Yöntem makalesi

Tiobarbitürik Asit Reaktif Maddeler Tahlil kullanılarak Biyolojik Örneklerde Oksidatif Stresin Değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/61122

⸱

12 Mayıs 2020

 , 
1School of Molecular Sciences, The Biodesign Institute - Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tiyorbitürik asit reaktif madde tahlilinin amacı, 532 nm'de görünür dalga boyu spektrofotometrisi kullanarak, öncelikle malondialdehit olmak üzere lipid peroksidasyon ürünlerinin üretimini ölçerek biyolojik numunelerdeki oksidatif stresi değerlendirmektir. Burada açıklanan yöntem insan serumu, hücre lysates ve düşük yoğunluklu lipoproteinlere uygulanabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sınırlı analitik özgüllüğüne ve sağlamlığına rağmen, tiyobakroturik asit reaktif maddeleri (TBARS) tahlili, biyolojik sıvılarda lipid peroksidasyonunun jenerik ölçümü olarak yaygın olarak kullanılmıştır. Genellikle, numunenin düzgün bir şekilde ele alınması ve depolanmış olması koşuluyla, biyolojik bir numune içindeki oksidatif stres seviyelerinin iyi bir göstergesi olarak kabul edilir. Test, lipid peroksidasyon ürünlerinin, özellikle malondialdehitin (MDA), TBARS adı verilen MDA-TBA2 adducts oluşumuna yol açan tiyorbitürik asit (TBA) ile reaksiyonunu içerir. TBARS, spektrofotometrik olarak 532 nm'de ölçülebilen kırmızı-pembe bir renk verir. TBARS tahlili asidik koşullar altında (pH = 4) ve 95 °C'de gerçekleştirilir. Saf MDA kararsızdır, ancak bu koşullar, bu yöntemde analitik standart olarak kullanılan MDA bis'ten (dimetil asetal) MDA'nın serbest bırakılmasına izin verir. TBARS tahlil, yaklaşık 2 saat içinde tamamlanabilen basit bir yöntemdir. Test reaktiflerinin hazırlanması burada ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bütçe bilincine sahip araştırmacılar, bu reaktifleri yalnızca tek bir standart eğrinin inşasına izin veren pahalı bir TBARS test kiti satın almak yerine düşük maliyetle birden fazla deney için kullanabilirler (ve bu nedenle yalnızca bir deney için kullanılabilir). Bu TBARS testinin uygulanabilirliği insan serumunda, düşük yoğunluklu lipoproteinlerde ve hücre lysates'lerinde gösterilmiştir. Test tutarlı ve tekrarlanabilir ve 1.1 μM algılama sınırlarına ulaşılabilir. Spektrofotometrik TBARS testinin kullanımı ve yorumlanması için öneriler sunulmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipid peroksidasyonu, reaktif oksijen türleri ve reaktif azot türleri gibi serbest radikallerin lipitlerdeki karbon-karbon çift bağlarına saldırdığı, bir hidrojenin karbondan soyutlanması ve bir oksijen molekülünün yerleştirilmesini içeren bir süreçtir. Bu işlem, birincil ürünler olarak lipid peroksil radikalleri ve hidroperoksitlerin yanı sıra malondialdehit (MDA) ve baskın ikincil ürünler olarak 4-hidroksinononal dahil olmak üzere karmaşık ürünlerin bir karışımına yol açar1.

MDA, tiaobarbitürik asit (TBA) ile olan facile reaksiyonu nedeniyle lipid peroksidasyonunun bir göstergesi olarak biyomedikal araştırmalarda y....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan serum örnekleri, IRB onayı altında ve Helsinki Bildirgesi'nde ifade edilen ilkelere göre rıza gösteren gönüllülerden elde edilmiştir. Numuneler analitik laboratuvara transferden önce kodlandı ve kimliksiz bırakıldı.

1. Numune hazırlama

  1. HepG2 hücreli lysates
    1. %10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 14 mL EMEM ortamlı 16 T75 şişede şişe başına yaklaşık 10 x 106 HepG2 hücresi tohum ve 2 gün boyunca hücre yetiştirin.
    2. RIPA tamponu hazırlayın: 50 mL'lik bir tüpte, 1,5 mL 5 M NaCl, 2,5 mL 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 μL NP-40 reaktif ekleyin, ardından di suyu ile son hacmi 50 mL'y....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Asidik koşullar altında (pH = 4) ve 95 °C'de malondialdehit (MDA) bis (dimetil asetal) MDA23 verir. MDA ve yakından ilişkili kimyasal konjenerler, kırmızı-pembe bir renk veren ve 532 nm'de emilme φmax'a sahip olan tiyobakrbitürik asit reaktif maddeler (TBARS) adı verilen bileşikler üretmek için iki tiyorbitürik asit (TBA) molekülü ile reaksiyona sahiptir (Şekil 1, Şekil 2). Standart olarak MDA bis (dimetil asetal) kullanılarak,.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sınırlamalarına rağmen1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 ve laboratuvarlar arasında karşılaştırmaya uygunluk eksikliği, TBARS tahlil en

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak rakip finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada bildirilen araştırma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından ödül no altında desteklendi. R33 CA217702 ve Öğrenci Gelişimini En Üst Düzeye Çıkarma Girişimi (IMSD) programı. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitülerinin resmi görüşünü temsil etmek zorunda değildir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1x Steril PBS pH 7.4 1 LVWR, PA--262hücre lizis reaktifi
50 mL kendi kendine duran santrifüj tüpüCorning, NYCLS430897Genel malzeme
96 kuyulu plaka, İşlenmemiş, şeffaf, kapaklı, Steril olmayanThermo Fisher Scientific, MA280895Absorbansı ölçmek için
Amicon Ultra-0.5 100 kD santrifüj spin filtre cihazıFisher Scientific, NHCamLDL arıtma
KapaklarıTBARS testi içinThermo Fisher Scientific, MA14-930-15D
Bakır II KlorürSIGMA, MO222011-250Goksidasyonu indüklemek için
Kültür tüpleri, Tek Kullanımlık, Vidalı Kapaklı, Borosilikat Cam (13 x 100 mm)VWR,TBARS testi için53283-800
Eagle's Minimum Esansiyel Ortam (EMEM)ATCC, VAHB-8065HepG2 hücre ortamı
Eppendorf Güvenli Kilit Tüpleri, 1.5 mLeppendorf, NY22363204Genel malzeme
Eppendorf Güvenli Kilit Tüpleri, 2.0 mLGenesee Sceitific, CA22363352Genel malzeme
Fetal Sığır Serumu ABD KaynağıOmega Scientific, CAkültürü içinFB-11
Buzul Asetik AsitSIGMA, MO27225-1L-RTBARS Reaktif
Halt Proteaz İnhibitörü Kokteyli (100x)Thermo Scientific, MA87786hücre lizis reaktifi
HEPESSIGMA, MOH3375-250GLDL çözücü
HepG2 HücreleriATCC, VAHB-8065Biyolojik matris prototipi
Hidroklorik asit (HCl)Fisher Scientific, NHA144-212hücre lizis reaktifi
Legend Micro 17 SantrifüjThermo Scientific, MA75002431Genel malzeme
Düşük Yoğunluklu Lipoprotein, İnsan PlazmasıAtina Araştırma ve Teknoloji, GA12-16-120412Biyolojik matris prototipi
Manyetik Karıştırma Çubukları, Sekizgen 6 ÇeşitVWR, PA58948-025Genel malzeme
Malondialdehit bis (dimetil asetal)SIGMA, MO8207560250TBARS Standart
Multiskan Go Mikroplaka SpektrofotometresiFisher Scientific, NH51119200Absorbansı ölçmek için
NP-40EMD Millipore Corp, MA492016-100MLhücre lizis reaktifi
Sodyum KlorürSIGMA, MOS7653-1KGhücre lizis reaktifi
Sodyum dodesil sülfat (SDS)SIGMA, MO436143-100GTBARS Reaktifi
Sodyum hidroksitSIGMA, MO367176-2.5KGTBARS Reaktifi
SpeedVac KonsantratörThermo Scientific, MASC250EXPiçin konsantre hücre lizatları
T-75 Şişesi, Doku Kültürü Tedavi Edilmiş, 250 mL, filtre kapaklı,ABD Bilimsel, FL658175hücre kültürü
Tiyobarbitürik AsitSIGMA, MOT5500-100GTBARS Reaktifi
TRIS bazlıFluka, GA93362hücre lizis reaktifi
Tripsin (1x)VWR, PA16777-166HepG2 hücrelerini ayırmak için
101642 tüpler için UFC510024 PA Hücre

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
  2. Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Thiobarbituric Acid Reactive SubstancesTBARS AssayLipid PeroxidationOxidative StressMalondialdehydeSpectrophotometric AnalysisBiological SamplesStandard Curve PreparationHeating Block IncubationAbsorbance Measurement

İlgili makaleler