Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo) Kullanılarak Fare Kök Hücre Türevi Nöronlarda Protein-DNA Etkileşimlerinin Yüksek Çözünürlüklü Haritalanması

Summary

Genom genelinde protein bağlayıcı yerlerin kesin olarak belirlenmesi gen düzenlemesini anlamak için önemlidir. Burada kromatin-immünprecipitated DNA'yı exonuclease sindirimi (ChIP-exo) ve ardından yüksek verimli dizilim ile tedavi eden bir genomik haritalama yöntemini açıklıyoruz. Bu yöntem, memeli nöronlarında yakın baz çifti haritalama çözünürlüğü ve yüksek sinyal-gürültü oranı ile protein-DNA etkileşimlerini tespit eder.

Abstract

Genom üzerindeki spesifik protein-DNA etkileşimlerinin tanımlanması gen düzenlemesini anlamak için önemlidir. Kromatin immünorektasyon, yüksek verimli dizileme (ChIP-seq) ile birleştiğinde, DNA bağlayıcı proteinlerin genom çapındaki bağlayıcı konumlarını tanımlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, ChIP-seq yöntemi, sonicated DNA parçalarının ve spesifik olmayan arka plan DNA'larının uzunluğundaki heterojenliği ile sınırlıdır ve bu da düşük haritalama çözünürlüğü ve DNA bağlayıcı bölgelerde belirsizlik ile sonuçlanır. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, ChIP'nin exonuclease sindirimi (ChIP-exo) ile kombinasyonu, heterojen olarak boyutlandırılmış immün önyüklenmiş DNA'yı protein-DNA çapraz bağlantı bölgesine kırpmak için 5 ila 3' exonuclease sindirimini kullanır. Exonuclease tedavisi spesifik olmayan arka plan DNA'larını da ortadan kaldırır. Kütüphane tarafından hazırlanan ve exonuclease sindirilen DNA, yüksek verimli sıralama için gönderilebilir. ChIP-exo yöntemi, daha fazla algılama hassasiyeti ve azaltılmış arka plan sinyali ile neredeyse taban çifti eşleme çözünürlüğü sağlar. Memeli hücreleri ve yeni nesil dizileme için optimize edilmiş bir ChIP-exo protokolü aşağıda açıklanmıştır.

Introduction

Protein-DNA etkileşimlerinin yerleri gen düzenleme mekanizmaları hakkında fikir sağlar. Kromatin immünorepitasyonu, yüksek verimli dizileme (ChIP-seq) ile birleştiğinde, canlı hücrelerde genom çapındaki protein-DNA etkileşimlerini incelemek için on yıldır^1,2. Bununla birlikte, ChIP-seq yöntemi, düşük haritalama çözünürlüğüne, yanlış pozitiflere, cevapsız çağrılara ve spesifik olmayan arka plan sinyaline yol açan DNA parçalanması ve ilişkisiz DNA kirlenmesinde heterojenlik ile sınırlıdır. ChIP'nin exonuclease sindirimi (ChIP-exo) ile kombinasyonu, ChIP DNA'sını protein-DNA çapraz bağlantı noktalarına kırparak, taban çifti çözünürlüğü ve düşük arka plan sinyali 3 ,^4,5sağlayarak ChIP-seq yönteminde gelişir. ChIP-exo tarafından sağlanan büyük ölçüde geliştirilmiş haritalama çözünürlüğü ve düşük arka plan, genom genelinde doğru ve kapsamlı protein-DNA bağlama konumlarının belirlenmesini sağlar. ChIP-exo, fonksiyonel olarak farklı DNA bağlayıcı motifleri, transkripsiyon faktörleri (TF) arasındaki işbirliği etkileşimlerini ve belirli bir genomik bağlama konumundaki çoklu protein-DNA çapraz bağlantı alanlarını ortaya çıkarabilir, diğer genomik haritalama^{yöntemleriyle}tespit edilemez 3^,4,6,7.

ChIP-exo başlangıçta tomurcuklanan mayada TF'lerin diziye özgü DNA bağlamasını incelemek, transkripsiyon öncesi başlatma kompleksinin kesin organizasyonunu ve genom⁴,^8,9boyunca bireysel histonların nükleozomal yapısını incelemek için kullanılmıştır. 2011 yılında piyasaya sürülmesinden bu yana⁴, ChIP-exo, bakteriler, fareler ve insan hücreleri 7 , 10 , 11 ,^{12,13,14,15,16,17}dahil olmak üzere diğer birçok organizmada başarıyla kullanılmıştır. 2016 yılında Rhee ve ark.^14, başka bir programlama TF Isl1 ile heterodimer kompleksi oluşturan TF Lhx3 programlamasının küçültülmesi sonrasında nöronal gen ekspresyonunun nasıl sürdürüldüğünü anlamak için ilk kez memeli nöronlarında ChIP-exo kullandı. Bu çalışma, Lhx3'ün yokluğunda, Isl1'in nöronal efektör genlerin gen ekspresyonunun sürdürülmesi için Onecut1 TF'ye bağlı yeni nöronal arttırıcılara işe alındığını göstermiştir. Bu çalışmada ChIP-exo, birden fazla TF'nin hücre tiplerini ve hücre aşamasına özgü DNA düzenleyici elementleri neredeyse nükleotid haritalama çözünürlüğünde kombinatoryal bir şekilde nasıl dinamik olarak tanıdığını ortaya koydu. Diğer çalışmalar ayrıca diğer memeli hücre hatlarındaki proteinler ve DNA arasındaki etkileşimi anlamak için ChIP-exo yöntemini kullandı. Han ve ark.^7, ChIP-exo kullanarak fare eritroid hücrelerinde GATA1 ve TAL1 TF'lerin genom çapındaki organizasyonunu incelemek için ChIP-exo'yu kullandı. Bu çalışma, TAL1'in eritroid farklılaşması boyunca GATA1 ile protein-protein etkileşimleri yoluyla dolaylı olarak değil, doğrudan DNA'ya işe alındığı bulunmuştur. Son çalışmalar ayrıca, insan hücre hatlarındaki epigenomik ve transkripsiyonel mekanizmaları incelemek için CTCF, RNA Polymerase II ve histone izlerinin genom çapındaki bağlama konumlarının profilini çıkarmak için ChIP-exo'yu kullanmıştır^18,19.

ChIP-exo protokolünün çeşitli sürümleri vardır^3,5,20. Ancak, bu ChIP-exo protokollerini, yeni nesil sıralama kütüphanesi hazırlığına aşina olmayan araştırmalar için takip etmek zordur. ChIP-exo protokolünün mükemmel bir sürümü, takip edilmesi kolay talimatlar ve bir video²¹ile yayınlandı, ancak tamamlanması için önemli miktarda zaman gerektiren birçok enzymatic adım içeriyordu. Burada chip-exo protokolünün yeni bir sürümünü bildiriyoruz azaltılmış enzymatic adımlar ve kuluçka süreleri ve her enzymatic adım²¹için açıklamalar . Uç onarımı ve dA-tailing reaksiyonları, uç hazırlık enzimi kullanılarak tek bir adımda birleştirilir. Dizin ve evrensel bağdaştırıcı ligasyon adımları için kuluçka süreleri, ligasyon arttırıcı kullanılarak 2 h'den 15 dakikaya düşürülür. Önceki ChIP-exo protokolünde açıklanan dizin bağdaştırıcısı ligasyon adımından sonraki kinaz reaksiyonu kaldırılır. Bunun yerine, lambda exonuclease sindirim adımı için kullanılacak olan indeks adaptörünün 5' uçlarından birine(Tablo 1)oligo DNA sentezi sırasında bir fosfat grubu eklenir. Önceki ChIP-exo protokolü, tek iplikli DNA kirleticilerini ortadan kaldırmak için RecJ_f exonuclease sindirimi kullanırken, bu sindirim adımı chIP-exo kütüphanesinin kalitesi için kritik olmadığı için burada kaldırılır. Ek olarak, ChIP işleminden sonra ters çapraz bağlı DNA'yı arındırmak için fenol:kloroform:izoamil alkol (PCIA) ekstraksiyon yöntemi yerine manyetik boncuk temizleme yöntemi kullanılır. Bu, DNA ekstraksiyonunun kuluçka süresini azaltır. Daha da önemlisi, dizin bağdaştırıcısı ligasyonu sırasında oluşan bağdaştırıcı solukluklarının çoğunu kaldırır ve bu da ligasyon aracılı PCR'nin verimliliğini etkileyebilir.

Burada sunulan ChIP-exo protokolü, fare embriyonik sapı (ES) hücrelerinden farklılaştırılmış memeli nöronlarında kesin protein-DNA etkileşimlerinin tespiti için optimize edilmiştir. Kısaca, hasat edilen ve çapraz bağlı nöronal hücreler, kromatin sonikasyona maruz kalmasını sağlamak için yutulur, daha sonra uygun boyutta DNA parçaları elde edilecek şekilde sonicated (Şekil 1). Antikor kaplı boncuklar daha sonra parçalanmış, çözünür kromatinleri ilgi proteinine seçici olarak immün önseçimli hale getirmek için kullanılır. İmmün olarak kesinleşmemiş DNA hala boncuklardayken, son onarım, dizileme adaptörlerinin ligasyonu, dolgu reaksiyonu ve 5' ila 3' lambda exonuclease sindirim adımları gerçekleştirilir. Exonuclease sindirim adımı, ChIP-exo'ya ultra yüksek çözünürlüğünü ve yüksek sinyal-gürültü oranını veren şeydir. Lambda exonuclease, immün önyüklenmiş DNA'yı çapraz bağlama bölgesinden birkaç baz çifti (bp) keser, böylece kontamine DNA'nın bozulmasına neden olur. Exonuclease ile tedavi edilen ChIP DNA'sı antikor kaplı boncuklardan elde edilir, protein-DNA çapraz bağlantıları tersine çevrilir ve proteinler bozulur. DNA çıkarılır ve tek iplikli ChIP DNA'sına denatüre edilir, ardından çift iplikli DNA (dsDNA) yapmak için astar tavlama ve uzatma yapılır. Daha sonra, evrensel bir bağdaştırıcının exonuclease ile işlenmiş uçlara ligasyonu gerçekleştirilir. Elde edilen DNA saflaştırılır, daha sonra PCR yükseltilir, jel arındırılır ve yeni nesil sıralamaya tabi tutulur.

ChIP-exo protokolü ChIP-seq protokolünden daha uzundur, ancak teknik olarak çok zor değildir. Başarılı bir şekilde bağışıklık sistemi baskılanmış herhangi bir ChIP DNA'sı, birkaç ek enzymatik adımla ChIP-exo'ya tabi tutulabilir. ChIP-exo'nun ultra yüksek haritalama çözünürlüğü, azaltılmış arka plan sinyali ve genomik bağlama alanlarıyla ilgili yanlış pozitif ve negatiflerin azalması gibi önemli avantajları zaman maliyetinden daha ağır basmaktadır.

Protocol

NOT: Tamponlar ve reaksiyon ana karışımları yapmak için otomatik kapatılmış damıtılmış ve deiyonize su (ddH₂O) önerilir. Bölüm 1−4 hücre lizizini ve sonikasyonu, bölüm 5−7 kromatin immün özürlülüğü (ChIP) tanımlar, bölüm 8−11 boncuklar üzerindeki enzimatik reaksiyonları açıklar, bölüm 12 ve 13 ChIP elution ve DNA saflaştırmayı açıklar ve bölüm 14−19 kütüphane hazırlığını tanımlar.

1. Hücrelerin toplanması ve çapraz bağlantısı

1. Fare ES hücrelerini postmitotik nöronlara ayırt ettikten sonra, hasat edilen hücrelere% 1'lik son konsantrasyona% 1 formaldehit ekleyin (v /v). Sallanan bir platformda (rocker, çalkalayıcı veya rotator) oda sıcaklığında (RT, 25 °C) 15 dakika boyunca kaya hücreleri.
   NOT: Çapraz bağlanacak hedef proteine bağlı olarak, daha az formaldehit çapraz bağlama (örneğin,%0,5'lik son konsantrasyon) veya disüksinidil glutarat (DSG) ile çift çapraz bağlama kullanılabilir.
2. Çapraz bağlama reaksiyonunu durdurmak için 150 mM'lik son konsantrasyona 2,5 M glisine ekleyin. RT'de sallanan bir platformda 5 dakika boyunca kaya hücreleri.
3. Çapraz bağlı hücreleri RT'de 15 mL konik tüplerde, 6 dakika boyunca 1.350 x g'da santrifüj edin. Çözeltiyi aspire edin, ardından hücreleri 5 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden biriktirin.
   NOT: Çapraz bağlı hücre peletleri sıvı azot ile flaş dondurma işleminden sonra -80 °C'de saklanabilir.

2. Hücre lizisi

NOT: Bu protokoldeki aşağıdaki adımlar, fare ES hücrelerinden ayırt edilen yaklaşık 2 x^{10 7} nöronal hücre içindir. Açık hücreleri kırmak için çeşitli deterjanlar içeren lizis tamponları kullanılacaktır. Kullanımdan hemen önce 50 mL tampona 50 μL 1000x komple proteaz inhibitörü (CPI) stoğu ekleyin.

1. Tablo 2'de açıklandığı gibi 1−3 lizis arabelleği hazırlayın.
2. Çapraz bağlı hücre peletlerini buz üzerinde çözün, daha sonra hücre peletlerini 3 mL lizis tamponunda 15 mL konik tüplerde iyice yeniden sunun. Sallanan bir platformda 15 dakika boyunca 4 °C'de kaya. 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.350 x g'da santrifüj ve aspirat süpernatant.
3. Peletlenmiş hücreleri 3 mL lizis tamponu 2'de iyice yeniden biriktirin. Sallanan bir platformda 10 dakika boyunca 4 °C'de kaya. 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.350 x g'da santrifüj ve aspirat süpernatant.
4. Her pelete 1 mL lizis tamponu 3 ekleyin, sonra buzda tutun. Hemen sonication devam edin.

3. Sonicating kromatin

NOT: Çapraz bağlantı ters dönüşünü azaltmak için numuneleri bu sonication prosedürü sırasında buzda veya 4 °C'de tutun.

1. Steril bir spatula kullanarak, 15 mL polistiren tüplerde 0,2 mL mezuniyet işaretine kadar sonikasyon boncukları (Malzeme Masası)ekleyin. Kuru noktalar görünmeyene kadar sonication boncuklarını 600 μL 1x PBS'de girdapla yıkayın. Tüpleri 5 sn için 30 x g'da santrifüj edin ve 1x PBS'yi aspire edin.
   NOT: Polistiren tüplerde sonication polipropilen tüplerde sonication daha verimlidir. Daha az sayıda hücre (örneğin, <10⁶ hücreleri) sonikated ise, sonikasyon boncukları eklemeden 1,5 mL polistiren tüpler kullanın.
2. Nükleer lizaz tampon 3'ün 1 mL'sinde (adım 2.4'ten itibaren) nükleer lizazları iyice yeniden ıslatır, ardından sonikasyon boncukları içeren 15 mL polistiren tüplere aktarın. Polistiren tüpleri kısaca girdap.
3. Çapraz bağlı kromatin DNA'sını parçalamak için, optimize edilmiş sayıda döngü için 4 °C'de sonicate nükleer elyatlar, 30 W'ta güç genliği ve sonication döngüleri 30 s on/30 s kapalı olarak ayarlanır.
   NOT: Her hücre türü ve parti için sonication optimizasyonu en iyi ChIP-exo verim ile sonuçlanacaktır. 2 x 10⁷ fare nöronal hücresi için, belirtilen ayarlardaki 20−30 sonication döngüsü kromatin 100−500 bp aralığında parçalanacaktır.
4. Sonication tamamlandıktan sonra, her örnekten tüm supernatant (sonicated lysates), 1.5 mL tüplere aktarın. Her numuneye %1'lik son konsantrasyonda %10 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-yl)fenoksi]etanol) ekleyin. Pipetleme ile karıştırın.
5. Hücre kalıntılarını peletmek için, 4 °C'de 10 dakika boyunca 13.500 x g'da santrifüj örnekleri. Her numuneden tüm sonicated lysates (supernatant) yeni 1.5 mL tüplere aktarın.
6. Her örnekten 30 μL sonicated lysate alın (~3% sonicated lysate) ve sonication kontrol etmek için yeni 1.5 mL tüpler ekleyin. Kalan sonikatları antikor kaplı boncuklarla inkübasyona hazır olana kadar 4 °C'de saklayın.

4. Sonication kontrol

1. 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) 2 mL, 0,5 M EDTA 2 mL, %10 sodyum dodecyl sülfat (SDS) ve 6 mL otoklavlı ddH 2 O ekleyerek 20 mL_2xproteinaz K tamponu yapın. Bu arabelleğe TÜFE eklemeyin. RT'de 50 mL tüpte saklayın.
2. Protein-DNA çapraz bağlantısını tersine çevirmek için, proteinleri çıkararak, her örnekten 30 μL sonicated kromatin alın (adım 3.6'dan itibaren), 166 μL otomatik kapatılmış ddH₂O ekleyin, 200 μL 2x proteinaz K tamponu ve 4 μL 20 mg/mL proteinaz K. Örnekleri kısaca vorteks edin ve ardından 24 x g'da1−3 saat boyunca 65 °C'de kuluçkaya yatırın.
3. NOT: Sonicated lysates bir gecede 65 °C'de ters çapraz bağlanabilir.
4. PCIA (25:24:1) ve etanol çökeltim yöntemini aşağıdaki gibi kullanarak DNA çıkarın.
   DİkKAT: PCIA toksiktir. Standart kişisel koruyucu ekipmana (KKD) sahip bir duman kaputunun altında kullanın.
   1. 1,5 mL tüplerdeki her numuneye 400 μL PCIA ekleyin, girdabı maksimum hıza ayarlayın ve 20 s için girdap örnekleri ekleyin. RT'de 6 dakika boyunca 18.400 x g'da santrifüj. İki aşama gözlenecektir. Her numunenin üst sulu tabakasını (net faz) yeni 1,5 mL tüplere dikkatlice aktarın.
   2. 30 dakika boyunca 37 °C'de 1 μL 10 mg/mL RNase A. Kuluçka örnekleri ekleyin.
   3. Her numuneye 1 μL 20 mg/mL glikojen ekleyin, ardından 1 mL buz gibi % 100 etanol (-20 °C dondurucuda saklanır) ile çökelin. Kısa bir süre karıştırın, ardından örnekleri -80 °C dondurucuda 30 dakika ila 1 saat kuluçkaya yatırın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 18.400 x g'da santrifüj örnekleri ve% 100 etanol dikkatlice dökün.
   4. Peletleri 500 μL buz gibi % 70 etanol ile yıkayın (-20 °C dondurucuda saklanır). 4 °C'de 5 dakika boyunca 18.400 x g'da santrifüj. % 70 etanol dikkatlice dökün.
   5. Kalan etanol buharlaşana kadar numuneleri 50 °C'de 1,5 mL tüplerde kuluçkaya yatırın. DNA peletlerini 15 μL otoklavlı ddH₂O veya nükleaz içermeyen ddH 2 O'da yeniden_kullanır.
   6. Çıkarılan DNA örneklerini, DNA merdiveni ile birlikte 120−180 V'da %1,5 agarose jel ile inceleyin ve sonike DNA'nın boyutunu kontrol edin.

5. Boncuklu antikor inkübasyonu

NOT: Bu protokoldeki aşağıdaki adımlar, fare ES hücrelerinden ayırt edilen yaklaşık 2 x^{10 7} nöronal hücre içindir. Manyetik boncukları ChIP-exo protokolü sırasında herhangi bir noktada dondurmayın ve çözmeyin, çünkü boncuklar numunenin kirlenmesine neden olabilir veya antikorun performansı tehlikeye atılabilir.

1. Hücre lizisi ve sonikasyondan sonra, ChIP için Protein G manyetik boncukları (Malzeme Tablosu)hazırlayın, manyetik boncukları homojen olana kadar karıştırın, ardından 2 mL protein düşük bağlama tüplerine 25 μL manyetik boncuk ekleyin.
   NOT: Kullanılan manyetik boncukların türü antikorların türüne bağlı olacaktır.
2. Boncukları 1 mL engelleme çözeltisi ile yıkayın (Tablo 2), iyice karıştırın, ardından 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Hala manyetik bir raftayken, temizlendikten sonra üst üste bindirin.
3. Manyetik boncuklara 1 mL blokaj çözeltisi ekleyin. Sallanan bir platformda 4 °C'de 10 dakika boyunca kaya tüpleri. Kısa bir süre döndürün, ardından tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatant çıkarın.
4. 5.3. adımı iki kez daha yineleyin.
5. Manyetik boncuklara 500 μL blokaj çözeltisi ekleyin. Isl1'e (0.04 μg/μL, Malzeme Tablası)karşı antikorları kısaca döndürün, ardından blokaj çözeltisinde manyetik boncukları içeren karşılık gelen 2 mL protein düşük bağlama tüplerine 4 μg antikor ekleyin.
6. Antikor olmadan 5.5 adımını tekrarlayın (yani, ChIP için antikor kontrolü yoktur).
   NOT: Eklenecek antikor miktarı, antikorun kalitesi ve CHIP için kullanılan hücre sayısı göz önünde bulundurularak ampirik olarak belirlenebilir.
7. Sallanan bir platformda 6−24 saat boyunca 4 °C'de kaya örnekleri.

6. Kromatin immünprecipitasyon (ChIP)

1. Antikor kaplı boncukları 1 mL blokaj çözeltisi ile adım 5.8'den yıkayın. Numuneleri 5 dakika boyunca 4 °C'de sallanan bir platforma yerleştirin.
2. 6.1. adımı iki kez daha yineleyin.
3. Antikor kaplı boncukları 50 μL blokaj çözeltisinde yeniden depolar, ardından yeni 2 mL protein düşük bağlama tüplerine aktarın. Her ChIP örneği için, 2 mL protein düşük bağlama tüplerinde antikor kaplı boncuklara sonikatlı lysates (adım 3.6'dan ~ 1.0 mL) ekleyin.
4. Her numuneyi 4 °C'de bir gecede sallanan bir platformda kuluçkaya yatırın.

7. ChIP yıkamaları

NOT: ChIP yıkamaları sırasında protein-DNA çapraz bağlarını korumak için numuneleri buzda veya 4 °C'de tutun.

1. Tablo 3'teaçıklandığı gibi yüksek tuz yıkama tamponu, LiCl yıkama tamponu ve 10 mM Tris-HCl tamponu (pH 7.4) yapın. 4 °C'de 50 mL tüplerde saklayın. Kullanmadan hemen önce tüm tamponlara 50 μL 1000x CPI stok ekleyin.
2. Kapaklardan sıvı toplamak için örnekleri 2 mL protein düşük bağlama tüplerinde kısaca döndürün, ardından 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve bir pipetle süpernatant dikkatlice çıkarın.
3. ChIP yıkamalar için, her tüpe 1 mL lizis tamponu 3 (4 °C'de) ekleyin. 4 °C'de sallanan bir platformda 5 dakika karıştırın. Örnekleri kısaca döndürün, ardından 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatant'ı bir pipetle çıkarın.
4. Her tüpe 1 mL soğuk yüksek tuz yıkama tamponu ekleyin. 4 °C'de sallanan bir platformda 5 dakika karıştırın. Örnekleri kısaca döndürün, ardından 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatant'ı bir pipetle çıkarın.
5. Her tüpe 1 mL soğuk LiCl yıkama tamponu ekleyin. 4 °C'de sallanan bir platformda 5 dakika karıştırın. Örnekleri kısaca döndürün, ardından 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatant'ı bir pipetle çıkarın.
6. Her tüpe 1 mL soğuk 10 mM Tris-HCl tampon (pH 7.4) ekleyin. 4 °C'de sallanan bir platformda 5 dakika karıştırın. Örnekleri kısaca döndürün, ardından 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatant'ı bir pipetle çıkarın.
   NOT: Tris-HCl arabelleği (pH 7.4) yerine Tris-EDTA tamponu (pH 8.0) kullanılabilir.
7. 7.4−7.6 adımlarını üç kez tekrarlayın.
8. Numune boncuklarını 500 μL Tris-HCl tamponu (pH 7.4) ile taze 1,5 mL tüplere aktarın. Örnekleri kısaca döndürün, ardından 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatant'ı bir pipetle çıkarın.

8. Boncuklarda onarım ve dA-tailing reaksiyona son verin

NOT: Sonication genellikle kör olmayan uçlu dsDNA oluşturur. DA-tailing reaksiyonunun ardından indeks adaptörü ligasyon adımından önce künt uçlu DNA yapmak için bir son onarım reaksiyonı gereklidir. İndeks adaptörü DNA'sı ile yapışkan uç DNA ligasyonu için dATP, dA-tailing reaksiyon tarafından kör, dsDNA parçasının 3' ucuna eklenir. Son hazırlık reaksiyon karışımı dATP içerir.

1. ChIP yıkandıktan sonra, son onarım ve dA-tailing reaksiyonu için_1,5mL tüplerdeki numune boncuklarına 38 μL otomatik kapatılmış ddH 2 O ekleyin.
2. Her numuneye 5,6 μL uç hazırlık reaksiyon karışımı ve 2,4 μL uç hazırlık enzim karışımı(Malzeme Tablosu)ekleyin (toplam reaksiyon hacmi: 46 μL). Örnekleri 20 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatır.
3. Önceki ChIP yıkama adımları 7.4−7.6'da açıklandığı gibi boncukları yıkayın.

9. Boncuklarda dizin adaptörü ligasyonu

NOT: Dizin bağdaştırıcısı, yüksek verimli sıralamada birden çok örneği çoklamak için kullanılan belirli bir örneğe özgü 6−10 baz barkodlu diziye sahiptir. Dizin bağdaştırıcısı DNA dizileri Tablo 1'de açıklanmıştır.

1. İndeks adaptörü ligasyonu için, numune boncuklarına 27 μL soğuk 10 mM Tris-HCl tamponu (pH 7.4) ekleyin. Her örneğe 2 μL 15 μM indeks adaptörü, 0,5 μL ligasyon arttırıcı ve 15 μL bağ ana karışımı(Malzeme Tablosu)ekleyin (toplam reaksiyon hacmi: 44,5 μL).
2. Örnekleri 20 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatır. Boncukları 7.4−7.6 adımlarında açıklandığı gibi yıkayın.

10. Boncuklar üzerinde dolgu reaksiyonsu

NOT: Adaptör ligasyonundan sonra, adaptörün 5' ucu ile ChIP DNA'sının 3' ucu arasında fosfodiester bağı yoktur. Nick bir doldurma reaksiyon ile onarılabilir.

1. Numune boncuklarına 47 μL soğuk 10 mM Tris-HCl tampon (pH 7.4) ekleyin.
2. Dolgu reaksiyon karışımını(Tablo 4 ve Malzeme Tablosu)buz üzerinde yapın.
3. Her numuneye 11,1 μL dolgu karışımı ekleyin (toplam reaksiyon hacmi: 58,1 μL). Örnekleri 20 dakika boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatır. Boncukları 7.4−7.6 adımlarında açıklandığı gibi yıkayın.

11. Boncuklar üzerinde Lambda exonuclease sindirimi

1. Boncuklar üzerinde dolgu reaksiyonunun ardından, numune boncuklarına 50 μL soğuk otoklavlı ddH₂O ekleyin.
2. ChIP DNA'sını 5' ila 3' yönde sindirmek için, 6 μL 10x lambda exonuclease tamponu ve 2 μL 5 U/μL lambda exonuclease(Malzeme Tablosu, toplam reaksiyon hacmi: 58 μL) ekleyin. Örnekleri 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatır. Boncukları 7.4−7.6 adımlarında açıklandığı gibi yıkayın.

12. Elution ve ters çapraz bağlama

1. Tablo 5'teaçıklandığı gibi ChIP elution arabelleği yapın.
   NOT: CHIP elution arabelleğine CPI eklemeyin.
2. Boncuklardan ChIP örneklerini elüte etmek için, numuneleri 75 μL ChIP elution tamponunda yeniden ıslatın ve 65 °C'de 130 x g'da 15 dakika kuluçkaya yatırın.
3. Örneklere 2,5 μL 20 mg/mL proteinaz K (Malzeme Tablosu)ekleyin. Kısaca girdap, sonra örnekleri 65 ° C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.

13. DNA ekstraksiyonu

1. Numuneler 65 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatırıldıktan sonra, örnekleri kısaca döndürün, 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin, ardından süpernatantı her numuneden yeni 1,5 mL tüplere aktarın.
2. Örneklere 1 μL 10 mg/mL RNase A ekleyin. Kısaca girdap, sonra örnekleri 37 ° C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın. 100 μL'ye kadar hacme_{~25 μL}otomatik kapatılmış ddH 2 O ekleyin.
3. Manyetik boncuklar kullanarak DNA'yı arındırın (Malzeme Tablosu). 16 μL otoklavlı ddH₂O veya nükleaz içermeyen ddH₂O ile Elute DNA.

14. Denatüre, astar tavlama ve astar uzantısı

1. ChIP elution ve ters çapraz bağlamadan sonra, çıkarılan DNA örneklerinin 16 μL'lik kısmını adım 13.3'ten PCR tüplerine aktarın.
2. Buz üzerinde denatüre ve astar tavlama karışımı (Tablo 6 ve Malzeme Masası)yapın. Her numuneye 1,2 μL denatüre ve astar tavlama karışımı ekleyin (toplam reaksiyon hacmi: 17,2 μL). Şablon DNA'sına denature ve tavlama astarları için Tablo 6'da açıklanan programı kullanarak örnekleri çalıştırın.
3. Buz üzerinde astar uzatma karışımı(Tablo 7 ve Malzeme Masası)yapın.
4. Denatüre ve tavlama astarları programı tamamlandıktan sonra, numunelere 3 μL astar uzatma karışımı ekleyin (toplam reaksiyon hacmi: 20,2 μL). Tablo 7'de açıklanan astar uzantısı için programı kullanarak örnekleri çalıştırın.
5. Hemen dA-tailing reaksiyona geçin.

15. dA-tailing reaksiyon

NOT: Evrensel adaptör DNA'sı ile yapışkan uç DNA ligasyonu için dATP, dA-tailing reaksiyon tarafından 3' künt, dsDNA ucuna eklenir.

1. Buz üzerinde dA-tailing karışımı(Tablo 8 ve Malzeme Masası)yapın.
2. Her numuneye 4,1 μL dA-tailing karışımı ekleyin (toplam reaksiyon hacmi: 24,3 μL). Örnekleri dA-tailing için programı kullanarak çalıştırın (Tablo 8).
3. Hemen evrensel bağdaştırıcı ligasyonuna geçin.

16. Evrensel adaptör ligasyonu

NOT: Evrensel bağdaştırıcı, sıralama kimyası için DNA örneği tanıma için yüksek verimli sıralamaya özgü diziler içerir. Evrensel adaptör DNA dizileri Tablo 1'de açıklanmıştır.

1. dA-tailing reaksiyondan sonra, evrensel adaptör ligasyonu için evrensel adaptör ligasyon karışımını (Tablo 9 ve Malzeme Tablosu)yapın.
2. Her numuneye 21,5 μL ekleyin (toplam reaksiyon hacmi: 45,8 μL) ve örnekleri 20 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.

17. DNA temizliği

1. Manyetik boncuklar kullanarak DNA'yı arındırın (Malzeme Tablosu). 21 μL otoklavlı ddH₂O veya nükleaz içermeyen ddH₂O ile Elute DNA.
2. Numuneleri -20 °C'de ligasyon aracılı PCR (LM-PCR) ve PCR saflaştırması yapmaya hazır olana kadar saklayın.

18. Ligasyon aracılı PCR

NOT: LM-PCR astar dizileri Tablo 1'deaçıklanmıştır.

1. DNA temizliğinden sonra, buz üzerinde LM-PCR karışımı (Tablo 10 ve Malzeme Masası) yapın.
2. Her numuneye 29 μL LM-PCR karışımı ekleyin (toplam reaksiyon hacmi: 50 μL) ve LM-PCR programını kullanarak numuneleri çalıştırın(Tablo 10).
3. Pcr güçlendirilmiş DNA'nın jel saflaştırılmasına ve ardından yüksek verimli sıralama için DNA saflaştırmasına hemen devam edin.

19.LM-PCR güçlendirilmiş DNA'nın DNA p ürifikasyonu

1. LM-PCR güçlendirilmiş DNA örneklerini bir DNA merdiveni ile birlikte 120−180 V'te %1,5 agarose jel ve 200-400 bp bandlarda tüketimde çalıştırın.
2. Jel çıkarma kiti ( Malzeme Masası) kullanarak dna'yı ekscised jeldenarındırın.
3. DNA saflaştırma işleminden sonra, her ChIP-exo kütüphanesi örneğinin konsantrasyonuna(Malzeme Tablosu)bakın. Tek okumalı sıralama için yüksek aktarım hızı sıralaması için örnekler gönderin.
   NOT: Tek okumalı sıralama için tercih edilen okuma uzunluğu en az 35 bp'dir, bu da sıralama okumalarını fare veya insan hücrelerindeki referans genoma benzersiz olarak hizalamak için yeterlidir. Fare veya insan hücrelerindeki çoğu transkripsiyon faktörü için, ChIP-exo örneği başına 10−20 milyon okuma, genomik bağlayıcı konumlarını tanımlamak için yeterlidir. Memeli hücrelerindeki histone izleriyle zenginleştirilmiş genomik bölgeleri haritalamak için örnek başına en az 30 milyon okuma gereklidir.

Results

Şekil 2A, fare ES hücrelerinden ayırt edilen motor nöron hücrelerinin çeşitli döngülerle hücre lizisi ve sonication sonrası sonikasyon sonuçlarını göstermektedir. En uygun sonication döngüsü sayısı (örneğin, Şekil 2A'da 12döngü) 100−400 bp DNA parçalarında güçlü DNA yoğunluğu yarattı. Yüksek kaliteli ChIP-exo kütüphaneleri parçalanmış kromatin DNA'sının büyüklüğüne ve miktarına dayanmaktadır. Bu nedenle, ChIP-exo'ya başlamadan önce her hücre türü ve hücre grubu ...

Discussion

Bu protokolde ChIP ve ardından exonuclease sindirimi, memeli hücrelerindeki protein-DNA etkileşimlerinin ultra yüksek haritalama çözünürlüğünde tanımlanması için DNA kütüphaneleri elde etmek için kullanılır. Birçok değişken ChIP-exo deneyinin kalitesine katkıda bulunur. Kritik deneysel parametreler antikorların kalitesini, sonication optimizasyonunu ve LM-PCR döngülerinin sayısını içerir. Bu kritik deneysel parametreler aynı zamanda ChIP-exo deneylerini sınırlayabilir ve aşağıda tartışılacaktır.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agaroz, UltraPure	Invitrogen	16500	LM-PCR Amplifiye DNA'nın Sonikasyonunun (Bölüm 4.3.6) ve Jel Saflaştırılmasının Kontrol Edilmesi (Bölüm 19.1
) Albümin, Sığır Serumu (BSA), Proteaz İçermeyen, Isı Şoku İzolasyonu, Min. %98BioShop		ALB003
Isl1'e Karşı	Antikoru DSHB	39.3F7	Boncuklu antikor (Bölüm 5.6)
Bioruptor Pico& nbsp;	Diagenode	B01060010	Sonicating Chromatin (Bölüm 3.3)
Sığır serum albümini (BSA), Moleküler Biyoloji Sınıfı	New England BioLabs	B9000S	Boncuklar Üzerinde Doldurma Reaksiyonu (Bölüm 10.2) ve Denatürasyon, Primer Tavlama ve Primer Uzatma (Bölüm 14.2)
Santrifüj 5424 R	Eppendorf	5404000138	Sonikasyon Kromatini (Bölüm 3.5), Sonikasyonu Kontrol Etme (Bölüm 4.3.1, 4.3.3 ve 4.3.4)
Santrifüj 5804 R	Eppendorf	22623508	Hasat, çapraz bağlama ve dondurma hücreleri (Bölüm 1.3), Hücre lizisi (Bölüm 2.2 ve 2.3), Sonikasyon Kromatini (Bölüm 3.1)
cOmplete, Mini, EDTA içermeyen Proteaz İnhibitörü Kokteyli	Roche	4693159001	Proteinaz K tamponu ve ChIP Elüsyon tamponu hariç tüm tamponlara eklenir
dATP Çözeltisi	New England BioLabs	N0440S	dA-Kuyruk Reaksiyonu (Bölüm 15.1)
Deoksikolik Asit Sodyum Tuzu	Fisher scientific	BP349	Lizis Tamponu 3, Yüksek Tuz Yıkama Tamponu ve LiCl Yıkama Tamponu
dNTP Karışımı, Moleküler Biyoloji Sınıfı	Thermo Scientific	R0192	Boncuklar Üzerinde Doldurma Reaksiyonu (Bölüm 10.2) ve Denatüre Etme, Primer Tavlama ve Primer Uzatma (Bölüm 14.2)
DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x	Thermo Scientific	K1081	Ligasyon Aracılı PCR (Bölüm 18.1)
EDTA, 0.5 M, Steril Çözelti, pH 8.0	BioShop	EDT111	Lizis Tamponu 1-3, Sonikasyonun Kontrol Edilmesi (Bölüm 4.1), Yüksek Tuzlu Yıkama Tamponu, LiCl Yıkama Tamponu ve ChIP Elüsyon Tamponu
Etil Alkol Susuz,% 100	Ticari alkoller	P006EAAN	Sonikasyonun Kontrol Edilmesi (Bölüm 4.3.3)
Formaldehit, %36.5-38, %10-15 içerir metanol	Sigma	F8775	Hasat, çapraz bağlama ve dondurma hücreleri (Bölüm 1.1)
Gliserol, Reaktif Sınıfı, min %99,5BioShop		GLY002	Lizis Tamponu 1
Glisin, Biyoteknoloji Sınıfı, min. %99BioShop		GLN001	Hasat, çapraz bağlama ve dondurma hücreleri (Bölüm 1.2)
Glikojen, RNA Sınıfı	Thermo Scientific	R0551	Sonikasyonun Kontrol Edilmesi (Bölüm 4.3.3)
HEPES, 1 M Steril Filtreli Çözelti, pH 7.3	BioShop	HEP003	Lizis Tamponu 1, Yüksek Tuz Yıkama Tamponu
Klenow Parçası (3->5 ekzo-)	New England BioLabs	M0212S	dA-Kuyruk Reaksiyonu (Bölüm 15.1)
Lambda eksonükleaz	New England BioLabs	M0262S	Boncuklarda Lambda Eksonükleaz Sindirimi (Bölüm 11.2)
Ligaz Arttırıcı	New England BioLabs	E7645S	NEBNext Ultra II DNA Kütüphane Kiti. Boncuklarda İndeks Adaptör Ligasyonu (Bölüm 9.1) ve Evrensel Adaptör Ligasyonu (Bölüm 16.1)
Ligase Master Mix	New England BioLabs	E7645S	NEBNext Ultra II DNA Kütüphane Kiti. Boncuklar Üzerinde İndeks Adaptör Ligasyonu (Bölüm 9.1) ve Evrensel Adaptör Ligasyonu (Bölüm 16.1
)Lityum Klorür (LiCl), Reaktif sınıfı	Bioshop	LIT704	LiCl Yıkama Tamponu
ChIP için manyetik boncuklar (Dynabeads Protein G)	Dynabeads Protein G (ChIP için manyetik boncuklar)	Dynabeads Protein G (ChIP için manyetik boncuklar)	Boncuklarla antikor inkübasyonu (Bölüm 5)
DNA saflaştırması için manyetik boncuklar (AMPure XP Boncukları)	Beckman Coulter	A63880	DNA Ekstraksiyonu (Bölüm 13.3) ve DNA Temizleme (Bölüm 17.1)
Manyetik raf (DynaMag-2 Mıknatıs)	Invitrogen	12321D	Bölümlerde birçok adımda kullanılır: 5 - 11, 13
MinElute Jel Ekstraksiyon Kiti	Qiagen	28604	PCR Amplifiye DNA'nın Jel Saflaştırılması (Bölüm 19.2)
N-Lauroylsarcosine sodyum tuzu çözeltisi, %30 sulu çözelti, > %97,0 (HPLC)	Sigma	61747	Lizis Tamponu 3
Oktilfenol Etoksilat (IGEPAL CA630)	BioShop	NON999	Lizis Tamponu 1 ve LiCl Yıkama
Tamponu Fenol:Kloroform:İzoamil Alkol, Biyoteknoloji Sınıfı (25:24:1)	BioShop	PHE512	Sonikasyonu Kontrol Etme (Bölüm 4.3.1)
phi29 DNA Polimeraz	New England BioLabs	M0269L	Boncuklar Üzerinde Doldurma Reaksiyonu (Bölüm 10.2) ve Denatüre Etme, Astar Tavı ve Astar Uzatma (Bölüm 14.3 ve 14.4)
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS), 1x	Corning	21040CV	Hasat, çapraz bağlama ve dondurma hücreleri (Bölüm 1.3) ve Sonikasyon Kromatini (Bölüm 3.1), Boncuklarla antikor inküsyonu (Bölüm 5.1)
PowerPac Temel Güç Kaynağı	BioRad	1645050	Sonikasyonun Kontrol Edilmesi (Bölüm 4.3.6) ve LM-PCR Amplifiye DNA'nın Jel Saflaştırılması (Bölüm 19.1)
ProFlex PCR Sistemi	Uygulamalı Biyosistemler	ProFlex PCR Sistemi	Bölümlerde kullanılır: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 ve 18.2
protein LoBind tüpü, 2.0 mL	Eppendorf	22431102	Boncuklarla Antikor İnkübasyonu (Bölüm 5.2) ve Kromatin İmmünopresipitasyonu (Bölüm 6.3)
Proteinaz K Çözeltisi, RNA Dereceli	İnvitrojen	25530049	Sonikasyon Kontrol Edilmesi (Bölüm 4.2) ve Elüsyon ve Ters Çapraz Bağlama (Bölüm 12.3)
Qubit 4.0 Florometre	Invitrogen	Q33226	PCR Amplifiye DNA'nın Jel Saflaştırılması (Bölüm 19.3)
Quibit dsDNA BR testi kit	Invitrogen	Q32853	PCR Amplifiye DNA'nın Jel Saflaştırılması (Bölüm 19.3)
Rnaze A, Dnaze ve Proteaz içermeyen	Thermo Scientific	EN0531	Sonikasyonun Kontrol Edilmesi (Bölüm 4.3.2) ve DNA Ekstraksiyonu (Bölüm 13.2
) Sodyum klorür (NaCl), BioReagent	Sigma	S5886	Lizis Tamponu 1-3, Yüksek Tuz Yıkama Tamponu
Sodyum Dodesil Sülfat (SDS), Elektroforez Sınıfı	BioShop	SDS001	Sonikasyonu Kontrol Etme (Bölüm 4.1), Yüksek Tuz Yıkama Tamponu ve ChIP Elüsyon Tamponu
Sonikasyon boncukları ve 15 mL Bioruptor Tüpleri	Diagenode	C01020031	Sonikasyon Kromatini (Bölüm 3.1 ve 3.2)
ThermoMixer F1.5	Eppendorf	5384000020	Bölüm 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 ve 16.2
Trizma hidroklorür çözeltisi (Tris-HCl), BioPerformance Sertifikalı, 1 M, pH 7.4	Sigma	T2194	10 mM Tris-HCl Tampon
Trizma hidroklorür çözeltisi (Tris-HCl), BioPerformance Sertifikalı, 1 M, pH 8.0	Sigma	T2694	Lizis Tamponu 2, Lizis Tamponu 3, Sonikasyonu Kontrol Etme (Bölüm 4.1), LiCl Yıkama Tamponu ve ChIP Elüsyon Tamponu
Ultra II Uç Onarımı / dA-Kuyruk Modülü (24 rxn -> 120 rxn)	New England BioLabs	E7546S	Son Hazırlık Reaksiyonu karışımı ve Son Hazırlık Enzimi karışımı. Boncuklarda Son Onarım ve dA-Kuyruk Reaksiyonu (Bölüm 8.2)
VWR Mini Tüp Rocker, Değişken Hızlı	VWR	10159-752	Bölümlerde birçok adımda kullanılır: 1, 2, 5, 6 ve 7
2- [4- (2,4,4-trimetilpentan-2-il) fenoksi] etanol, Triton X-100, Reaktif Sınıfı	BioShop	TRX506	Lizis Tamponu 1, Sonikasyon Kromatini (Bölüm 3.4) ve Yüksek Tuz Yıkama Tamponu