin olun (Şekil 1c).
  3. Yüksek güçlü ultrason dönüştürücü kullanıyorsanız, XYZ konumlandırıcıyı boş hale getirmek için bir işaretçi yapın. Bu işaretçinin ucu, ultrason dönüştürücü XYZ konumlayıcıya bağlandığında dönüştürücü odağının merkezinin boşluğundaki konumu gösterir. Dönüştürücünün odak mesafesinin uzunluğu artı dönüştürücünün kalınlığı olacak şekilde 18 G iğneden bir işaretçi yapın (Şekil 1d).
    1. Epoksiyi üçüncü bir mıknatısa uygulayın (bu mıknatıs pvc kapak mıknatısı ile de eşleşmektedir) ve işaretçinin üstüne takın. İşaretçi daha sonra XYZ nulling için PVC boru üzerindeki mıknatısa takabilecektir (Şekil 1d).
  4. Düşük güçlü daldırma dönüştürücüsü kullanıyorsanız, işaretçi ve montaj klibi için dosyayı 3D yazdırın.
    1. Montaj klipsini PVC boruya kırparak düşük güçlü daldırma dönüştürücüsünü PVC boruya takın ve dönüştürücüyü halkaya takın (Şekil 1f).
  5. Akrilik tabakadan kesilmiş parçaları stereotaktik çerçevenin üzerinde hayvanın başının üzerine dayanabilecek şekilde yapıştırarak bir su banyosu yapın (Şekil 1e).
    1. Banyonun dibinde hayvanın başının yaklaşık büyüklüğünde bir açıklık kesin. Su banyosundaki deliği poliimid bir bantla kapatın.
      NOT: Farenin kürklerini ıslatabileceği ve hipotermiye neden olabileceği için suyun poliimid bandın etrafına sızmaması için dikkatli olunmalıdır.
  6. 4 mm çapında ince kabuklu plastik veya cam küreyi MRI görünür sıvısı (örneğin, E Vitamini yağı) ile doldurarak bir MRI yapın ve kapatın. 3D baskılı stereotaksik çerçevenin sağ tarafındaki MRI fiducial tutucusuna yerleştirin (Şekil 2a).
  7. 3D baskılı çerçeve tutucuyu XYZ konumlayıcıya hayvan konumlandırması için iyi bir konumda sıkıca sabitleyin. Çerçeve tutucunun rostral ucundaki sekmeyi Y ekseni rayında eşleşen kanala kaydırın ve ayarlanan vidalarla sabitleyin(Şekil 1h, kırmızı oklar).
  8. XYZ konumlandırıcıyı kullanmak için, üreticinin talimatlarını izleyerek USB'yi seri dönüştürücüye bir bilgisayara takın ve dönüştürücüyü takın. Çalışma zamanı ortamını ve motor denetleyicisi yazılımını bilgisayara yükleyin.
    1. Denetleyici yazılımının ön panelinde bağlantı noktası seçimi açılan denetiminde USB'den seriye dönüştürücüyü seçerek yazılımda uygun seri bağlantı noktasının seçildiğinden emin olun. USB'yi seri dönüştürücüye 9 pinli seri geçit kablosu (örneğin, RS232 boş modem kablosu) kullanarak step motor kontrol cihazı kutusuna bağlayın.
    2. Step motorlarının yazılım kontrolü altında sürülebileceğini test etmek için denetleyici yazılımını çalıştırın. Bu adım yerel BT desteğinin yardımını gerektirebilir.

3. intrakraniyal hedefleme prosedürü

NOT: Bu deneyler için 250-350 g ağırlığında erkek Sprague Dawley sıçanları kullanılmıştır. Hayvanlar su ve sıçan yemeklerine ücretsiz erişime sahipti ve 12:12 saat ışık:karanlık döngüde muhafaza edildi.

  1. Hayvanı anestezi altına koyun (% 3 oksijenli izofluran) ve ayak parmağı sıkışmasına yanıt olup olmadığını kontrol edin. Ardından kateteri aşağıda açıklandığı gibi yerleştirin.
    1. Kuyruğu yapmak için bir lamba ile ısıtmak damara vurmak daha kolaydır. Hayvanı aşırı ısıtmamaya veya kuyruğu yakmamaya dikkat edin.
    2. Hayvan uyuduktan sonra (bir parmak sıkışmasına yanıt vermez), mikrobubbles, Evans mavi boya (EBD), MRI kullanıyorsanız gadobutrol MRI kontrastı ve ilgi çekici deneysel ajan sağlamak için kullanılacak 24 G kuyruk damar kateterini yerleştirin. Damar vurulduktan sonra, kan kılıfı dolduracak, kılıfı damarın içine daha fazla iterken iç iğneyi yavaşça çıkaracaktır.
      NOT: Fare kuyruğu damar enjeksiyonlarını ilk kez yapıyorsanız Stuart ve Schroeder33 gibi bir kılavuza bakın.
    3. Kan akışı yoksa, iğnenin damardan dürtmüş olabileceğini test etmek için kateter kılımını yavaşça damardan dışarı taşıyın. Kateter hafifçe geri çekildiğinde kan akarsa, önce damardan dürtme yapılır ve kateter yerleşiminin kuyrukta rostral olan başka bir yerde önceki konuma yeniden başlatılması gerekir.
  2. Kateter fişini salinle doldurun ve kateter fişini port kanla dolmuş olur olmaz kateter bağlantı noktasının ucuna vidalayın. Laboratuvar bandını yerinde tutmak için kateter ve kuyruğun etrafına dikkatlice sarın. Üstte küçük bir parça ile başlayın ve kateter fişinin en ucunun açıkta bırakarak kaudal yönde çalışın.
  3. Anestezi hattını stereotaksik çerçevedeki anestezi konektörüne takın (Şekil 2a) ve ağzı ısırık çubuğuna yerleştirerek ve kulak çubuklarını her iki kulak kanalına yönlendirerek hayvanların kafasını çerçeveye sabitlayın, ardından ayarlanan vidaları sıkın. Hayvanların kafasının güvenli ve düz olduğundan emin olun.
  4. Hayvanı MRI yatağına taşıyın ve anestezi hattını burun konisine bağlayın. Bu protokolde 9.4 T küçük delikli hayvan MR'ı kullanıldı.
  5. Koordinat ölçümleri için tüm beynin yanı sıra MRI fiducial(Şekil 2b)yakalayan koronal ve eksenel T2 ağırlıklı görüntüleri toplayın. MRI protokolünü oluşturabilmeleri için yerel MRI fizikçisine veya teknolojisine aşağıdaki bilgileri sağlayın.
    1. Koronal görüntüler için(Şekil 2b üst), aşağıdaki parametreleri kullanın: görüntü sayısı: 27, genişlik: 62,2 mm, yükseklik: 62,2 mm, derinlik: 37,97 mm, Voxel boyutu: 0,24 x 0,24 x 1,41 mm3.
    2. Eksenel görüntüler için (Şekil 2b alt), aşağıdaki parametreleri kullanın: görüntü sayısı: 13, Genişlik: 61,47 mm, Yükseklik: 53,81 mm, Derinlik: 16,7 mm, Voxel boyutu: 0,41 x 0,21 x 1,29 mm3.
      NOT: Düzlem çözünürlüğündeki koronal 0,25 mm'ye yakın olduğu ve görüntüler tüm beyni kapsadığı ve fidüsyal olduğu sürece bu kesin parametrelere sahip olmak gerekli değildir.
  6. FUS ile hedeflenecek MRI'dan beyin bölgesine olan mesafeyi kaydederek yukarıdaki görüntülerden koordinat ölçümleri toplayın.
    1. Tarayıcıda, adım 3.5'te toplanan koronal görüntülerde, fiducial'ın en büyük olduğu görüntüyü bulun, bu da fiducial'ın merkezini gösterir. Hem medial/lateral yönde hem de dorsal ventral yönde(Şekil 2b, üst) mm'deki ilgi çekici beyin bölgesine olan uzaklığı kaydedin (MRI yazılımı bir ölçek veya nokta ölçüm aracına sahip olacak, bunun nasıl yapılacağını yerel MRI teknolojisine veya fizikçisine danışacaktır).
    2. Tarayıcıda, adım 3.5'te toplanan eksenel görüntülerde, fidüsyonun en üstünü gösteren görüntüyü bulun ve fidüsilin merkezinden hedef beyin bölgesine olan mesafeyi hem dorsal/ventral yönde hem de medial/lateral yönde ölçün (Şekil 2b, alt).
    3. İki medial/yanal ölçümü karşılaştırın ve farklıysa ortalamayı kullanın. Bu koordinat ölçümleri, FUS odak noktasını XYZ konumlandırıcı ile hedef beyin bölgesine yönlendirmek için 4.3 adımında daha sonra kullanılacaktır.
  7. MRI prescan görüntülerini toplayın. Bu görüntüleri FUS BBB açılışından sonra toplanan görüntülerle karşılaştırın (Şekil 4). T1 ağırlıklı görüntüler daha sonra BBB açıklığı görselleştirmek için kullanılacaktır, T2 ağırlıklı görüntüler daha sonra FUS tedavisi sonrasında doku hasarı oluşmamasını sağlamak için kullanılacaktır34.
    1. T1 ağırlıklı eksenel görüntüler için aşağıdaki parametreleri kullanın: genişlik: 30 mm, yükseklik: 51,2 mm, derinlik: 3,0 mm, voksel boyutu: 0,23 x 0,2 x 0,23 mm3, görüntü sayısı: 13.
    2. T2 ağırlıklı eksenel görüntüler için aşağıdaki parametreleri kullanın: genişlik: 30 mm, yükseklik: 51,2 mm, derinlik: 2,6 mm, voksel boyutu: 0,2 x 0,2 x 0,2 mm3, görüntü sayısı: 13.
    3. T1 ağırlıklı koronal görüntüler için aşağıdaki parametreleri kullanın: genişlik: 30 mm, yükseklik: 30 mm, derinlik: 27 mm, voksel boyutu: 0,16 x 0,16 x 1 mm3, görüntü sayısı: 27.
    4. T2 ağırlıklı koronal görüntüler için aşağıdaki parametreleri kullanın: genişlik: 30 mm, yükseklik: 30 mm, derinlik: 27 mm, voksel boyutu: 0,12 x 0,12 x 1 mm3, görüntü sayısı: 27.
      NOT: Adım 3.5'te olduğu gibi, bu görüntüleme parametrelerinin listelenenlerle tam olarak aynı olması gerekmez. Bu görüntüler, adım 3.5'te toplananlardan daha küçük bir FOV'a ve daha yüksek çözünürlüğe sahiptir.
  8. Hayvanı stereotaksik çerçevede tutarak, hayvanı MRI yatağından tezgah üstü FUS kurulumuna hızlı bir şekilde taşıyın. Anestezi etkisi altında transfer için hayvanın uykuda kalmasını sağlayın.
  9. Daha uzun aktarım süreleri için, aktarım için hayvana ve çerçeveye sığacak kadar büyük bir kutu kullanın. Anestezi fişi hala takılıyken, hayvanı ve çerçeveyi kutunun içine yerleştirin ve fazla izofluranın kutuyu birkaç dakika doldurmasına izin verin. Anestezi hattının fişini çekin ve hızlı bir şekilde aktarın.

4. Odaklanmış ultrason prosedürü

  1. FUS tezgah kurulumuna geldikten sonra, anestezi hattını hemen burun konisine takın ve oksijenle% 1.5-3 izofluran çalıştırmaya devam edin. Hayvanın uyanmasını önlemek için bunu mümkün olduğunca çabuk yapın.
  2. Çerçeveyi çerçeve tutucusuna kaydırın ve sıkıca yerine tutturun. Hayvanın kafasını tıraş etmek için makas kullanın. Fazla saçları fırçalayın ve saç derisine saç çıkarıcı krem uygulayın. 3 dakika bekletin ve su ve gazlı bezle silin.
  3. MRI hedefleme için mevcut değilse, işaretçi ucunu bregma'ya dokunarak (bunun için bir kafa derisi kesisi gerekir) ve yazılımı geçersiz kılarak veya koordinatları kaydederek işaretçi konumunu bregma'ya boş etmek için standart (3D baskılı değil) stereotaktik bir çerçeve kullanın. Yazılımdaki yukarı 50 düğmesine tıklayarak ve işaretçiyi dönüştürücüyle değiştirerek XYZ taşıyıcısını 50 mm yukarı taşıyın. Daha önce açıklandığı gibi bir sıçan beyin atlasına dayanarak35Yazılımdaki basamak düğmelerini kullanarak istenen beyin koordinatlarına geçin. MRI yerine bu yöntemi kullanıyorsanız, bölüm 4.6'ya geçin.
  4. MRI kılavuzunu kullanıyorsanız, işaretçiyi takın ve işaretçiyi MRI fiducial konumuna taşıyın (Şekil 1d,g). İşaretçiyi MRI fiducial'ın en üstüne ve ortasına yerleştirin (işaret etmek için fiducial tutucunun üst kısmında küçük bir delik sağlanır). MRI görüntüsündeki tüm mesafelerin hesapladığı nokta olan boş konum düğmesini tıklatın.
  5. İşaretçiyi kaldırın ve konumlandırıcıyı orta/yan koordinatlara ve rostral/kaudal koordinatlara taşıyın. Su banyosu ve ultrason jelinin yerleştirilmesine izin vermek için yukarı 50 düğmesine basarak pozisyoneri yükseltin. Z ekseni yolculuğunun en üstüne ulaşılırsa, nulllama konumu geçersiz kılınır. Dorsal/ventral koordinat dönüştürücü eklendikten sonra ayarlanır.
  6. Hayvanın kafa derisine ultrason jeli uygulayın ve su banyoyu jel üzerine bastırılmış poliimid bant penceresi ile hayvanın üzerine yerleştirin. Ultrason jelinde hava kabarcıkları olmadığından emin olun.
  7. Su banyosunu gazlı suyla doldurun.
  8. Yüksek güçlü dönüştürücü kullanıyorsanız, konumlayıcıyı mıknatıs suyun hemen üzerinde olacak şekilde dirayeti haline getirin. Hava kabarcıklarının yüzün altına sıkışmasını önlemek ve mıknatısları bağlamak için dönüştürücüyu bir açıyla suya dikkatlice indirerek konumlandırıcıya takın.
  9. Düşük güçlü daldırma dönüştürücüsü kullanıyorsanız, konumlayıcıyı dönüştürücü klipsinin hemen üstündeki suya haline getirin. Daha sonra hava kabarcıklarının yüzün altına sıkışmasını önlemek için dönüştürücünün yavaşça suya bir açıyla indirilerek yerine kırpın.
    NOT: Şeffaf bir banyo, kabarcıklar için dönüştürücü yüzünün altına bakarken faydalıdır.
  10. Konumlayıcıyı sırt/ventral koordinata 2007'den aşağı 2007'den buyur.
  11. RF güç amplifiktörü açın.
  12. İğne ucunu kateter fişine sokup enjekte ederek %3 Evans mavi boyasının (EBD) 1 mL/kg'ını enjekte edin. 5 dakika boyunca dolaşmasına izin verin.
  13. Mikrobubbles kabarcık çalkalayıcı ile şiddetli bir şekilde sallayarak aktive.
    1. 2 FUS tedavisini ve 18 G kanatlı infüzyon setinin borularını hesaba katmak için0,2mL salin içinde 30 μL / kg mikrobubbles (kabarcık conc. 1.2 x 10 10 / mL) dozunun 5 katını hazırlayın. Örneğin, sıçan 200 g ağırlığındaysa, 18 G iğne ucu içeren şırıngayı 1 mL salin içinde 30 μL mikrobubbles ile doldurun.
      NOT: Kanatlı infüzyon setini hem almak hem de enjekte etmek için 18 G iğne ucu kullandığınızdan emin olun.
    2. Mikrobubblelerin düzgün bir dağılımını elde etmek için şırıngayı birkaç kez ters çevirin. Daha sonra kanatlı infüzyon setini takın ve doldurun. Şırınnayı infüzyon pompasına yerleştirin ve infüzyon pompasını 6 mL/s hızında 0,2 mL'ye ayarlayın. Bu, 2 dakikalık FUS maruziyeti üzerinde mikrobubbles yavaş infüzyonu sağlayacaktır.
    3. Kanatlı iğneyi kateter fişine yerleştirin.
  14. İlk olarak, infüzyon pompasını çalıştırın, 3 s bekleyin ve fonksiyon üretecindeki çıkış etkinleştir düğmesine basarak FUS tedavisine başlayın (Etiketli"üzerinde" malzeme tablosundaki fonksiyon üretecinde). Mikrobubbles temizlemek için arada 5 dakika ile bölge başına iki kez tekrarlayın.
    1. İnfüzyon pompası 2 dakika durduğunda FUS tedavisini durdurmak için fonksiyon jeneratöründeki açma düğmesine tekrar basın.
    2. Mikrobubbles temizlemek için 5 dakika bekleyin. Daha sonra infüzyona ve ikinci FUS tedavisine başlayın.
    3. İkinci FUS tedavisinden hemen sonra, gadobutrol kontrastını (MRI kullanıyorsanız) ve örneğin viral parçacıklar gibi ilgi çekici maddeyi enjekte edin. Tüm ajanların toplam teslim hacmi 5 mL/kg'ı geçmemelidir.
      NOT: İlgi çekicinin teslimat zamanlaması (örneğin, FUS BBB açılışından önce veya sonra) kullanılan temsilciye bağlı olarak farklılık gösterebilir.
  15. RF güç amplifikatörunu kapatın ve hayvanı hemen MRI'a geri taşıyın.

5. BBB açılışının MRI onayı

  1. MRI kullanılamıyorsa, bölüm 6'ya atlayın ve BBB açılışını onaylamak için EBD ifadesini kullanın.
  2. Hayvanı 3.7.
  3. BBB açılış bölgesinde gadobutrol MRI geliştirmesini görselleştirmek için adım 3.7'de kullanılan görüntüleme parametreleriyle MRI sonrası taramaları toplayın (Şekil 3b,e).

6. Perfüzyon ve doku toplama

  1. Kan tamamen temizlenine kadar hayvanı soğuk% 4 formalin ile perfuse edin.
  2. Beyni çıkarın ve bir gecede 4 °C'de% 4 formalin veya PFA'ya yerleştirin. Daha sonra, beyin batana kadar (yaklaşık 2-3 gün) beyni% 30 sakkaroz çözeltisine yerleştirin. Son olarak, sıvı nitrojende veya kuru buzda flaş dondurun ve kriyoseksiyona kadar -80 °C'de saklayın.
  3. OCT'de beyni dondurun ve kriyoseksiyon alın.
  4. Floresan mikroskopi için bölümleri düzeltin ve örtün. EBD ekscitasyon 470 ve 540 nm'de zirveler ve emisyon 680 nm'de zirveler. Genel hücresel morfolojiyi görselleştirmek için DAPI montaj ortamına sahip coverlip.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada, mikrobubbles ile odaklanmış ultrasonun hem düşük güçlü daldırma dönüştürücüsü (Şekil 3) hem de FUS dönüştürücüsü ( Şekil4) ile yukarıda belirtilen parametreleri kullanarak lokalize BBB açıklığını teşvik edebileceğini gösteriyoruz. İlk olarak, erken deneylerde, düşük güçlü daldırma dönüştürücüsü bir beyin yarımküresine veya ön (Şekil 3b) veya medial(Şekil 3a)hedeflenmiştir. Hayvanlar daha sonra 2...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, MRI rehberliği ile ve MRI rehberliği olmadan intrakraniyal hedefleme için iki farklı dönüştürücü ve yöntem de dahil olmak üzere alternatif yaklaşımlarla mikrobubble destekli FUS BBB açılışına bir tezgah üstü yaklaşım tanımladık. Şu anda, laboratuvarda MRI destekli FUS BBB açıklığı oluşturmak için, kullanıcı dostu arayüzlerle son derece standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlayan mükemmel kullanıma hazır cihazlar satın alma seçeneği vardır. Ancak, birçok laboratuvar bu tür aletlerin maliyetine hazırla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu araştırma kısmen Clemson Üniversitesi'ne (1632881) NSF EPSCoR Araştırma Altyapısı hibesi ile desteklendi. Buna ek olarak, bu araştırma kısmen Civitan Uluslararası Araştırma Merkezi, Birmingham, AL tarafından desteklendi. Yazarlar, Birmingham Küçük Hayvan Görüntüleme Paylaşılan Tesis Hibesi'ndeki Alabama Üniversitesi'nin hizmet ve olanaklarının [NIH P30 CA013148] kullanıldığını minnetle kabul ediyor. Yazarlar Rajiv Chopra'yı desteği ve rehberliği için kabul ediyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kabarcık çalkalayıcıLantheus Medical ImagingVMIXVIALMIX, Definity mikro kabarcıkları etkinleştirmek için kullanılan çalıştırma cihazı
Kateter tapası / Enjeksiyon kapağıSAI infüzyon teknolojileriParça Numarası: ICKateter tapası / Enjeksiyon kapağı
Evans mavi boyaSigmaE2129-10GEvans mavi boya
Fonksiyon üreteciTektronixAFG3022BÇift kanallı, 250MS/s, 25MHz
FUS dönüştürücü, 1.1MHzFUS InstrumentsTX-1101 MHz MRI uyumlu, hidrofonlu küresel odaklı ultrason dönüştürücü
Fareler ve Sıçanlar için ısıtma yastığıKent ScientificPS-03Isıtma yastığı - Fareler ve Sıçanlar için PhysioSuite
İnfüzyon pompasıKD Scientific780100KDS 100 Eski Tek Şırınga İnfüzyon Pompası
Kapton bantGizmo Dorkshttps://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91		3D Yazıcılar ve Baskı için Gizmo Dorks Kapton Bant (Poliimid), 8 x 8 inç, Paket Başına 10 Yaprak
Düşük güçlü daldırma dönüştürücü, 1MHzOlympusV303-SUDaldırma Dönüştürücü, 1 MHz, 0,50 inç. Eleman Çapı, Standart Kasa Stili, Düz UHF Konnektörü, F=0.80IN PTF
Mıknatıs setleriWINOMOhttps://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC		WINOMO 15mm Dikiş Scrapbooking için Manyetik Çanta Tokaları Dikin - 10 Takım
RF amplifikatörE & IA07575W
Kuyruk ven kateteriBD382512/ Fisher Ürün: NC122851324g BD Insyte Autoguard korumalı IV kateterler (kanatsız)
Ultrason kontrast mikro kabarcıklarıLantheus Medical ImagingDE4, DE16DEFINITY (Perflutren Lipid Mikroküre)
Ultrason jeliAquasonichttps://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P		Ultrason Jeli Aquasonic 100 İletim 1 Litre Sıkma Şişesi
Kanatlı infüzyon setleri, 22ga.Fisher Healthcare22-258087Terumo Surflo Kanatlı İnfüzyon Setleri
motor kontrol yazılımıN/AN/AVelmex motor kontrol cihazı çalışma zamanı ortamını kontrol etmek için LabView'da yazılmış özel yazılım
motor kontrol yazılımı NationalInstrumentsLabView çalışma zamanı motoru sürümü 2017 veya daha iyisihttps://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html
3 eksenli Lineer kademeli aktüatör (XYZ konumlandırıcı)Velmex
cıvatalarVelmexMB-1BiSlide Cıvata 1/4-20x3/4" Soket kapaklı vida (10 paket), Adet: 3
motor kontrolörüVelmexVXM-3Kontrol, 3 eksen programlanabilir step motor kontrolü, Adet: 1
montaj kelepçesiVelmexMC-2Kelepçe, 2 delikli BiSlide, Adet:6
montaj kelepçesiVelmexMC-2Kelepçe, 2 delikli BiSlide, Adet:2
usb'den seri dönüştürücüyeVelmexVXM-USB-RS232USB'den RS232'ye Seri İletişim Kablosu 10ft, Adet:1
x ekseni doğrusal kademeVelmexMN10-0100-M02-21BiSlide, hareket=10 inç, 2 mm/dev, limitler, NEMA 23, Adet:1
x ekseni step motorVelmexPK266-03A-P1Vexta Tip 23T2, Tek Milli Step Motor, Adet:1
y ekseni lineer kademeVelmexMN10-0100-M02-21BiSlide, hareket=10 inç, 2 mm/dev, limitler, NEMA 23, Adet:1
y ekseni step motorVelmexPK266-03A-P1Vexta Tip 23T2, Tek Milli Step Motor, Adet:1
z ekseni damperiVelmexD6CL-6.3FD6CL Damper Motor, Adet:1
z ekseni doğrusal kademeVelmexMN10-0100-M02-21BiSlide, hareket=10 inç, 2 mm/dev, limitler, NEMA 23, Adet:1
z ekseni step motorVelmexPK266-03B-P2Vexta Tip 23T2, Çift Milli Step Motor, Adet:1
3D yazdırılabilir dosya
Daldırma dönüştürücü montajı ve işaretçihttps://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq
Stereotaksik çerçevehttps://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH
Stereotaksik çerçeve tutucu
https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX 9.4T küçük çaplı hayvan MRIBruker BrukerBioSpec 94/20ParaVision sürüm 5.1
AAV9-hsyn-GFPAddgene
Krem saç çıkarıcıChurch & DwightNair krem
gadobutrol MR kontrast maddeBayerGadavist (Gadobutrol, 1mM/mL)
Stereotaktik çerçeveÇalmak# 51500MRI uyumlu değil
anahtar teslimi FUS dağıtım cihazıFUS InstrumentsRK-300kemirgenler için kullanıma hazır MRI uyumlu FUS
Tip 23 Çift Milli Step için

Kaynaklar

  1. Markou, A., Chiamulera, C., Geyer, M. A., Tricklebank, M., Steckler, T. Removing obstacles in neuroscience drug discovery: the future path for animal models. Neuropsychopharmacology. 34 (1), 74-89 (2009).
  2. Schoepp, D. D. Where will new neuroscience therapies come from. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (10), 715-716 (2011).
  3. Insel, T. R., Landis, S. C. Twenty-five years of progress: the view from NIMH and NINDS. Neuron. 80 (3), 561-567 (2013).
  4. Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
  5. Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (1), 3-14 (2005).
  6. Millan, M. J., Goodwin, G. M., Meyer-Lindenberg, A., Ove Ögren, S. Learning from the past and looking to the future: Emerging perspectives for improving the treatment of psychiatric disorders. European Neuropsychopharmacology. 25 (5), 599-656 (2015).
  7. Correll, C. U., Carlson, H. E. Endocrine and metabolic adverse effects of psychotropic medications in children and adolescents. Journal of the American Academy of Child and Adolescent Psychiatry. 45 (7), 771-791 (2006).
  8. Girgis, R. R., Javitch, J. A., Lieberman, J. A. Antipsychotic drug mechanisms: links between therapeutic effects, metabolic side effects and the insulin signaling pathway. Molecular Psychiatry. 13 (10), 918-929 (2008).
  9. Patel, M. M., Goyal, B. R., Bhadada, S. V., Bhatt, J. S., Amin, A. F. Getting into the brain: approaches to enhance brain drug delivery. CNS Drugs. 23 (1), 35-58 (2009).
  10. McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. Journal of Neuroimmunology. 194 (1-2), 27-33 (2008).
  11. Thanou, M., Gedroyc, W. MRI-Guided Focused Ultrasound as a New Method of Drug Delivery. Journal of drug delivery. 2013, 616197(2013).
  12. Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4 (4), 519-526 (2013).
  13. Burgess, A., Shah, K., Hough, O., Hynynen, K. Focused ultrasound-mediated drug delivery through the blood-brain barrier. Expert Review of Neurotherapeutics. 15 (5), 477-491 (2015).
  14. Shin, J., et al. Focused ultrasound-mediated noninvasive blood-brain barrier modulation: preclinical examination of efficacy and safety in various sonication parameters. Neurosurgical Focus. 44 (2), 15(2018).
  15. Bing, C., et al. Characterization of different bubble formulations for blood-brain barrier opening using a focused ultrasound system with acoustic feedback control. Scientific Reports. 8 (1), 7986(2018).
  16. Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
  17. Baseri, B., et al. Activation of signaling pathways following localized delivery of systemically administered neurotrophic factors across the blood-brain barrier using focused ultrasound and microbubbles. Physics in Medicine and Biology. 57 (7), 65-81 (2012).
  18. Rodríguez-Frutos, B., et al. Enhanced brain-derived neurotrophic factor delivery by ultrasound and microbubbles promotes white matter repair after stroke. Biomaterials. 100, 41-52 (2016).
  19. Karakatsani, M. E., et al. Amelioration of the nigrostriatal pathway facilitated by ultrasound-mediated neurotrophic delivery in early Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 303, 289-301 (2019).
  20. Lin, C. -Y., et al. Non-invasive, neuron-specific gene therapy by focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening in Parkinson's disease mouse model. Journal of Controlled Release. 235, 72-81 (2016).
  21. Long, L., et al. Treatment of Parkinson's disease in rats by Nrf2 transfection using MRI-guided focused ultrasound delivery of nanomicrobubbles. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2016).
  22. Fan, C. -H., Lin, C. -Y., Liu, H. -L., Yeh, C. -K. Ultrasound targeted CNS gene delivery for Parkinson’s disease treatment. Journal of Controlled Release. 261, 246-262 (2017).
  23. Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Targeted delivery of antibodies through the blood-brain barrier by MRI-guided focused ultrasound. Biochemical and Biophysical Research Communications. 340 (4), 1085-1090 (2006).
  24. Todd, N., et al. Modulation of brain function by targeted delivery of GABA through the disrupted blood-brain barrier. Neuroimage. 189, 267-275 (2019).
  25. Nance, E., et al. Non-invasive delivery of stealth, brain-penetrating nanoparticles across the blood-brain barrier using MRI-guided focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 189, 123-132 (2014).
  26. Mulik, R. S., et al. Localized delivery of low-density lipoprotein docosahexaenoic acid nanoparticles to the rat brain using focused ultrasound. Biomaterials. 83, 257-268 (2016).
  27. Lin, T., et al. Blood-Brain-Barrier-Penetrating Albumin Nanoparticles for Biomimetic Drug Delivery via Albumin-Binding Protein Pathways for Antiglioma Therapy. ACS Nano. 10 (11), 9999-10012 (2016).
  28. Timbie, K. F., et al. MR image-guided delivery of cisplatin-loaded brain-penetrating nanoparticles to invasive glioma with focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 263, 120-131 (2017).
  29. Fan, C. -H., et al. SPIO-conjugated, doxorubicin-loaded microbubbles for concurrent MRI and focused-ultrasound enhanced brain-tumor drug delivery. Biomaterials. 34 (14), 3706-3715 (2013).
  30. Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9 (1), 321(2019).
  31. Chen, K. -T., Wei, K. -C., Liu, H. -L. Theranostic Strategy of Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for CNS Disease Treatment. Frontiers in Pharmacology. 10, 86(2019).
  32. Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer’s disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336(2018).
  33. Stewart, K., Schroeder, V. Compound Administration I. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10198/compound-administration-i (2020).
  34. Liu, H. -L., et al. Magnetic resonance imaging enhanced by superparamagnetic iron oxide particles: usefulness for distinguishing between focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption and brain hemorrhage. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 29 (1), 31-38 (2009).
  35. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880(2008).
  36. Marty, B., et al. Dynamic study of blood-brain barrier closure after its disruption using ultrasound: a quantitative analysis. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (10), 1948-1958 (2012).
  37. Alonso, A., Reinz, E., Fatar, M., Hennerici, M. G., Meairs, S. Clearance of albumin following ultrasound-induced blood-brain barrier opening is mediated by glial but not neuronal cells. Brain Research. 1411, 9-16 (2011).
  38. McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-brain barrier disruption and vascular damage induced by ultrasound bursts combined with microbubbles can be influenced by choice of anesthesia protocol. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (8), 1259-1270 (2011).
  39. McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. The Effects of Oxygen on Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Disruption in Mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (2), 469-475 (2017).
  40. O'Reilly, M. A., Muller, A., Hynynen, K. Ultrasound insertion loss of rat parietal bone appears to be proportional to animal mass at submegahertz frequencies. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (11), 1930-1937 (2011).
  41. Abrahao, A., et al. First-in-human trial of blood-brain barrier opening in amyotrophic lateral sclerosis using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 10 (1), 4373(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Mikrokabarc k nf zyonuEvans Blue BoyasGadobutrol Kontrast MaddeMRI K lavuzlu uStereotaktik er eveKuyruk Ven KateteriUltrason JeliSu Banyosu
Bir Sıçan Modelinde Odaklanmış Ultrason Kullanarak Konuma Özgü Kan Beyin Bariyeri Açılışına Tezgah Üstü Yaklaşım
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.