Method Article

Nanoakışkan Teknoloji Kullanarak Tek ve Toplu C. elegans Örneklerinde Yüksek Verimli Nicel RT-PCR

DOI:

10.3791/61132

⸱

May 28th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Babraham Institute, 2Gurdon Institute, University of Cambridge, 3Department of Genetics, University of Cambridge, 4Wellcome Trust Genome Campus, Wellcome Trust Sanger Institute, 5Laboratory of Virology and Infectious Disease, The Rockefeller University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, tek veya toplu C. elegans örneklerinde gen ekspresyon seviyelerinin hızlı ve güvenilir bir şekilde belirlenmesi için yüksek aktarım hızı protokolü açıklanmıştır. Bu protokol RNA yalıtımı gerektirmez ve doğrudan örneklerden cDNA üretir. Yüksek verimli çok katlı nanoakışkan gerçek zamanlı qPCR platformları ile birlikte kullanılabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, caenorhabditis elegans için hızlı, sağlam ve son derece hassas olan yüksek verimli ters transkripsiyon nicel PCR (RT-qPCR) testini sürmektedir. Bu protokol, tek solucanlardan veya toplu örneklerden gen ekspresyonunun hassas ölçümlerini elde eder. Burada sunulan protokol, nanoakışkan rt-qPCR platformuna bağlı olarak tamamlayıcı DNA (cDNA) hazırlama için mevcut yöntemlerin yeni bir uyarlamasını sağlar. 'Worm-to-CT' adı verilen bu protokolün ilk bölümü, önceden mRNA izolasyonu gerek kalmadan doğrudan nematodlardan cDNA üretimine izin verir. 3,5 saat içinde 96 solucandan cDNA hazırlanmasına izin vererek deneysel verimi arttırır. Protokolün ikinci bölümü, cDNA'da yüksek verimli RT-qPCR çalıştırmak için mevcut nanoakışkan teknolojiyi kullanır. Bu makale iki farklı nanoakışkan çipi değerlendirir: ilki 96 örnek ve 96 hedef çalıştırır ve yaklaşık 1,5 günlük tezgah çalışmasında 9.216 reaksiyonla sonuçlanır. İkinci yonga türü altı 12 x 12 diziden oluşur ve 864 reaksiyonla sonuçlanır. Burada, Worm-to-CT yöntemi, tek solucanlardan ve toplu örneklerden ısı şok proteinlerini kodlayan genlerin mRNA seviyelerinin ölçülmesi ile gösterilmiştir. Sağlanan, C. elegans genomunda kodlanan genlerin çoğu için işlenmiş RNA'yı güçlendirmek için tasarlanmış astarların geniş bir listesidir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek hücreli RNA diziliminin ve qPCR'nin optimizasyonu, transkripsiyonel darbelerin veya patlamaların hücre başına RNA moleküllerinin sayısında büyük farklılıklara yol açabileceğini ortaya koydu1. Ayrıca, bu teknolojiler daha önce standart toplu transkriptomik ölçümler tarafından kaçırılan önemli hücresel heterojenliği ortaya çıkardı. Bağlama bağlı olarak, bazı tek hücreli transkripsiyonal değişkenlik dokuların karışık hücresel bileşimden kaynaklanır. Bununla birlikte, aynı ortamda yetişen izojenik hücre popülasyonlarında bile yaygın transkripsiyonal heterojenlikvardır 2,3. Bu 'biyolojik değişkenlik', bakterilerden insana kadar hücresel ağların her yerde bulunan bir özelliği olarak giderek daha fazla tanımlanmaktadır. Bazı durumlarda, gelişim, kanser ilerlemesi, HIV gecikmesi ve kemoterapiye yanıtta fenotipik sonuçlar doğurabilir4,5.

Nematod Caenorhabditis elegans, bireyler arasındaki biyolojik değişkenliğin nedenlerini ve sonuçlarını incelemek için ideal özelliklere sahip benzersiz bir model organizmadır. Bu nematodlar 959 hücreden oluşan basit bir model organizmadır ve şeffaf lütikülleri onları in vivo görüntüleme çalışmaları için uygun hale getirir6. C. elegans, ağırlıklı olarak kendi kendini dölleme yoluyla üreyen hermafroditik bir türdür; bu izojenik laboratuvar suşları ile sonuçlandı. İzojenikliğe ve kontrollü kültür koşullarına rağmen, birçok fenotip ve transkript bireyler arasında değişkendir, bu da stokastik veya mikroçevronmental farklılıkların bireyler arasında heterojenliğe katkıda bulunduğunu göstermektedir7,8. Gen ekspresyonunda bu tür değişkenlik, mutasyonların penetrancesinde değişkenlik, sağkalım, gelişimsel zamanlama ve doğurganlık 7,8 ,9dahil olmak üzere birden fazla fitness sonucuna sahiptir. Bu özellikler nedeniyle, tek solucan çalışmaları tüm bir organizmada biyolojik değişkenliği incelemek için eşi görülmemiş bir fırsat sağlar.

Transkriptlerin tek solucan düzeyinde doğru tespiti için teknolojilerin geliştirilmesi ve optimize edilmesi için sahada temel bir ihtiyaç vardır. Tek solucanlı RNA dizilimi10,izole dokulardan RNA dizilimi11ve tek hücreli sıralama12 gibi yeni teknolojiler artık C. elegansiçin kullanılabilir. Bununla birlikte, ana bir zorluk devam etmektedir: interindividuality izlerken, zayıf ifade edilen genler genellikle tespit edilebilir seviyelerin altına düşer13. Bu, özellikle küçük miktarlardaki başlangıç malzemesinden izole edilmiş nadir transkriptler için geçerlidir, çünkü ortalama ifade ve teknik varyans arasında köklü, ters bir ilişki vardır ve genellikle nadir transkriptlerin istatistiksel kesintilerin altına düşmesine neden olur13. Yüksek verimli çok katlı qPCR teknolojilerinin optimizasyonu, özellikle nadir transkriptlerin ekspresyonunu incelerken memeli tek hücreli çalışmalar için yararlı olduğu kanıtlanmıştır14,15. Bu teknoloji, diğer tek solucan teknolojilerinin kıyaslama ve doğrulama amaçları için de kullanılabilir.

Solucandan BT'ye, hücre biyolojisi çalışmalarında kullanılan bir kitten, tek solucanlı cDNA hazırlama için uyarlanmış hızlı ve sağlam bir yöntemdir. Bu yöntemle elde edilen cDNA, çok katlı nanoakışkan qPCR teknolojisi ile birleştiğinde, daha yüksek deneysel aktarım hızı, daha geniş bir dinamik algılama aralığı sağladığı ve tek hücreli amaçlar için doğrulandığı için seçilmiştir14,15. Açıklanan cDNA hazırlığı standart PCR teknolojileriyle kullanım için de geçerlidir. Verim iki şekilde artırılır: İlk olarak, cDNA hazırlığı geleneksel guanidium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyondan daha hızlı ve daha güvenilirdir, çünkü solucanlar doğrudan lizis tamponuna eklenir ve kolayca bozulabilir RNA'nın doğrudan izolasyonunu atlar. İkincisi, nanoakışkan teknolojilerin kullanılması, aynı anda çalıştırılabilen numune ve hedef sayısını önemli ölçüde artırır. Bu makalede, iki yonga karşılaştırılmıştır: tek dizili bir çip ve çok dizili bir çip. Tek dizili bir çip, 96 tek solucan ve 96 astar seti çalıştırabilir ve bu da deney başına 9.216 reaksiyona neden olur. Standart qPCR teknolojilerini kullanarak benzer bir aktarım hızı elde etmek için 96 kuyu plakası kullanarak 96 ayrı qPCR denemesi gerekir. Daha küçük ve daha esnek çok dizili yonga, 864 reaksiyonla sonuçlanan altı 12 x 12 diziden oluşur. Yöntemin üstün güvenilirliği ve duyarlılığı nanoakışkan teknoloji ve bir önamplifikasyon adımının devreye girmesiyle artırılmıştır. Bu makalede sunulan yöntem, biyolojik varyansı çıkarmak için son teknoloji istatistiksel algoritma ile birlikte kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Bu makalede, hem tek solucan hem de toplu solucan örnekleri için hızlı cDNA hazırlama ve yüksek verimli qPCR protokolü sunulmaktadır; algoritma başka bir yerde yayınlanacaktır. Bu protokol için, her çipin organizasyonu deneyden önce hazırlanmalıdır. Tablo 1 ve Tablo 2, sırasıyla çok dizili ve tek dizili yonga için bu planların örneklerini gösterir. Şekil 1'de ayrıntılı olarak açıklanan ve Şekil 2'deçok dizili ve tek dizili yongaları çalıştıran Solucandan CT'ye protokolüne genel bakışlar da vardır.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokol boyunca Caenorhabditis elegans "solucan" veya "solucanlar" olarak adlandırılır. Çeşitli C. elegans suşları çevrimiçi veritabanları aracılığıyla veya model organizmayı kullanan laboratuvarlara doğrudan başvurarak sipariş edilebilir. Bu protokolün I. bölümü (bölüm 1−3), Worm-to-CT protokolü aracılığıyla cDNA hazırlığını açıklar. Bu protokolün BÖLÜM II'si (bölüm 4−13), Fluidigm16tarafından geliştirilen bir protokolden uyarlanan nanoakışkanlar kullanılarak yüksek verimli RT-qPCR çalıştırmayı açıklar. Bu protokol, daha önce tanımlanan iki tür nanoakışkan yonganın, 96 numuneye (toplam 9.216 RT-qPCR reaksiyon) 96 hedefi izleyebilen tek dizili yonganın veya 12 hedef x 12 örneğin alt birimi olarak işlev gören çok dizili yonganın kullanımı için geçerlidir. Her çok dizili yonga, birlikte veya ayrı ayrı çalıştırılabilen altı bağımsız dizi içerir. Örneğin, çok dizili bir yonganın tamamı kullanılarak 72 hedef x 12 örnek (veya tam tersi) veya 36 hedef x 24 örnek (veya tam tersi) izlenebilir. Bu protokolde kullanılan materyallerden herhangi biri hakkında daha fazla bilgi için Malzeme Tablosunabakın.

1. RT-qPCR astar doğrulaması

NOT: Gerçek zamanlı astarlar, başlangıçta MIQUE yönergeleri17tarafından yayınlanan önerilen özelliklere göre tasarlanmıştır. İşlenmiş RNA'ya özgü astarlar yapmak için, ürünler en az bir splice kavşağının her iki tarafına bağlı iki astar olacak şekilde tasarlanmıştır. Uygun astarlar için gereksinimler arasında %20−%80 guanin ve sitozin içeriği, 58−60 °C erime sıcaklığı, ≤0,5 °C astar çiftleri arasındaki erime sıcaklığı farkı ve 70-120 bp ürün uzunluğu yer aldı. Oluşturulan astarların sırası Ek Tablo 1'de bulunabilir. Astarları oluşturmak için kullanılan komut dosyaları için açık kaynak kodu https://github.com/s-andrews/wormrtpcr bulunabilir. Splice sitelerine sahip transkriptler için primer çiftleri, bir intron'u kuşayan iki eksonda yatacak şekilde tasarlanmıştır, ancak NCBI Primer Blast yazılımı18kullanılarak splice varyantı özgü olacak şekilde tasarlanmamıştır. Bu çalışma için astar setleri, hedef dışı herhangi bir tamamlayıcılığı test etmek için C. elegans genomuna karşı patlatıldı.

  1. RT-qPCR primer veritabanından astarları alın (Ek Tablo 1). Alternatif olarak, NCBI Primer Blast 18 gibi çevrimiçi araçları kullanarak qPCR astar çiftleritasarlayin.
  2. Standart dökme qPCR teknikleri19 kullanarak ve MIQUE yönergelerini takip17,20kullanarak her astar çifti için özgüllüğü ve PCR verimliliğini izlemek için bir qPCR standart eğrisi gerçekleştirin.
    NOT: Sadece R2 > 0.98 ve PCR verimliliği %85 ile %115 arasında olan astar çiftleri kullanılmalıdır. Bu çalışmada kullanılan astarlar için sıra, PCR verimliliği ve R2 Tablo 3'teayrıntılı olarak yer uzamıştır.

2. Solucandan CT'ye solucan lizisi

  1. Solucanları bakteri çimlerinden taze, kamışsız bir NGM plakasına alın ve solucanların hareket yoluyla bakterilerin çoğunu solucandan uzaklaştırmak için 5 dakika boyunca plakanın etrafında hareket etmesine izin verin.
    NOT: Bakteriyel çimler ve büyüme koşulları deneysel tasarıma bağlı olarak farklılık gösterecektir. Burada sunulan deneyler, 20 °C inkübatörde L4.9 aşamasına yetiştirilen ilgi solucanları ile OP50 Escherichia coli ile tohumlanmış 6 cm NGM plakaları gerektirir.
  2. RNase içermeyen bir başlıkta, numune başına 12,5 μL 2x RT tampon, 1,25 μL 20x RT enzim tamponu ve 0,25 μL çekirdeksiz sudan oluşan bir ana karışım hazırlayın. Adım 2.8'den her numunenin 11 μL'sine 14 μL ana karışım ekleyin.
  3. Bir PCR şeridinin kapağını kesme kapsamının platformuna baş aşağı yerleştirin ve kubbeli PCR tüp kapaklarına bileşik bir mikroskop altında 10 μL lizis karışımı ekleyin.
    NOT: Sadece bir veya iki örnekle, en az dört tüp içeren bir PCR şeridi kullanmak daha iyidir, çünkü bu, sonraki donma-çözülme adımlarında kapakların patlama riskini azaltır. Alternatif olarak, kapakları yerinde tutmak için lastik bantlar kullanılabilir. Bu durumda, tüpler her aktarıldığı zaman kapakların düzgün bir şekilde kapatıldığından emin olun.
  4. Bakteriyel kirlenmeyi önlemek için solucanları plakadan liziz karışımını içeren kapağın her yuvasına "kepçeleyerek" (yani, altındaki solucanları kazmayla yakalayarak) alın. Tüpleri kapatın ve sıvı nitrojenle dolu bir Dewar şişesine yerleştirmeden önce bir masa üstü mikrosantrifüj (Malzeme Masası)kullanarak 5 sn aşağı çevirin.
    NOT: Toplu deneyler için 15 ila 30 solucan, tek solucan ölçümleri için 1 solucan kullanılmalıdır.
    DİkKAT: Sıvı nitrojen kullanımı yaparken Cryo-Gloves ve koruyucu gözlük giyin ve standart giysi yönetmeliklerine uyun, çünkü cilt veya gözlerle temas ciddi donma hasarına neden olabilir.
  5. PCR tüplerini sıvı nitrojen ve ~40 °C su banyosu arasında aktararak 10x dondurun. Numunelerin tamamen dondurulduğundan emin olmak için tüpleri sıvı nitrojende en az 5 sn bekletin. Numuneler eriyene kadar tüpleri su banyosunda bırakın. RNA bozulmasına yol açtığı için daha uzun süre bırakmayın.
    NOT: Numuneler yaklaşık -200 °C'ye kadar dondurulduğu için tüpler uzun süre sıvı nitrojende bırakılabilir ve RNA bozulmasını azaltır. Bununla birlikte, bu bir protokol durdurma noktası olmamalıdır, çünkü sıvı azot hızla buharlaşır.
  6. Numuneleri ~ 1.800 rpm'de dönen 20−30 dakika boyunca 4 °C'de ayarlanmış bir termal karıştırıcıda(Malzeme Masası)karıştırın.
  7. Numuneler karıştırılırken, buz üzerindeki durdurma çözeltisini çözün.
  8. Numuneleri bir masa üstü mikrosantrifüj (Malzeme Masası)kullanarak aşağı çevirin ve her tüpe 1 μL durdurma çözeltisi ekleyin.
    NOT: Numuneler RNA'yı ters çevirmeden önce 1 haftaya kadar -80 °C'de bırakılabilir (bölüm 3).

3. Ters transkripsiyon

NOT: Tek solucanların ters transkripsiyonu için, burada gösterilen sonuçlar nanoakışkan çiplerle sağlanan reaktifler kullanılarak oluşturulmuştır (Şekil 1'dekiseçenek 2). Şekil 1'in 2. seçeneğinde vurgulanan reaktifler, havuza alınan örneklerin ters transkripsiyonu için de kullanılmıştır. Her iki yöntem de farklı örnek türleri için birbirinin yerine çalışır.

  1. Tek solucanların ters transkripsiyon
    1. RNase içermeyen bir davlumbazda, taze bir PCR tüpüne 1,25 μL ters transkripsiyon karışımı (Malzeme Masası)ekleyin.
      NOT: Çok sayıda örnek varsa 96 kuyu PCR plakası ve otomatik pipet kullanılabilir. Üreticinin protokolü, numune başına 1 μL kullanılabileceğini belirtir.
    2. Liziz çözeltisinin 5 μL'sini alın ve çözelti karışımını adım 2.8'den durdurun ve ters transkripsiyon karışımını içeren taze PCR tüpüne ekleyin.
      NOT: Üreticinin protokolü, reaksiyon başına 1 μL RNA (2,5 pg/μL–250 ng/μL) kullanılabileceğini belirtir. Ters transkripsiyon karışımını 5 μL lised numune ve 1,25 μL RNAse içermeyen su ile değiştirerek plaka başına negatif bir RT kontrolü eklenebilir.
    3. Numuneleri bir termosikler üzerinde aşağıdaki ters transkripsiyon programını kullanarak çalıştırın: 5 dakika için 25 °C, 30 dakika için 42 °C, 5 dakika için 85 °C ve ∞ için 4 °C.
      NOT: Üretilen cDNA, yüksek verimli qPCR kullanılarak amplifikasyona ve veri toplamaya geçmeden önce -20 °C'de saklanabilir.
  2. Toplu numuneler için ters transkripsiyon (15−30 solucan)
    1. RNase içermeyen bir başlıkta, numune başına 12,5 μL 2x RT tampon, 1,25 μL 20x RT enzim tamponu ve 0,25 μL çekirdeksiz sudan oluşan bir ana karışım hazırlayın. 11 μL lizis çözeltisine 14 μL ana karışım ekleyin ve 2.8 adımından çözelti karışımını durdurun.
      NOT: Çok sayıda numune ile uğraşırken bu 96 kuyu plakasında gerçekleştirilebilir.
    2. Numuneleri aşağıdaki ters transkripsiyon programını kullanarak bir termosikler aracılığıyla çalıştırın: 60 dakika için 37 °C, 5 dakika için 95 °C ve ∞ için 4 °C.
    3. Üretilen cDNA 1:4'i nükleaz içermeyen suda seyreltin.
      NOT: Genellikle, ürünler 25 μL'lik son hacme gelir, bu durumda 75 μL eklenmelidir. Bununla birlikte, yoğuşma nedeniyle son hacim değişebilir. Bu nedenle, son çözümde 1:4 oranı yapmak için buna göre ayarlayın. Bu seyreltme adımı, tek solucanlarda qPCR gerçekleştiriyorsa geçerli değildir. Üretilen cDNA, yüksek verimli qPCR kullanılarak amplifikasyon ve veri toplama işlemine geçmeden önce -20 °C'de saklanabilir.

4. Multipleks astar karışımının hazırlanması

  1. 50 μM son konsantrasyondaki her astar çifti için ileri/geri (F/R) astar stoğu hazırlayın. Her biri 100 μM'de aynı hacimde ileri ve ters astarları karıştırın.
  2. Test edilecek her astar çifti için 1 μL 50 μM F/R astar stoğunu birleştirin. DNA süspansiyon tamponu toplam 100 μL hacme kadar ekleyin.
    NOT: Buradaki stok astar konsantrasyonları, üreticinin protokol16'da açıklananlardan farklıdır, ancak aynı son konsantrasyon olan 500 nM'i korur.

5. Belirli bir önkopunlamayı hedefle

  1. %10 genel fazla hacimle reaksiyon başına 1 μL önamplifikasyon mastermiksi (Malzeme Masası),0,5 μL havuzlanmış astar karışımı (adım 4,2) ve 2,25 μL çekirdeksiz su içeren bir ana karışım hazırlayın.
  2. 96 kuyu plakasında, aliquot 3.75 μL ana karışımı, çalıştırılacak numune sayısı için gerektiği kadar kuyuya karışır.
  3. Her kuyuya adım 3.1.3 veya 3.2.3'te üretilen 1.25 μL cDNA faiz çözümlerini ekleyin.
  4. Plakayı 96 iyi sızdırmazlık bandı, kısa bir girdap ve santrifüj ile bir masa üstü plaka spinner ile örtün. Bir termostale aktarın ve aşağıdaki programı çalıştırın: 2 dakika için 95 °C, 15 s için 95 °C'de 15 denatürasyon döngüsü, 4 dakika boyunca 60 °C'de tavlama /uzatma ve ∞ için 4 °C.
    NOT: Üretici, önamplifikasyon reaksiyonu için 10−20 döngüdentavsiye eder 16. Bu protokol, hedef genlerin ifade seviyelerine bağlı olarak 10 veya 15 döngü önerir.

6. Exonuclease I tedavisi

NOT: Bu, şirketleşmemiş astarları preamplifikasyondan çıkarmaktır.

  1. 0.2 μL exonuclease I reaksiyon tamponu (Malzeme Tablosu), 20 U /μL'de 0.4 μL exonuclease I (Malzeme Masası) ve numune başına 1.4 μL çekirdeksiz su içeren bir exonuclease I karışımı hazırlayın. Tüm reaktifleri buzda tut, özellikle de exonuclease I.
  2. 96 kuyu plakasını (adım 5.4) termositten çıkarın, masa üstü plaka spinner ile santrifüjleyin ve contayı dikkatlice çıkarın. Her preamplifikasyon reaksiyonuna karıştırdığım exonuclease'den 2 μL ekleyin. 96 kuyu plakasını aşağıdaki programı kullanarak termositlere yeniden yerleştirin, santrifüj edin ve yerleştirin: 30 dakika için 37 °C, 15 dakika için 80 °C ve ∞ için 4 °C.
  3. Numuneleri termositten alın ve 18 μL 1x Tris EDTA tamponu(Malzeme Masası)ekleyerek 1:5 seyreltin.
    NOT: CDNA örneklerini daha sonra kullanmak üzere -20 °C'de tutmak mümkündür. Üreticinin protokolü, bu aşamada 5x, 10x veya 20x potansiyel seyreltmeler önerir16, ilgi hedeflerinin ifade seviyesine bağlı olarak.

7. Tahlil karışımlarının hazırlanması

NOT: Tahlil karışımları 384 kuyu plakasında hazırlanabilir, çünkü kuyular nanoakışkan talaşlarla aynı boşluktan sahiptir ve yüklemeyi kolaylaştırır.

  1. Çok dizili bir çip için test karışımları hazırlama
    1. Hazırlanan plana göre her kuyu için 2 μL 2x test yükleme reaktifi (Malzeme Masası) ve 1,6 μL DNA süspansiyon tamponu (Malzeme Masası) oluşan bir ana karışımhazırlayın. Aliquot 3.6 μL bu ana karışımın kuyu başına 384 kuyu plakasına.
    2. 4.1. adımda hazırlanan 50 μM F/R astar stoğunun 0.4 μL'lik kısmını hazırlanan plana göre uygun kuyulara ekleyin.
      NOT: Bu, kuyu başına toplam 4 μL test karışımı sağlar ve 1 μL fazlalık sağlar.
  2. Tek dizili yonga için tahlil karışımları hazırlama
    1. Hazırlanan plana göre her kuyu için 3 μL 2x test yükleme reaktifi ve 2,4 μL DNA süspansiyon tamponundan oluşan bir ana karışım hazırlayın. Aliquot 5.4 μL bu ana karışımın kuyu başına işaretli 384 kuyu plakasına.
    2. Hazırlanan plana göre uygun kuyulara 50 μM F/R astar stoğunun 0,6 μL'lik kısmını ekleyin.
      NOT: Bu, kuyu başına toplam 6 μL test karışımı sağlar ve 1 μL fazlalık sağlar.

8. Numune karışımlarının hazırlanması

NOT: Numune karışımları 1 güne kadar önceden hazırlanabilir ve 4 °C'de saklanabilir.

  1. Çok dizili yonga için numune hazırlama
    1. Numune başına düşük ROX ( Malzeme Tablosu ) ve 0,2 μL numune reaktifi(Malzeme Tablosu)ile 2 μL 2x floresan prob süpermix'inden oluşan bir numune ana karışımıhazırlayın. Bu karışımın 2,2 μL'lik kısmını işaretli 384 kuyu plakasına dağıtın.
      NOT: Üretici, örnek reaktif16'nıngirdaplamamanızı önerir.
    2. Pipet 1.8 μL her preamplified, exonuclease ben hazırlanan plana göre uygun kuyulara adım 3.2.3 örnek tedavi.
      NOT: Bu, 1 μL fazlalık ile toplam 4 μL verir.
  2. Tek dizili yonga için numune hazırlama
    1. Numune başına düşük ROX (Malzeme Masası) ve 0,3 μL 20x DNA bağlayıcı boya numune yükleme reaktifi(Malzeme Tablosu)ile 3 μL 2x floresan prob süpermix'inden oluşan bir numune ana karışımıhazırlayın. Bu karışımın 3,3 μL'lik kısmını işaretli 384 kuyu plakasına dağıtın.
    2. Pipet 2.7 μL her bir preamplified ve exonuclease ben hazırlanan plana göre uygun kuyular içine adım 6.3 örnek tedavi.
      NOT: Bu, 1 μL fazlalık ile toplam 6 μL verir. Numune olmadan çalıştırılacak kuyular varsa, bunlar numune ana karışımı ve cDNA yerine 2,7 μL su ile yüklenmelidir. Bu, her iki yonga türü için de önerilir. Makine, çipin ızgarasını tespit etmek için her girişte düşük ROX'a ihtiyaç duyar.

9. Nanoakışkan çipi astarlama

NOT: Çok dizili bir yonganın yalnızca ilk çalıştırmada astarlanması gerekir. Aynı yonganın sonraki çalıştırmaları varsa, bu aşama atlanabilir. Bu adımlar her iki yonga türü için de aynıdır.

  1. Yavaşça ve dikkatlice, kontrol hattı sıvısının tam 150 μL'lik kısmını talaşın akümülatörlerine dahil edilen şırınnalardan enjekte edin. Çipi 45° açıyla tutarak ve dökülmeyi önlemek için şırınnanın ucunu uzak tutarak hiçbir kontrol sıvısının çipe temas etmemesini sağlayın.
  2. Mavi koruyucu filmi çipin altından çıkarın.
  3. Çipi nanoakışkan PCR astar makinesine(Malzeme Masası)barkodu dışa bakacak şekilde yerleştirin. ~ 15-20 dakika süren 'Prime (153x)' komut dosyasını çalıştırın.
    NOT: Bu aşamada nanoakışkan termosikleyiciyi(Malzeme Masası)açın, çünkü kameranın 0 °C'nin altına soğuması yaklaşık 10 dakika sürer.

10. Nanoakışkan çipin yüklenmesi

  1. Yükleme gerçekleşirken bariyer fişlerini sırayla çıkarın. Bu, kuyuları yanlış yükleme olasılığını azaltır.
  2. Çok dizili bir çip için 3 μL veya hazırlanan plana göre nanoakışkan çipin ilgili girişlerine her astar testinin tek dizili çipi için 5 μL aktarın. Aktarılan toplam hacmin istenenden daha küçük olmasına neden olabilecek kabarcıkları tanıtmamaya dikkat edin.
    NOT: Astarsız çalıştırılacak kuyular varsa, bunların ana karışımla yüklenmesi, astar hacminin suyla ikame edilmesi önemlidir. Bu her iki yonga türü için de geçerlidir. Bu aşamada, çipi karanlık bir yüzeye yerleştirmek daha kolay olabilir, bu da kuyuların daha kolay görülmesini sağlayacaktır.

11. Nanoakışkan çipi çalıştırma

NOT: Çok dizili bir yongayı ilk kez çalıştırdığında, Araçlar'ı seçerek izleme dosyasını ayarlayın | Flex Six Kullanım İzleme, Yeni'yi tıklatın, bir dosya adı girin ve Bitti'yi tıklatmadan önce bir konum seçin.

  1. Veri toplama yazılımını açın. Yeni Çalıştırmayı Başlat 'ıtıklatın. Yüklenen çipi, barkodu dışa bakacak şekilde nanoakışkan termosikleyiciye yerleştirin.
  2. Varsa proje ayarını seçin ve İleri | 'yi yükleyin. Çok dizili bir yonga yüklüyorsanız, çalıştırılacak bölümleri (dizileri) seçin.
  3. Uygulama Başvuru Probları'nı seçin, sonra uygulama türünü Gen İfadesiolarak değiştirin ve pasif başvuruyu ROXolarak değiştirin. Tek Prob Tahlili 'niseçin, prob türünü Eva Greenolarak değiştirin ve İleri'yi tıklatın.
  4. Çok dizili bir çip çalıştırmak için GE FLEX altı Hızlı PCR+Melt v1 termal bisiklet protokolünü veya tek dizili bir çip çalıştırmak için GE 96.96 Fast PCR+Melt v2 protokolünü seçin.
  5. Otomatik Pozlama'nın seçili olduğunu onaylayın ve Çalıştırmayı Başlat'ı tıklatın.

12. Çip çalıştırma sonrası

NOT: Bu bölüm yalnızca çipin tamamını kullanmadığında çok dizili yongalar için gereklidir.

  1. Çipi nanoakışkan termositten alın ve nanoakışkanlar PCR astar makinesine yükleyin ve 5 dakika süren Post Run (153x) komut dosyasını çalıştırın.
  2. Kişisel başvuru için kullanılan fişleri etiketleyin.
    NOT: Çip artık oda sıcaklığında saklanabilir ve çipteki kalan diziler 2 ay içinde çalıştırılabilir.

13. Veri temizleme ve analiz

  1. Verileri ' GerçekZamanlı PCR Analizi' yazılımında (Malzeme Tablosu) açın. Test edilen her astar çifti için eriyen tepe sıcaklığını kontrol edin. Belirli bir astar çifti için birden fazla erime sıcaklığı zirvesi sergileyen sonuçları ortadan kaldırın.
    NOT: Birden fazla tepe noktası yalnızca ara sıra, muhtemelen astar çiftleri solukluk oluşturduğunda veya hedef astarların havuza alınan astar karışımındaki diğer astarlarla etkileşimlerinden görünür.
  2. Verileri bir 'ısı haritası' elektronik tablo dosyası olarak dışa aktarın ve başarısız örnekleri veya astarları ortadan kaldırın.
  3. Standart Delta-Ct yöntemi21kullanarak verileri analiz edin. İstatistiksel değerlendirme için göreli ifade düzeylerinde tek yönlü ANOVA gerçekleştirin.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Worm-to-CT'nin cDNA hazırlama yöntemi olarak doğrulanması

Worm-to-CT protokolünün geçerli bir cDNA ekstraksiyon yöntemi olup olmadığını test etmek için standart guanidium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyon yöntemleri ile karşılaştırıldı. Sonuçlar, cDNA'nın standart guanidium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyon teknikleri22 kullanılarak ortalama ~1.000 solucandan ve Solucandan CT'ye yöntemi kullanılarak 30 solucandan hazırlandığı Şekil3'te gösterilmiştir. Numuneler aynı anda ısı şokuna uğradı (34 °C'de 30 dk). Küresel olarak, toplam RNA'nın 100 ng'si başına hsp-70 mRNA ifade düzeyleri her iki yöntem kullanılarak karşılaştırılabilirdi. Bununla birlikte, en yüksek hsp-70 ekspresyozunda (yani ısı şokunun ardından N2'de) Worm-to-CT yöntemi ile ekspresyon seviyeleri daha yüksekti ve bu da hassasiyetin arttığını gösteriyordu.

Hsf-1(sy441)23'te hsp ifadesinde beklenen bir azalma olup olmadığını belirlemek için, moleküler refakatçilerin 23,24'ün ana transkripsiyonel regülatöründeki bir mutasyon çoğaltılabilir, kısa bir ısı şokunu takiben transkripsiyonel refakatçi indüksiyonu karşılaştırıldı. Her iki yöntemde de hsf-1(sy441) hayvanlarında hsp-70 indüksiyonunda azalma tespit edildi. Bu bekleniyordu, çünkü mutant hsf-1 (sy441) hayvanları, HSF-1'in transaktivasyon etki alanındaki bir kesilme nedeniyle refakatçileri teşvik etme yeteneğinin azaldığını gösteriyor. Guanidium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu için hsp70,

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

figure-results-5

figure-results-6

figure-results-7

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, Worm-to-CT protokolünün, RNA'yı tek solucanlardan veya küçük bir solucan havuzundan çıkarmak için hızlı ve verimli bir yöntem olduğu gösterilmiştir. Nanoakışkan sistemin sunduğu yüksek verim, onu bireyler arası değişkenlik ölçümlerinin ölçülmesi için ideal hale getirir. Ayrıca, bu yöntemin yüksek duyarlılığı, tek solucanlı RNA-seq teknolojileri9kullanırken algılamanın altına düşen düşük seviyelerde ifade edilen genlerin algılanmasını sağlar.

Tek solucanlardan cDNA hazırlamak için yöntem seçimini düşünürken. Ly ve ark.29, kütikül sindirimi için proteinaz K'ye dayanan bir protokolü optimize etti. Manikül, moleküllerin solucanlardan izolesi için büyük bir engeldir ve proteinaz K onu kırmak için etkili bir yöntem sağlar. Bununla birlikte, proteinaz K'nin ters transkripsiyon için enzim kullanabilmesi için ısı inaktive edilmesi gerekir. Ly ve arkadaşları 96 °C'ye 10 dk maruz kalma kullanırken, RNA kolayca bozulabilir olduğu için bu protokolde bu adımdan kaçınılmıştır. Kütikülün kırılması için proteinaz K kullanmak yerine tekrarlanan donma-çözülme döngüleri kullanılmıştır. Donma-çözülme, kütikülleri kırmak için etkili bir yöntemdir, çünkü solucan başına daha fazla RNA izole edilebilir. Ly ve ark. solucan başına çıkarılan toplam RNA'nın proteinaz K kullanılarak 35 ng olduğunu bildirirken, bu protokol solucan başına 51,75 ng ± toplam RNA 6,74 SEM elde eder. Önamplifikasyon adımlarıyla birlikte ısıya maruz kalmanın önlenmesi, görünüşe göre Worm-to-CT'nin dinamik algılama aralığını standart protokollere kıyasla genişletiyor. Ly ve ark. ısı şoku sonrası hsp-70 için hsp-16.2 ve 22.8 ± 0.17 için 21.1 ± 0.15 mutlak Ct değerlerini bildirin. Aynı ısı şoku koşullarını (30 °C'de 1 saat) kullanan bu protokol, hsp-16.2 için 17.93 ± 0.57 ve hsp-70 için 21.13 ±0.33 mutlak Ct değerleri elde eder. Bu, dondurarak çözülme liziz yönteminin daha yüksek RNA verimi sağladığını ve düşük eksprese transkriptler için daha uygun olduğunu gösterir.

Nanoakışkan sistemler, belirli bir hedef transkript kümesini ve deneyin ölçeğine adaptasyona izin veren daha küçük (çok dizili çip) veya daha büyük (tek dizili çip) sayıda numunenin kullanımını araştırırken idealdir. Tek bir solucanda ifade edilen tüm transkriptlerin tarafsız bir resmini elde etmek için, bariz seçim RNA dizilimini kullanmaktır. Bununla birlikte, deneyin odak noktası daha küçük ama yine de nispeten büyük bir hedef gen kümesi ise, araştırmacının bir nanoakışkan PCR makinesine erişimi olması koşuluyla bu protokolü kullanmak daha uygun maliyetlidir. Nanoakışkan sistem reaktiflerinin ve tek dizili çipin maliyeti solucan başına yaklaşık 13 £ olarak tahmin edilirken, tek solucan dizilimi için reaktiflerin maliyetleri, sıralama maliyetleri dahil olmak üzere solucan başına yaklaşık 60 £ olacaktır.

Hangi PCR platformunun kullanılacağı düşünüldüğünde, nanoakışkan qPCR ile birleştirilen Worm-to-CT yöntemi zaman ve aktarım hızı açısından avantajlar sunar. Yaklaşık 2 günlük çalışmada 9.216 RT-qPCR sonucu elde etmek mümkündür, ancak standart bir qPCR platformu kullanarak aynı sayıda hedefin amplifikasyonu, günde dört plaka çalıştıran 96 kuyu plakası tahlilleri kullanılarak yaklaşık 5 çalışma haftası sürer. Ancak, test edilecek hedef sayısı daha küçükse, standart bir qPCR makinesiyle birlikte Worm-to-CT kullanmak daha uygun maliyetlidir. Tek dizili yongalar yeniden çalıştırılamaz, bu nedenle boş kuyuların çalıştırılması maliyet verimliliğini azaltır.

Yöntemin bir sınırlaması, çoklama adımı sırasında astar-primer dimerlerin potansiyel oluşumudur, ancak bu vakaların% 1'inden daha azında gerçekleşir. Solucandan CT'ye protokol verimli olmasına ve tek solucanlara uygulandığında güvenilir sonuçlar sağlamasına rağmen, yaklaşık% 5'lik bir arıza oranı vardır, bu da solucanın hasat adımı sırasında kapakta veya tüpün üstünde sıkışıp kaldığı durumlara karşılık gelir.

Birlikte, bu çok yönlü ve güvenilir yöntem, daha standart tekniklere kıyasla daha yüksek verim ve hassasiyet sunar. Bu yöntem, yüksek verimli ekranların doğrulanması için çok yararlı olabilir ve tek solucan gen ifade düzeylerini izlemek veya doğrulamak için mükemmel bir seçimdir. Bu yöntem, izole dokulardan gen ekspresyonunun niceliği gibi diğer zorlu tekniklere uygulanabilir. Örneğin, bağırsak, gonadlar veya CBC'ler tarafından izole edilen hücreler gibi tam dokuların izolasyonu, RNA dizileme deneyleri yapmak için yeterli malzeme sağlar. Bununla birlikte, sınırlı miktarda malzeme genellikle nadir transkriptlerin nicelliğini önleyen yinelenen okumalara yol açar. Bu senaryoda, nanoakışkan tabanlı teknolojinin kullanılması, araştırmacıların bu dokulardaki veya hücrelerdeki tüm transkriptlerin yalnızca bir alt kümesini izlemeleri gerekiyorsa, deneylere ek duyarlılık sağlamalı ve maliyet verimliliğini artırmalıdır.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sharlene Murdoch'a ve Babraham Enstitüsü Tesisleri'ne destekleri için teşekkür ederiz. JLP Wellcome Trust (093970/Z/10/Z) ve OC ERC 638426 ve BBSRC [BBS/E/B000C0426] tarafından desteklenmiştir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 mikro; İlgilenilen genler için M stok primerleri.
96.96 çip için20X DNA Bağlayıcı BoyaFluidigm100-7609
2X Test Yükleme ReaktifiFluidigm100-7611
384 kuyulu plakalar
8 şeritli PCR tüpleri
96 kuyulu buz bloğu
96 kuyulu plakalar
96.96 Dynamic Array IFCFluidigmBMK-M-96.96El yazması boyunca "Single-Array Chip" olarak atıfta bulunulmuştur96
kuyucuklu sızdırmazlık bandı
BioMark & EP1 YazılımıFluidigm101-6793İçeriği: Biomark HD Veri Toplama yazılımı, Gerçek Zamanlı PCR Analizi yazılımı, SNP Genotipleme Analiz yazılımı, Dijital PCR Analiz yazılımı, Eriyik Eğrisi Analizi yazılımı
BioMark veya BioMark HD sistemiFluidigm100-2451 K1El yazması boyunca "nanoakışkanlar termocycler" olarak atıfta bulunulmuştur
96.96 ve FlexSix IFC'ler için Kontrol Hattı Sıvı KitiFluidigm89000021El yazması boyunca "kontrol hattı sıvısı" olarak atıfta bulunulmuştur
. DNA Süspansiyon tamponuTEKnovaT0021
kubbeli PCR kapakları
Eksonükleaz INew England BioLabsM0293L
Eksonükleaz I reaksiyon tamponuNew England BioLabsB0293S
FLEXsix DELTAgene Numune ReaktifSıvısıigm100-7673makale boyunca "numune reaktifi" olarak atıfta
Gen İfadesi IFCFluidigm100-6308makale boyunca "Multi-Array Chip" olarak atıfta bulunulmuşturFluidigm
Gerçek Zamanlı PCR Analizi Kullanıcı KılavuzuFluidigm68000088Bu, makalede atıfta bulunulan protokolün 2. bölümü için temel olarak kullanılan protokoldür.
IFC Denetleyici MXFluidigm 68000112I1El yazması boyunca "nanoakışkanlar PCR hazırlama makinesi" olarak atıfta bulunulmuştur
. IFC Denetleyicileri SOFTWEARFluidigm100-2297
MikrosantrifüjStarLabC1301B-230V'deIFC denetleyici MX sıvı nitrojeni çalıştırmak için gereken tüm yumuşak aşınma ve komut dosyalarını içerirProtokoldeki PCR tüp şeritlerini döndürmek için kullanılır.
Nükleaz İçermeyen Su
plakası döndürücüLabnetK4050725mini plaka döndürücü, mps 1000. protokol aracılığıyla "masa üstü plaka döndürücü" olarak atıfta bulunulurGüç
SYBR Yeşil Hücrelerden Ct'ye kitinvitrojen4402955Bu kit, Worm-to-CT protokolündeki nematodlarda kullanılmak üzere uyarlanmış olandır. Devamlı: Durdurma Solüsyonu, DNaz I ve 20X RT Enzim Karışımını -20 ° C'de saklayın. Depo Lizis Solüsyonu, 2X SYBR RT Tamponu (el yazması boyunca RT tamponu olarak anılacaktır) ve Power SYBR® Green PCR Master Mix (el yazması boyunca PCR Master Mix olarak anılır). Bu Kit 400 reaksiyon içindir, 40 ve 100 reaksiyon için kitler de mevcuttur.
PreAmp Master MixFluidigm100-5580, 100-5581
Ters Transkripsiyon Master Mix— 480 reaksiyonFluidigm100-629996 reaksiyon için bir tüp de mevcuttur (PN100-6298)
Rnase Free water
SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROXBio-Rad Laboratories172-5211, el yazması boyunca "floresan prob süper karışımı" olarak atıfta bulunulmuştur
Standart 96 ve 384 kuyulu Termal Döngüleyici
TE Tamponu (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTATEKnovaT0224El yazması boyunca Tris-EDTA tamponu
ThermoMixer CEppendorfatıfta bulunulmuştur 5382000031 Metin boyunca "termal karıştırıcı" olarak atıfta
bulunulmuşturTrizolThermo-Fisher15596026Protokol aracılığıyla "guanidyum tiyosiyanat-fenol-kloroform" olarak atıfta bulunulmuştur
. Ilık su banyosu
(Tek Dizili Çip), bulunulmuşturFLEXsix, Dewar olarak

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biology. 4 (10), 309(2006).">Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biology. 4 (10), 309(2006).
  2. Study lineage decision-making in vitro: emerging concepts and novel tools. Annual Review of Cell Developmental Biology. 31, 317-345 (2015).">Semrau, S., van Oudenaarden, A. Study lineage decision-making in vitro: emerging concepts and novel tools. Annual Review of Cell Developmental Biology. 31, 317-345 (2015).
  3. Single-cell epigenomics: Recording the past and predicting the future. Science. 358 (6359), 69-75 (2017).">Kelsey, G., Stegle, O., Reik, W. Single-cell epigenomics: Recording the past and predicting the future. Science. 358 (6359), 69-75 (2017).
  4. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Review Genetics. 20 (9), 536-548 (2019).">Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Review Genetics. 20 (9), 536-548 (2019).
  5. Stochastic gene expression: from single molecules to the proteome. Current Opinion in Genetics & Development. 17 (2), 107-112 (2007).">Kaufmann, B. B., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression: from single molecules to the proteome. Current Opinion in Genetics & Development. 17 (2), 107-112 (2007).
  6. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , Edited by The C. elegans Research Community (2015).">Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , Edited by The C. elegans Research Community (2015).
  7. Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans. Science. 335 (6064), 82-85 (2012).">Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans. Science. 335 (6064), 82-85 (2012).
  8. Variability in gene expression underlies incomplete penetrance. Nature. 463 (7283), 913-918 (2010).">Raj, A., Rifkin, A. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. Variability in gene expression underlies incomplete penetrance. Nature. 463 (7283), 913-918 (2010).
  9. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).">Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  10. Adapting the Smart-seq2 Protocol for Robust Single Worm RNA-seq. Bio-protocol. 8 (4), 2729(2018).">Serra, L., et al. Adapting the Smart-seq2 Protocol for Robust Single Worm RNA-seq. Bio-protocol. 8 (4), 2729(2018).
  11. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Biology. 14 (8), 1007559(2018).">Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Biology. 14 (8), 1007559(2018).
  12. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).">Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  13. Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics. Nature Review Genetics. 16 (3), 133-145 (2015).">Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics. Nature Review Genetics. 16 (3), 133-145 (2015).
  14. The workflow of single-cell expression profiling using quantitative real-time PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (3), 323-331 (2014).">Ståhlberg, A., Kubista, M. The workflow of single-cell expression profiling using quantitative real-time PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (3), 323-331 (2014).
  15. Methods for qPCR gene expression profiling applied to 1440 lymphoblastoid single cells. Methods. 59 (1), 71-79 (2013).">Livak, K. J., et al. Methods for qPCR gene expression profiling applied to 1440 lymphoblastoid single cells. Methods. 59 (1), 71-79 (2013).
  16. Real-Time PCR Analysis User Guide. , https://www.fluidigm.com/binaries/content/documents/fluidigm/resources/real-time-pcr-analysis-ug-68000088/real-time-pcr-analysis-ug-68000088/fluidigm%3Afile (2018).">Fluidigm. Real-Time PCR Analysis User Guide. , https://www.fluidigm.com/binaries/content/documents/fluidigm/resources/real-time-pcr-analysis-ug-68000088/real-time-pcr-analysis-ug-68000088/fluidigm%3Afile (2018).
  17. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).">Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
  18. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ (2020).">U. S. National Library of Reference. Primer Blast. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ (2020).
  19. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. Journal of Molecular Endocrinology. 29 (1), 23-39 (2002).">Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. Journal of Molecular Endocrinology. 29 (1), 23-39 (2002).
  20. Good Practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR), LGC. , (2013).">Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. Good Practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR), LGC. , (2013).
  21. Statistical analysis of real-time PCR data. BMC Bioinformatics. 22 (7), 85(2006).">Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. Jr Statistical analysis of real-time PCR data. BMC Bioinformatics. 22 (7), 85(2006).
  22. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio-101. 47, (2011).">He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio-101. 47, (2011).
  23. The L-Type Cyclin CYL-1 and the Heat-Shock-Factor HSF-1 Are Required for Heat-Shock-Induced Protein Expression in Caenorhabditis elegans. Genetics. 168 (8), 1937-1949 (2004).">Hajdu-Cronin, Y. M., Chen, W. J., Sternberg, P. W. The L-Type Cyclin CYL-1 and the Heat-Shock-Factor HSF-1 Are Required for Heat-Shock-Induced Protein Expression in Caenorhabditis elegans. Genetics. 168 (8), 1937-1949 (2004).
  24. Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity. Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).">Douglas, P. M., et al. Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity. Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).
  25. Dbl-1 a TGF-beta is essential for C. elegans aversive olfactory learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 17081-17086 (2012).">Zhang, X., Zhang, Y. Dbl-1 a TGF-beta is essential for C. elegans aversive olfactory learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 17081-17086 (2012).
  26. The Use and Misuse of the Coefficient of Variation in Organizational Demography Research. Sociological Methods & Research. 30 (4), 475-491 (2002).">Sørensen, J. B. The Use and Misuse of the Coefficient of Variation in Organizational Demography Research. Sociological Methods & Research. 30 (4), 475-491 (2002).
  27. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Current Biology. 18 (7), 481-489 (2008).">Pujol, N. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Current Biology. 18 (7), 481-489 (2008).
  28. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).">Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).
  29. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 7 (2), 59-63 (2015).">Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. J. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 7 (2), 59-63 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

High Throughput RT qPCRC elegans Gene ExpressionWorm to CT MethodNanofluidic TechnologySingle Worm AnalysisBulk Sample ProcessingcDNA PreparationReverse TranscriptionPreamplification ProtocolExonuclease I Treatment

Related Articles