Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) Ubiquitylation tanımlamak için Kütle Spektrometresi Analizi

5.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61138

⸱

10 Haziran 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Model Animal Research Center, Nanjing University, 2Jiangsu Key Laboratory of Molecular Medicine, Medical School of Nanjing University, 3Greehey Children's Cancer Institute, Department of Molecular Medicine, UT Health Science Center San Antonio

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

CENP-A ubiquitylation centromere DE CENP-A birikimi için önemli bir gerekliliktir, hücre bölünmesi arasında dimerizasyon yoluyla kalıtsal, ve hücre canlılığı için vazgeçilmez. Burada EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) proteininin ubiquitylation belirlemek için kütle spektrometresi analizi ni tanımlıyoruz.

Özet

Kinetokoreve sentromerlerin yapısı ve dinamiklerinin incelenmesi kromozomal instabilite (CIN) ve kanser ilerlemesini n anlaşılmasında önemlidir. Bir sentromerin kromozom yerinin ve işlevinin (yani centromer kimliğinin) nasıl belirlendiği ve doğru kromozom ayrımına nasıl katıldığı temel bir sorudur. CENP-A sentromer kimliğinin DNA olmayan indikatörü (epigenetik işareti) olarak önerilmektedir ve cenp-A ubiquitition centromere de CENP-A birikimi için gereklidir, hücre bölünmesi arasında dimerizasyon yoluyla kalıtsal, ve hücre canlılığı için vazgeçilmez.

Burada, EYFP-CENP-A K124R mutantının ubiquitylation'ını tanımlamak için kütle spektrometresi analizini açıklıyoruz ve cenp-A K124R mutant proteinindeki EYFP etiketlemesi nedeniyle farklı bir lizinde ubiquitylation indüklenmiş olduğunu öne sürüyoruz. EYFP-CENP-A K124R'da lizin 306 (K306) ubiquitylation başarıyla tanımlanmış, kütle spektrometresi analizi ile CENP-A'da lizin 56 (K56) ile karşılık gelmektedir. Bir uyarı GFP / EYFP kullanımı veya bir proteinin işlevini analiz etmek için bir araç olarak yüksek molekül ağırlıklı protein etiketleme tartışılır. Mevcut teknik sınır da her yerde bantların tespiti, siteye özgü ubiquitylation(lar) belirlenmesi ve canlı hücrelerde veya belirli bir hücrede tüm hücre döngüsü boyunca ubikitlasyon görselleştirme için tartışılmıştır.

Burada sunulan kütle spektrometresi analizi yöntemi farklı etiketleri ve diğer sentromer-kinetokore proteinleri ile insan CENP-A protein uygulanabilir. Çeşitli tahliller/analizlerden oluşan bu kombinatory yöntemler, her yerde bulunan işlevsel rollerini belirlemek isteyen araştırmacılar için önerilebilir.

Giriş

Ökaryotların çoğunda, iğ mikrotübülleri sentromer olarak adlandırılan her kromozomun tek bir bölgesine bağlanmalıdır. Kinetochore sentromere bulunan proteinlerin bir komplekstir. Sentromer ve kinetokore proteininin hareketlerinin zamanlaması ile kinetokore ve sentromerlerin yapısının incelenmesi kromozom instabilitesi (CIN) ve kanser ilerlemesini anlamak için önemlidir. Önemli sorular, bir sentromerin kromozom konumunun ve işlevinin (yani sentromer kimliğinin) nasıl belirlendiği ve doğru kromozom ayrımına nasıl katıldıklarıdır. Çoğu türde, CENP-A adı verilen özel histon benzeri protein içeren özel bir nükleozomun varlığı sentromer kimliğini tanımlar. Bu nedenle CENP-A'nın sentromer kimliğin DNA olmayan göstergesi (epigenetik işareti) olduğu öne sürüldü. CENP-A'nın insanlardaki centromer kimliğini nasıl tanımladığımekanizmasını açıklamak önemlidir.

Holliday kavşak tanıma proteini (HJURP) CENP-A-spesifik şaperon hangi mevduat CENP-A centromeric nükleozomlar1,2,3. Daha önce CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase lisenin üzerinde CENP-A ubiquitylation için gerekli olduğunu bildirdik 124 (K124) ve centromere lokalizasyon4. Ayrıca, sonuçlarımız yeni sentezlenen CENP-A centromere işe önceden varolan her yerde CENP-A5gerektirdiğini gösterdi. Böylece, CENP-A ubiquitylation hücre bölünmeleri arasında dimerization yoluyla kalıtsal olduğunu düşündüren bir model sağlanmıştır.

Bulgularımız ve Yu ve ark.'nın bulgularının aksine, CENP-A ve merkezsel lokalizasyonu ile ilgili olumsuz sonuçlar son zamanlarda6yayınlanmıştır. Makalede, Lizin 124 (K124) üzerinde CENP-A modifikasyonları kurulması için vazgeçilebilir olduğunu iddia etti, bakım, ve insan centromeres uzun vadeli fonksiyonu, K124R mutasyonu CENP-A centromere lokalizasyonu etkilemediğini gösteren olumsuz sonuçlara dayanarak ne hücre canlılığı6. Ancak, onların sonuçları ve sonuçları tartışma için yeterli oda var, ve biz zaten ne sorun var onların önceki yayın7olabilir açıklanmıştır . Endojen CENP-A boyutundan çok daha büyük molekül ağırlıklarına sahip olan CENP-A ile proteinleri eritmiş olmaları dikkat edilmelidir: örneğin, ~30 kDa geliştirilmiş sarı floresan proteini (EYFP) ile ~16 kDa CENP-A'ya eritmiş ve RPE-1CENP-A-Fout sisteminde EYFP-CENP-A K124R füzyon proteinini analiz ettiler. K124 ubiquitin yapısaltahminleredayalı hjurp doğrudan bağlamak için beklenmez 4 , Ancak, mono-ubikitin eklenmesi CENP-A protein konformasyonu üzerinde bir etkisi olduğu tahmin edilmektedir. CENP-A konformasyonunun proteini büyük bir füzyon proteininin varlığı ile değiştirilebilir ve bu konformasyonel değişim ubikilasyon kaybının neden olduğu yapısal değişiklikleri maskeleyebilir. Büyük boyutlu proteinfüzyonunun EYFP-CENP-A K124R mutantında K124 dışındaki bir lizinde ubiquitylation'ı indüklemesini ve başka bir sitedeki bu ubiquitylation'ın orijinal K124R tek mutant fenotipini inhibe ettiğini/maskelediğini öneriyoruz. Cenp-A K124R mutant proteininde büyük etiketli protein (EYFP) ile farklı lizinde ubiquitylation'ın meydana geldiğine dair kanıtlar 8. EYFP etiketlemenin EYFP-CENP-A K124R'ın başka bir lizin bölgesinin her yerde bulunmasına neden olduğu ve EYFP-CENP-A K124R mutantının HJURP'ye bağladığı saptandı. Sonuç olarak, başka bir sitede bu ubiquitylation inhibe / maskeler orijinal K124R tek mutant fenotip, ve hem EYFP-CENP-A WT ve K124R mutantlar centromere lokalizasyon gösterdi (biz kullanılan ve pBabe-EYFP-CENP-A WT ve K124R mutant karşılaştırıldı, birlikte pBabe-EY controlFP.). Sonuçlar, Bayrak etiketli veya etiketsiz CENP-A K124R mutantlarının ölümcül olduğunu ancak monoubiquitin füzyonu ile kurtarılabilen leri gösterdi, bu da CENP-A ubiquitylation'ın hücre canlılığı için vazgeçilmez olduğunu düşündürüyor.

Son yıllarda, birçok çalışma da in vivo ve in vitro9,,10,,11HEM CENP-A protein ve diğer centromere-kinetochore proteinlerin posttranslational değişiklikler (PTMs) tanımlamak için farklı tahliller geliştirdik. Kromatin fonksiyonlarını düzenleyen önemli bir mekanizma olan histon proteinlerinin PTM'lerine benzer olarak, sentromerik kromatin bileşenlerinin PTM'leri de sentromerlerin genel yapısını ve işlevini düzenleyen önemli bir mekanizmada yer almaktadır. CENP-A PTM bölgelerinin çoğu CENP-A içeren nükleozomlara özgüdür, ancak bunlardan birkaçı histon H3'te korunmuştur, bu kalıntıların modifikasyonunun sentromere özgü fonksiyona katkıda bulunduğu ileri sürülmektedir. Fosforilasyon, asetilasyon, metilasyon ve ubikitlasyon da dahil olmak üzere CENP-A PTMs daha önce bildirilmiştir9, CENP-A ptms çeşitli tabi olduğunu düşündüren ve amino terminus ve C-terminus histon-fold etki alanında onların kombinatoryal dizileri. Birden fazla fonksiyonda CENP-A modifikasyonlarının önemi bizimki de dahil olmak üzere birçok grup tarafından ortaya kondu. Bu fonksiyonlar centromerlerde CENP-A birikimini, protein stabilitesini ve CCAN'ın (kurucu sentromer ilişkili ağ) işe alınmasını içerir9. Ancak, cenp-A PtM'lerin sınırlı çalışmaları ve bulguları, işlevlerini doğrudan veya dolaylı olarak düzenleyen kanonik histones biri ile karşılaştırmalar yapıldığı nda önceden oluşturulmuştur. Bu CENP-A PTM'lerini tanımlamak için metodolojiye odaklanan teknik raporlar da sınırlıdır.

CENP-A ubiquitylation centromere12de CENP-A birikimi için gerekli olduğundan , hücre bölünmesi arasında dimerization yoluyla kalıtsal5, ve hücre canlılığı için vazgeçilmez8, CENP-A ubikirlasyon belirlemek için yöntem fonksiyonel aktivite, konumlandırma ve centromere yapısını incelemek için gelecekte gerekli olacaktır. Bu nedenle, burada EYFP-CENP-A K124R mutant ubiquitylation tanımlamak için kütle spektrometresi analizi açıklar EYFP etiketleme CENP-A K124R mutant protein8farklı bir lizin de ubiquitylation indükler düşündüren . Diğer kontrol tahlil ve analizlerinin protokolleri (immünofloresan analizi, koloni büyüme dışı tahlil ve in vivo ubiquitition tahlil) ayrıca büyük kütle spektrometresi analizinin sonuçlarını doğru bir şekilde tartışmak için sunulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Hücre kültürü ve pBabe-EYFP-CENP-A yapılarının retrovirüs transfeksiyonu

NOT: EYFP-CENP-A, pBabe-EYFP-CENP-A'dan benzer protein düzeyinde endojen CENP-A'ya kadar ifade edilir. Toplam hücresel CENP-A proteini, CENP-A-/F alelinin CRE rekombinaz ile bozulmasından sonra bu EYFP-CENP-A iledeğiştirilir.

  1. 293T ambalaj hücreleri kullanılarak retrovirüs içeren supernatant hazırlanması.
    1. 0. Gün: 6 kuyulu kültür plakası (1.0 x 106 hücre/kuyu) üzerine 293T ambalaj hücreleri yayın. %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile yüksek glikozlu DMEM'deki kültür hücreleri. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 atmosferinde 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
      NOT: En iyi sonuçlar için, tohumlamada kullanılacak hücre yoğunluğunu ampirik olarak belirleyin.
    2. 1. Gün: Yayıldıktan sonra 23 saat civarında transfeksiyon reaksiyonu hazırlayın (24 saat noktası transfeksiyonun 0 saat noktasıdır). Her pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) ve pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) transfect ekspresyon plazmid (Tablo 1bakınız).
    3. Tablo 2'de listelenen yardımcı/ambalaj plazmidlerinin bir kombinasyonunu seçin ve bunları yukarıda listelenen plazmidlerden birini içeren tüplere ekleyin. Çoğunlukla yardımcı / ambalaj plazmidler için bu 3 kombinasyonları vardır(Tablo 2). Herhangi bir kombinasyon bu deneylerde çalıştı ve benzer transfection verimliliği gösterdi.
    4. 50 μL azaltılmış serum ortamı hazırlayın ve her pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) ve pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (Tablo 1'ebakınız) tablo 2'de listelenen yardımcı/ambalaj plazmidlerinin bir kombinasyonunu ekleyerek karıştırın (aşağıya bakın). Bu karışımı oda sıcaklığında 5 dk kuluçkaya yatırın. Bu karışım Çözelti A.
    5. 50 μL azaltılmış serum ortamı nı daha hazırlayın ve sırasıyla 1,5 μL transfeksiyon reaktifi I ve II'yi karıştırın (Malzeme Tablosu). Bu karışımı oda sıcaklığında 5 dk kuluçkaya yatırın. Bu karışım B çözeltisi.
      NOT: İsteğe bağlı olarak, b çözeltisine sadece 6.0 μL transfeksiyon reaktifi III (polietilen [PEI]; 1.0 mg/mL) ekleyin veya çözelti B'de I ve II çözeltisine transfeksiyon reaktifleri I ve II'ye ek olarak 6.0 μL transfeksiyon reaktifi III ekleyin.
    6. A ve B çözeltilerini karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
    7. Kültürlü hücreleri PBS ile bir kez yıkadıktan sonra, 500 μL azaltılmış serum ortamına sahip 6 kuyulu kültür plakasının her kuyunun her kuyusu için A ve B çözeltilerinin (yani DNA-lipid kompleksi) karışımını doğrudan ekleyin. Plazmidin son konsantrasyonu 3.3 g/mL'dir.
    8. Hücreleri %5 CO2 atmosferinde %5,5'lik bir atmosferde 37 °C'de kuluçkaya yattıktan sonra, orta yı %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile yüksek glikozlu DMEM olarak değiştirin. 6 kuyulu kültür plakasında ki orta değişiklikten sonra 2 mL/kuyu kültür ortamı koyun.
    9. Transfeksiyon sonrası 48 saat için %5 CO2 atmosferinde hücreleri 37 °C'de kültürlendirin. Retrovirüs içeren supernatant kullanarak Gün 3 retrovirüs enfeksiyonu gerçekleştirin.
  2. CENP-A-/F RPE-1 hedef hücrelerinin retrovirüs enfeksiyonu.
    1. 2. Gün: Enfeksiyondan bir gün önce, CENP-A-/F RPE-1 hedef hücrelerini 6-well kültüründe (2,25 x 105 hücre/kuyu) transfect olarak yayın. DMEM kültür hücreleri: F12 orta(Tablo Malzemeler) ile 10% FBS ve 1% penisilin-streptomisin.
      NOT: Koloni büyüme tahlilleri, immünoresans ve batı leke analizi için hücreleri kontrol olarak yayın. En iyi sonuçlar için, ampirik tohumlama kullanmak için hücre yoğunluğunu belirleyin.
    2. 3. Gün (virüsün enfeksiyon günü): 293T ambalaj hücrelerinin transfeksiyonundan sonra 48 saat, virüs içeren süpernatantı toplayın ve 0,45 μm filtreden geçirin (virüs zarfını yakayan 0,2 μm'lik filtre kullanmayın). Polyethersulfone (PES) filtreleri kullanılması tavsiye edilir.
    3. CENP-A-/F RPE-1 hücrelerini virüsle enfekte edin. 6-iyi kültür plakabir kuyu için, 8 μg /mL son konsantrasyona 1 mL taze medya, 1 mL virüs supernatant ve polibren ekleyin. 37 °C'de CENP-A-/F RPE-1 hücrelerini transfeksiyondan sonra 4 gün boyunca %5 CO2 atmosferinde kuluçkaya yatırın.
      NOT: CENP-A-/F RPE-1 hücre büyümesi için kuluçka dönemi, optimal sonuçlar için yapılan analizler takip edilerek ampirik olarak belirlenmelidir.

2. PBabe-EYFP-CENP-A içeren hücrelerin immünofloresan analizi

  1. 7. Gün: pBabe-EYFP-CENP-A retrovirüs enfeksiyonundan 4 gün sonra, aspirasyon la kültür ortamını ortadan kaldırır. Hücreleri tbs (25 mM Tris-HCl, pH 7.5; 125 mM NaCl) ile bir kez durula. Hücrelerin yüzeyini rahatsız etmemek için kültür kuyularının yan tarafına TBS uygulayın.
    NOT: Hücre fiksasyonu için en uygun zaman noktası ampirik olarak belirlenmelidir. Hem EYFP-CENP-A WT hem de K124R immünofloresan sinyalleri, pBabe-EYFP-CENP-A'nın retrovirüs enfeksiyonundan en az 4 gün sonra centromerde tespit edilebilir (veriler gösterilmez, Cre enfeksiyonu olan veriler için Şekil 1C-E).
  2. Daha önce açıklandığı gibi metanol hücre fiksasyonu ve immünofloresan boyama gerçekleştirin13.
  3. Primer antikorlar % 4 keçi serumu içeren TBS'de sentromer konum belirteci için anti-GFP antikor (1:1.000 seyreltme) ve anti-CENP-B antikor (1:200 seyreltme oranı) kullandığından (bkz.
  4. Bir kağıt havlu ile aşırı montaj ortamı çıkarın ve son adımda oje ile coverslip kenarları mühür.
  5. Centromerde EYFP-CENP-A'nın kalan sinyallerinin immünororeskence görüntü gözlemi, edinimi, sayısallaştırılması ve analizi için daha önce açıklanan13 yöntemine bakın.
  6. A veya B1 ve B2 Yazılımlarını kullanarak görüntü edinimi, dekonvolution, niceleme ve analiz dahil olmak üzere işleme gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). İsteğe bağlı olarak, konfokal lazer tarama mikroskobu için C1-C3 yazılımlarını (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanın.
    NOT: Yazılım A'da kullanılan tüm komutlar için Ek kodlama dosyalarında 2.6.1'e bakın. B1 ve B2 yazılımlarında kullanılan tüm komutlar için Ek kodlama dosyalarında 2.6.2'ye bakın.

3. Retro-Cre virüs enfeksiyonu sonrası pBabe-EYFP-CENP-A kullanılarak koloni outgrowth tahlilleri

NOT: Bu titrenin nedeni, CENP-A-/F alelinin Cre rekombinaz ile bozulmasından sonra (toplam hücresel CENP-A proteininin değiştirilmesinden sonra) EYFP-CENP-A WT ve K124R mutantı arasındaki hücre canlılığını karşılaştırmaktır.

  1. PBabe-EYFP-CENP-A retrovirüs transfeksiyonu yapır.
    1. Bölüm 1'de açıklandığı gibi CENP-A-/F RPE-1 hücrelerinin retrovirüs transfeksiyonu gerçekleştirin. DMEM kültür hücreleri: F12 orta ile 10% FBS ve 1% penisilin-streptomisin için 72 h virüs enfeksiyonu sonra.
    2. PBabe-EYFP-CENP-A yapılarının retrovirüs enfeksiyonundan üç gün sonra (6. günde), koloni büyüme testi ve kontrol deneyleri için kullanılacak transfected hücreleri içeren kuyularda blasticidin S (10 μg/mL) ekleyin. Virüsler virüs enfeksiyonundan en az 14 gün sonra blasticidin S. Blasticidin S içeren ortamı 5 günde bir değiştirin.
      NOT: Eğer hücreler koloni tayini için tohumlamadan önce yaklaşık %80 biraraya ulaşırsa (3.2.7. ve 3.2.8), 6 kuyulu kültür plakasında tripsinizasyon ve kaplama ile hücreleri 1:2 ve 1:5 oranında iletin.
    3. PBabe-EYFP-CENP-A protein ekspresyonunu doğrulamak için 7. Bölüm 4'te açıklandığı gibi batı leke analizini gerçekleştirin. Sonuçlar Şekil 1B'de (şerit 1-4) gösterilmiştir.
    4. Cre virüs enfeksiyonu ile koloni outgrowth tahdit için, blasticidin S varlığında virüs enfeksiyonu sonra 14 gün boyunca büyüyen hücreleri tutmak (yani, blasticidin S orta içeren hücreleri büyümek 17 Gün burada sunulan).
  2. PBabe-puro-Cre retro-Cre virüs enfeksiyonu
    NOT: 3.2.1 adımdaki 0.
    1. Gün 0-Gün 3: Ifade plazmid olarak pBabe-puro-Cre (B3027) kullanarak CENP-A-/F RPE-1 hücrelerinin retrovirüs transfeksiyon gerçekleştirin (ayrıntılar için bölüm 1 bakınız). Blasticidin S'nin (10 μg/mL) kültür ortamına eklenmesini sağlayın.
    2. 4. Gün: Hücreleri plakadan ayırmak için deneyin. Plaka 500 veya 5.000 hücreleri 6-iyi kültür plaka triplicate. DMEM kültür hücreleri: F12 orta% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin.
    3. 5. Gün: Kültür ortamına blasticidin S (10 μg/mL) ekleyin. 5.000 veya 500 hücre kaplaması için, blasticidin S (10 μg/ml) 3-24 gün (14.gün [3.2.7]'ye kadar) veya 3-28 gün (18.güne kadar [3.2.8]) olan hücreleri, yapı ların virüs enfeksiyonundan sonra seçin (pBabe-EYFP-CENP-A yapıları).
      NOT: Bu koloni büyüme sadranında pBabe-puro-Cre transfeksiyonu pBabe-EYFP-CENP-A transfeksiyonu ile birlikte eklenir. pBabe-EYFP-CENP-A transfeksiyonu 3.1'de yapılır. pBabe-puro-Cre transfeksiyonu 3.2.1'de yapılır.
    4. Gün 10 (retro-Cre virüs enfeksiyonu sonra 7 gün): Aynı Gün 10 oluşturur retro-Cre virüs enfeksiyonu ve / veya protein ekspresyonu sonra endojen CENP-A protein tükenmesini onaylamak için batı leke analizi için hücreleri toplamak.
    5. Aynı Gün 10 bölüm 4 açıklandığı gibi batı lekeleme gerçekleştirin. Sonuçlar Şekil 1B'de gösterilmiştir (şerit 5-7).
    6. Eyfp-CENP-A WT ve K124R'ın geri kalan endojen CENP-A alelinin aktivasyonundan 7 gün sonra sentromere lokalize olduğunu doğrulamak için immünororesans analizi (yukarıdaki bölüm 2) yapın. Sonuçlar Şekil 1C-1E'degösterilmiştir. Figure 1
    7. 14. Gün: 5.000 hücre ile tohumlu plaka ile koloni outgrowth tsay gerçekleştirin. Hücreleri 10 dakika metanolve leke için 10 dakika boyunca kristal menekşe çözeltisi (2,3% kristal menekşe, %0,1 amonyum oksalat, %20 etanol (Bkz. Şekil 2B). OpenCFU yazılımını kullanarak koloni sayısını say (Bkz. Şekil 2C).
    8. 18. Gün: 500 hücreli tabak kullanın. 3.2.7'de açıklandığı gibi hücreleri düzeltme ve boyama (Bkz. Şekil 2B). Koloni sayısını say (Bkz. Şekil 2C).

4. PBabe-EYFP-CENP-A kullanarak Batı leke analizi

NOT: Şekil 1B ve Şekil 2A'da belirtilen antikorlar kullanılarak Batı leke analizi için daha önce açıklanan13 yöntemine ve EYFP-CENP-A proteinleri için Malzeme Tablosuna bakınız.

  1. Farklı virüs enfeksiyonu ile yetiştirilen hücreleri lysing proteinleri izole. Daha sonra, SDS PAGE jel bir kuyuda protein 20 μg kullanın. Proteinleri daha önce açıklandığı gibi BIR PVDFmembranınaaktarın 13 .
  2. Kuluçkadan sonra membranı primer-sekonder antikorlarla 3kat yıkayın. İmmünoblot tespiti için kızılötesi görüntüleme sistemi ve/veya kemilüminesans görüntüleyicisi ile membrandaki protein bantlarını tespit edin ve analiz edin. Bu sonuçlar Şekil 1B ve Şekil 2A'dagösterilmiştir.
    1. Kızılötesi görüntüleme sisteminin protein bantlarını algılaması ve analiz etmesi için, Tamamlayıcı kodlama dosyalarındakiadım 4.2.1'e bakın.
    2. Protein bantlarını tespit etmek ve analiz etmek için chemiluminescence imager'ı kullanın, ek kodlama dosyalarındaadım 4.2.2'ye bakın. Bu sistem için, ultra hassas gelişmiş kemilüminesans (ECL) substrat(Tablo Malzemeler)kullanın.
    3. İsteğe bağlı olarak, PVDF membrandan önceden kuluçkaya yatan antikorları soymak ve batı analizinin bir sonraki dönüşü için farklı antikorlarla yeniden lekelemek için batı leke sıyırma tamponu kullanın. Ampirik olarak kullanılacak en iyi kuluçka süresini ve sıcaklığını belirleyin.

5. Hücre Kültürü, transfeksiyon ve in vivo ubiquitylation tahlilleri pQCXIP-EYFP-CENP-A kullanarak

NOT: PQCXIP-vektöründen ifade edilen EYFP-CENP-A protein düzeyi endojen CENP-A protein seviyesinden ~ 10kat daha yüksektir. Bu vektörün kullanımı, EYFP-CENP-A proteinlerinin daha yüksek miktarda immünopredimesini, EYFP-CENP-A'nın her yerde bulunan bantlarının gözlemlemesini ve KÜTLE Spektrometresi analizi ile EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) proteininin ubiquitylation'unun belirlenmesini kolaylaştırır.

  1. PQCXIP-EYFP-CENP-A kullanarak in vivo ubiquitylation tahlilleri için transfeksiyon.
    1. Tohum 36.2 x 105 CENP-A-/F RPE-1 hücreleri 10 cm doku kültürü çanak. %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile yüksek glikozlu DMEM'deki kültür hücreleri.
      NOT: Optimal sonuçlar için, tohumlamada kullanılacak hücre yoğunluğunu ampirik olarak belirleyin. En az 1 mg toplam protein elde etmek için bir immünopremitasyon (IP) numunesi için en az 2 tabak hazırlayın.
    2. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 atmosferinde 18 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
    3. Tohumlamadan sonra saat 17'de transfeksiyon reaktiflerini hazırlayın.
    4. Çözelti a' yı her pQCXIP-EYFP (B3252), pQCXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254), pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256)(Tablo 1) azaltılmış orta 335 μL'lik karışık olarak karıştırarak A çözeltisi yapın, ve 5 dk. Tüm numunelere 6.7 g pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) plazmidi ekleyin.
      NOT: Tüm vektörler Tablo 1'delistelenmiştir.
    5. 10.1 μL transfeksiyon reaktifleri I ve II'yi sırasıyla 335 μL azaltılmış serum ortamına karıştırarak B çözeltisini yapın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
      NOT: İsteğe bağlı bir adım sadece eklemek tir 40.2 μL transfeksiyon reaktifiii (polietilen [PEI]; 1.0 mg/mL) b çözeltisine veya 40.2 μL transfeksiyon reaktifi III eklemek transfeksiyon reaktifleri I ve II çözeltib (Malzeme Tablosu).
    6. A ve B çözeltilerini karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
    7. Kültürlü hücreleri PBS ile bir kez yıkadıktan sonra, 3,35 mL μL azaltılmış serum ortamına sahip 10 cm'lik doku kültürü çanaklarının her birine doğrudan A ve B çözeltilerinin (yani DNA-lipid kompleksi) karışımını ekleyin.
      NOT: Son konsantrasyon 1.67 μg/mL plazmiddir.
    8. Hücreleri 37 °C inkübatörde %5 CO2 ile 4,5 saat kuluçkaya yatırın. 4,5 saat sonra orta yı %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile yüksek glikozlu DMEM olarak değiştirin.
    9. Transfeksiyon sonrası hücreleri %5 CO2 ile %48 h ile 37 °C'de kültürlendirin. Hücre lysates hazırlık için hücreleri toplamak.
  2. Proteinin hazırlanması Anti-GFP antikorile bağlı bir boncuk.
    1. İmmünenyağış (IP) bir reaksiyon için protein A boncuk25 μL (%50 v/v) alın. EtOH'u çıkarmak için tampon A1(Malzeme Tablosu)ile en az 3x yıkayın ve tampon A1 (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; %0.5 Nonidet P-40; %0.5 deoksikorat; %0.5 SDS; 1 mM EDTA; komple EDTA içermeyen protease inhibitör lüzumlu reaktive edici) ile %50 çözüm yapın.
    2. Yukarıda hazırlanan boncuklara 2,0 μL anti-GFP antikor (Anti-76: Ev yapımı antikor) ekleyin ve net boncuk hacmiile karşılaştırarak 10x hacimli tampon A1 ekleyin.
    3. 4 °C'de 4-18 saat uç-uç döndürme gerçekleştirin. Uçtan uca dönüş için en uygun zaman uzunluğu immünopresipitasyonun etkinliğine göre ampirik olarak belirlenmelidir.
    4. Boncukları 1 dk için 100 x g'da santrifüj edin ve bağlanmamış süpernatantı çıkarın. Boncukların %50 (v/v) çözümünü yeniden yapmak için arabellek A1 ekleyin. IP'nin bir reaksiyonu için bu çözeltinin 25 μL'sini (%50 v/v) kullanın.
  3. İmmünopreplit (IP) protein kullanarak Anti-GFP antikor ile bağlı bir sepharose boncuk.
    1. Sonication ve freeze-çözülme işlemi ile tampon A1 adım 5.1.9 elde lyse hücreleri.
    2. Farklı IP örnekleri arasında protein konsantrasyonlarını ölçün ve protein miktarlarını normalleştirin. SDS-PAGE'de %5 Giriş örneği olarak çalıştırmak için her tüpten numunenin %5'ini çıkarın.
      NOT: %5'lik Giriş numunesi bir gün içinde yüklenmezse sıvı nitrojen içinde dondurulabilir ve -80 °C'de stoklanabilir.
    3. %95'lik kısmı 25 μL (%50 v/v) proteinle karıştırın 5.2 adımda hazırlanan anti-GFP antikora bağlı boncuklar. 4 °C'de 4-18 saat uç-uç döndürme gerçekleştirin.
      NOT: Uç-uç dönüş için en uygun zaman uzunluğu ampirik olarak belirlenmelidir.
    4. Santrifüj protein 1 dk için 100 x g ile ona bağlı protein ile boncuklar (yani, immünopeksiitates), ve supernatant kaldırın. 1 dk. 100 x g'de santrifüj ederek immünopeksipititatları tampon A1 ile yıkayın.
    5. Sırasıyla %5 Giriş ve %95 immünopeksipititatları 2x ve 4x SDS-PAGE yüklemetamponu 14ile karıştırın. 5 dakika için bu iki örnek kaynatın ve daha sonra farklı şeritlerde elektroforez için% 10.0 denaturing SDS-poliakrilamid jel üzerine yükleyin. Elektroforez için daha büyük SDS-PAGE jeli (örn. 17 cm x 15 cm) kullanın. Numuneler daha küçük jelde çalıştırılırsa, net/keskin herikide varolma bantlarını gözlemlemek mümkün olmayabilir.
    6. Bir öncekiraporda8'de belirtilen antikorları kullanarak bölüm 4'te açıklandığı şekilde batı leke analizi yapın. Sonuç Şekil 2A'dagösterilmiştir.
    7. PVDF membrandan önceden kuluçkaya yatan antikorları soymak ve batı leke analizinin bir sonraki turu için farklı antikorlarla yeniden lekelemek için batı leke sıyırma tamponunu kullanın.

6. EYFP-CENP-A K124R mutantının ubiquitylation bölgesini belirlemek için kütle spektrometresi

  1. PQCXIP-EYFP-CENP-A kullanılarak kütle spektrometresi analizi için transfeksiyon.
    1. 10 cm doku kültürü çanak tohum CENP-A-/F RPE-1 hücreleri. Hücre yoğunluğunun çanak başına 36,2 x 105 hücre olduğundan kontrol edin. %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile yüksek glikozlu DMEM'deki kültür hücreleri. En az 10 mg toplam protein elde etmek için bir immünopremitasyon (IP) numunesi için en az 20 tabak hazırlayın (bkz. 5.3).
      NOT: En iyi sonuçlar için, tohumlamada kullanılacak hücre yoğunluğunu ampirik olarak belirleyin.
    2. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 atmosferinde 18 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
    3. Tohumlamadan sonra saat 17'de transfeksiyon reaktiflerini ve transfect hücreleri (4.1.3) olarak hazırlayın. Transfected hücrelerpCGN-HA-Ubiquitin (B2806) ve pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256) vardır.
    4. Hücreleri transfeksiyondan sonra 48 saat boyunca %5 CO2 atmosferinde 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Hücre lysates için hücreleri toplamak.
    5. Arabellek A1'deki lyse hücreleri immünopresidasyon (5.2) ve (5.3) olarak gerçekleştirirler. İmmünyağış lysatlarının bu ikisini aşağıdaki (6.1.6) ve (6.1.7) çalıştırın.
      NOT: (6.1.6) olarak, numuneyi standart Tris-glisin jellerinde çalıştırın. (6.1.7), ticari olarak mevcut 4%-12% Bis-Tris protein jelleri örnek çalıştırın. Ayrıca bkz.
    6. EYFP-CENP-A ubikilasyonunu doğrulamak ve bölüm 5'te açıklandığı gibi ubiquitinated EYFP-CENP-A'nın konumunu tam olarak belirlemek için toplam immünopsipitanların %10'u için bir örnek tutun. Bu örneği standart Tris-glisin jellerinde çalıştırın. SDS-PAGE ve western blot (5.3) olarak gerçekleştirildi.
    7. Kütle spektrometresi analizi için toplam immünopprepititantların %90'ı için başka bir örnek daha tutun. Bu örneği ticari olarak mevcut olan %4-12 Bis-Tris protein jellerinin iki kuyusunda çalıştırın. Coomassie mavi solüsyonu kullanarak Coomassie mavi boyama gerçekleştirin. Tüketim ve 50-70 kDa jel bölge kesip (putatif mono-UB-EYFP-CENP-A K124R bölge). Kütle spektrometresi analizi için bu jel bölgesini kullanın.
  2. Jel içi sindirim kullanılarak kütle spektrometresi analizi.
    1. İlginin her bir jel dilimini küçük parçalara (1 mm2)ayırın ve 0,5 mL protein düşük bağlayıcı tüplere yerleştirin.
    2. 25 mM NH4HCO3'te100 μL %50 (v/v) asetonitril ile yıkayın, girdap 10-15 dk, aşağı doğru dön, süpernatant'ı atın, 3x'i tekrarlayın.
    3. Jel parçaları kurutmak için 30 dakika tezgah üstü vakum konsantratörü kullanarak örnek konsantre.
    4. 10 ng/μL sıralama sınıfı tripsin 10 μL ekleyin ve jel parçalarının 5 dakika boyunca susuz kalmasını sağlar.
    5. Jel parçalarını kaplayacak kadar 25 mM NH4HCO3 ekleyin, bir gecede 37 °C'de sindirin.
    6. Sindirilmiş süpernatantı temiz bir 0,65 mL silikonlu tüpe aktarın. %50 (v/v) asetonitril/%5 (v/v) formik asit (30 μL veya yeterli, girdap 10 dakika, spin ve transfer aynı ekstraksiyon tüpüne ekleyin. 3x'i tekrarlayın.
    7. Jel parçaları, girdap 5 dakika için 10 μL asetonitril ekleyin ve aşağı spin. Supernatant'ı aynı tüpe aktarın.
    8. Tezgah üstü vakum konsantratörü kullanarak numuneleri 2 μL'ye yoğunlaştırın, numuneye %8 l 3 (v/v) asetonitril (%2) formik asit, 15 dakika girdap ve 30 dk için 16.000 x g'de aşağı doğru dönme numuneleri kütle spektrometresi analizi için hazırdır.
    9. Ms veri alımını lc-MS/MS ile bir kütle spektrometresi cihazı(Malzeme Tablosu)ile birleşen sıvı kromatografi sistemi(Malzeme Tablosu)kullanarak gerçekleştirin.
    10. Ters faz sıvı kromatografisi (RPLC) sütununa 8 μL yeniden oluşturulmuş numune enjekte edin.
    11. Peptitleri 60 dakika içinde %2-80 degradeli B çözücü ile ayırın. Degradenin 40 dakika içinde %2'den %22'ye, 12 dakika içinde %22 ila %35 çözücü B'ye, sonra 4 dk'da %80 çözücü B'ye tırmandığından ve son olarak son 4 dakika boyunca %80 çözücü B'de tutarak akış hızını 300 mL/nL'de ayarladığından emin olun.
      NOT: Çözücü A %0.1 formik asit ve %2 asetonitril, %0.1 formik asit ve %98 asetonitril içerir. Tüm konsantrasyonlar hacim/hacim olarak gösterilir.
    12. Veriye bağımlı edinme modunu kullanarak kütle spektrometresi verilerini toplayın. Kısaca, 250 ms için 350-1500 m/z MS spektrumları toplamak daha fazla parçalanma için şarj 2-5 ile Top 50 yoğun öncüleri seçin. 100 ms için 100-2000 m/z'de MS/MS spektrumlarını toplayın, öncül iyonları 15 s'lik yeniden seçimden hariç takın.
    13. Veritabanı araması için, masaüstündeki kütle spektrometresi verilerini analiz etmek için ticari yazılımı açın (Bkz. Malzeme Tablosu).
    14. Yeni bir arama yapmak için üst menüdeki "LC" düğmesini tıklayın. Ardından orijinal MS ham veri dosyalarını yüklemek için "Ekle" düğmesini tıklatın.
    15. Veritabanı arama yöntemi olarak "Paragon Metodu" nda "İnsan Protein Kimliği" seçeneğini belirleyin. Orijinal MS ham veri dosyalarını UniProt Homo Sapiens veritabanına karşı arayın (160.566 dizi, http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640 içeren).
    16. Arama parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: sindirim enzimi olarak tripsin'i seçin, peptid başına en fazla 3 eksik dekolte, 4 modifikasyon ve 2-5 şarj bekleyin. İlk arama için dakikada 20 sayfaya, parçalanmış iyonlar için 0,02 Da'ya kadar kütle hatası ayarlayın. Protein, peptit ve modifikasyon bölgeleri için yanlış bulma oranı (FDR) eşikleri %1'den az belirtin. Yazılımdaki diğer tüm parametreleri varsayılan değerlere ayarlayın (kütle spektrometresi analizi için Şekil 3'e bakın).
    17. Üst menünün sağındaki "Olarak Kaydet" düğmesine tıklayın, arama sonuçlarını depolamak için bir klasör seçin, arama adını girin ve "Kaydet" düğmesine tıklayın.
    18. Aramayı başlatmak için üst menünün sağındaki "İşlem" butonuna tıklayın. Arama sona erdikten sonra, girilen arama adı içeren veriler otomatik olarak seçilen klasörde depolanır. Veriler Yazılım F tarafından kolayca açılabilir.
    19. Herhangi bir peptidin MS/MS spektrumlarını elde etmek için, Yazılım F ile açmak için arama sonuçlarını çift tıklatın. İlk olarak, menünün üst kısmındaki protein listesindeki proteine tıklayın, ardından menünün ortasındaki peptid'e tıklayın. Bu peptidin MS/MS'si menünün alt kısmında gösterilir.
    20. MS/MS spektrumunu dışa aktarmak ve kaydetmek için, menünün altındaki MS/MS spektrumlarına sağ tıklayın, kopyala'yı seçin ve ardından PPT veya doc. biçimi gibi uygun bir dosyaya yapıştırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

EYFP-CENP-A K124 mutant her yerde gösterir, HJURP ile etkileşim, ve centromere lokalizasyonunda hiçbir kusur ne hücre öldürücü. Burada Fachinetti et al. (2017)6 tarafından bildirilen sistem yeniden oluşturuldu: diploid insan (RPE-1) hücrelerinde bir bozulmuş ve bir ''floxed'' CENP-A alel(CENP-A-/F),EYFP-CENP-A pBabe-EYFP retrovirus vektörü ifade edildi. Bu sistemde, CENP-A-/F alel endojen CENP-A ifadesi Cre rekombinaz

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada EYFP-CENP-A K124R mutant ın ubiquitylation belirlemek için kütle spektrometresi analizi yöntemleri açıklanan EYFP etiketleme CENP-A K124R mutant protein8farklı bir lizin de ubiquitylation indükler düşündüren . Sonuçlarımızda, EYFP-CENP-A K124R'da lizin 306 (K306) üzerinde, kütle spektrometresi analizi ile CENP-A'da lisin 56 (K56) ile karşılık gelen her yerde başarılı bir şekilde saptandı. Burada açıklanan kütle spektrometresi analizi, daha önce CENP-A WT-Flag12'ninli...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.

Teşekkürler

Biz Model Hayvan Araştırma Merkezi' nde Chao-Jun Li teşekkür, Nanjing Üniversitesi kütle spektrometresi analizi için. Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa ve Model Hayvan Araştırma Merkezi, Nanjing Üniversitesi ve Greehey Çocuk Kanser Araştırma Enstitüsü'ndeki mevcut araştırmacılara yararlı tartışmaları, deneysel rehberlikleri ve reaktifleri için teşekkür ederiz. Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago ve Dawn S. Chandler'a cömert reaktif hediyeleri için teşekkür ederiz. Y.N., Jiangsu Eyaleti ''Double- First-Class'' İnşaat Fonu tarafından desteklendi. Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Fonu (SBK2019021248), Jiangsu Eyaleti 16Altı Büyük Yetenek Peaks Fonu (TD-SWYY-001), Jiangsu Eyaleti "Yabancı Uzman Yüz Yetenekler Programı" Fonu (SBK2019010048) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31970665). Bu çalışma kısmen NCI hibe R21 CA205659 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
< güçlü > Ekipmanlar / Aletler< / güçlü >
0.5 ml protein düşük bağlayıcı tüplerEppendorf022431064Kütle spektrometresi analizi için
10 cm hücre kültürü kabıBIOFIL/JET, Çin70022410 cm doku kültürü kabı (Yohei lab, PN63)
6 Kuyulu Hücre Kültürü KümesiFisher/Corning Incorporated07-200-836 oyuklu kültür plaka
CentriVapLABCONCO-Kütlespektrometresi analizi için vakumlu kuru peptitler için tezgah üstü vakum yoğunlaştırıcı
ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 & mu; mEksigent Technologies805-00120Kütle spektrometresi analizi için sıvı kromatografisi (RPLC) kolonu
HCX PL APO 100x yağa daldırma lensiLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 YAĞ PHE100X Yağa daldırma lensi
HCX PL APO 63x yağa daldırma lensiLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 YAĞ PH 3 CS63X Yağa daldırma lensi
Immobilon-FL PVDF Transfer MembranıEMD KırlangıçIPVH00010Western blot
için Leica DM IRE2 motorlu floresan mikroskobuLeicamotorlu floresan mikroskobu
Leica EL6000 kompakt ışık kaynağıLeicaFloresan uyarma için harici ışık kaynağı
Mikro Kapak camı (22 mm x 22 mm)Surgipath105Kapak camı (22 mm x 22 mm)
Model V16-2 poliakrilamid jel elektroforez aparatıApogee Elektroforezi/CORE Yaşam Bilimleri31071010Daha büyük SDS-PAGE jel nanoLC.2D uygulamak için Jel elektroforez aparatı I
EksigentTechnologies-kütlespektrometresi analizi için sıvı kromatografi sistemi
NuPAGE %4-12 Bis-Tris Protein JelleriThermo FisherNP0335BOX Kütle spektrometresi analizi için ticari olarak temin edilebilen %4-12 Bis-Tris protein jelleri
Olympus FLUOVIEW FV3000 konfokal lazer tarama mikroskobuOlympus-Konfokal lazer tarama mikroskobu (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ indirme/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 Degital CCD kameraHamamatsuC10600-10BCCD kamera
PAP KalemBağlama YeriAD100.1İmmünofloresan boyamada su itici bariyer
için DOKU KÜLTÜR KAPLARI 10CMVWR25382-16610 cm doku kültürü kabı
Jel çalışması için dikey elektroforez (büyük boy)Junyi, ÇinJY-SCZ6Jel elektroforez aparatı II, daha büyük SDS-PAGE jeli uygulamak için (Yohei laboratuvarı, PE23)
VWR Mikro Slaytlar, BuzluVWR International48312-013Mikro slaytlar
Birincil antikorlar
Anti-CENP-A antikoruStressgen/Enzo Yaşam BilimleriKAM-CC006Fare monoklonal antikoru
Anti-CENP-B antikoruNovus BiologicalsH00001059-B01PFare monoklonal antikoru
anti-GAPDHABCAMab37168Tavşan poliklonal antikoru anti-GAPDH
InvitrogenPA1987Tavşan poliklonal antikoru
anti-GFP antikoruANTI # 76 (Ev yapımı antikor)Tavşan poliklonal antikoru
anti-HA (3F10)Roche11815016001Sıçan monoklonal antikoru
anti-HJURPProteintech Grubu15283 ve ndash; 1-APTavşan poliklonal antikoru
anti-UbiquitinBethyl LaboratuvarlarıA300-317A-1Tavşan poliklonal antikoru
Reaktifler
Bio-Rad Protein TestiBio-Rad500-0006Protein konsantrasyonunun ölçümü için ticari protein tahlili reaktifi I (%0.1 SDS ile uyumlu)
Branson SONIFIER 450Sonikatör
Branson Ultrasonik sonikatör Microtip Adım, Katı, Dişli 9.5 mmVWR Scientific Products Inc.33995-325Sonikasyon için bozucu korna
Branson Ultrasonik sonikatör Microtip Konik 6.5 mmVWR Scientific Products Inc.33996-185Sonikasyon için Mikrouç
Tampon A1-20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; % 0.5 Nonidet P-40; % 0.5 deoksikolat; % 0.5 SDS; 1 mM EDTA; tam EDTA içermeyen proteaz inhibitör reaktifi
Komple EDTA içermeyen proteaz inhibitör kokteyliRoche11-873-580-001Tampon A1 için komple EDTA içermeyen proteaz inhibitörü reaktifi
Coomassie parlak mavi R-250BBI Yaşam BilimleriKütle spektrometresi analizi için CAS 6104-59-2Coomassie mavisi çözeltisi
Kristal viyole çözeltisi (%2.3 kristal viyole, %0.1 amonyum oksilat, %20 etanol)SigmaI-AldrichHT90132-1LKoloni boyama için
DAPISIGMA-SLDRICHD9542Nükleer boyama için
DMEM: F12 OrtaATCC30-2006DMEM: F12 Orta Fetal
Sığır Serumu, sertifikalı, ısı inaktive edilmiş, ABD menşeiliLife Technologies/Gibco10082FBS (fetal sığır serumu)
Yüksek glukozlu DMEM (Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s medium)Life Technologies / BioWhittaker12-604yüksek glikozlu DMEM
Lipofectamin 3000Life Technologies / InvitrogenL3000Kimyasal transfeksiyon için transfeksiyon reaktifi I
Lipofectamin 3000, P3000 çözeltisiLife Technologies / InvitrogenL3000Transfeksiyon reaktifi II
MetanolFisherA412-4Fiksasyonu reagant
Yağsız süt tozu (karanfil süt tozu için onaylanmış ikame)Fisher ScientificNC9255871 (Yeniden Sipariş No. 190915; Lot # 90629)Yağsız yağsız süt
Opti-MEM ILife Technologies / Invitrogen31985Azaltılmış serum ortamı
p-fenilendiaminSIGMA-SLDRICHP6001Orta
Penisilin, Streptomisin montajı için; SıvıFisher/Gibco15-140Penisilin-streptomisin
Poli-L-Lizin ÇÖZELTİSİSIGMA-SLDRICHP 8920Poli-L-Lizin, %0.1 w/v, suda
Polietilenimin [PEI]; 1.0 mg / mlPolysciences23966– 2Kimyasal transfeksiyon için transfeksiyon reaktifi III
Protein A sefaroz CL-4B boncuklarıGE Healthcare/Amersham17-0963-03pQCXIP-EYFP-CENP-A kullanarak in vivo ubikitilasyon deneyleri için Protein A sefaroz CL-4B boncukları
Blot Sıyırma Tamponunu Geri YükleThermo ScientificPI21059Western Blot Sıyırma Tamponu I
Sıralama sınıfı tripsinPromegaV5111Kütle spektrometresi analizi için
SuperSignal West Femto Maksimum Hassasiyetli YüzeyThermo34095Ultra hassas geliştirilmiş kemilüminesan (ECL) substrat
UltraPure Damıtılmış SuLife Technologies/Invitrogen/Gibco10977Steril doku kültürü dereceli su
Western Blot Sıyırma Tamponu II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; %2 SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Merkaptoetanol)--Western Blot Sıyırma Tamponu II
güçlü>İkincil antikorlar
Alexa Fluor 488 Keçi Anti-Tavşan IgG LifeTechnologies/InvitrogenA11008florofor konjuge ikincil antikor (Afinite saflaştırılmış ikincil antikor)
Alexa Fluor 594 Keçi Anti-Fare IgGYaşam Teknolojileri/InvitrogenA11005florofor konjuge ikincil antikor (Afinite ile saflaştırılmış ikincil antikor)
Softwares
Acquisition FV31S-SW yazılımıOlympus-SofwareC1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ indirme/#!dlOpen=%23detail847250519)
Analiz FV31S-DT yazılımıOlympus-Yazılım C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ indirme/#!dlOpen=%23detail847250519)
cellSens Dimension yazılımı Sürüm 1. 18Olympus-SofwareC3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ yazılımı/cellsens/)
Image Studio Analiz Yazılımı Sürüm 4.0LI-COR Biosciences-YazılımD
Moleküler Görüntüleyici Versadoc MP4000 SistemiBio-Rad-İmmünoblot tespiti için kemilüminesans görüntüleyici
Odyssey CLx Kızılötesi görüntüleme SistemiLI-CORtespiti için kızılötesi görüntüleme sistemi
OpenCFU güvenlik yazılımı-Koloni sayımı için (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab sürüm 5.5.2. Bilimsel Görüntüleme YazılımıImprovision/PerkinElmer-Software
A ProteinPilot Yazılımı sürüm 4.5AB SCIEX-Kütlespektrometresi analizi için Yazılım F
Miktar Bir 1-D analiz yazılımıBio-Rad-YazılımE
TripleTOF 5600+ SistemAB SCIEX-Kütlespektrometresi cihazı
Volocity sürüm 6.3 3D Görüntü Analiz Yazılımı (Volocity Acquisition)PerkinElmer-SoftwareB1
Volocity versiyon 6.3 3D Görüntü Analiz Yazılımı (Volocity Quantification)PerkinElmer-SoftwareB2
+ Kimyasal transfeksiyon için Western < Biosciences-İmmünoblot

Kaynaklar

  1. Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
  2. Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell. 137 (3), 472-484 (2009).
  3. Bernad, R., et al. Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly. J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).
  4. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
  5. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions. Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).
  6. Fachinetti, D., et al. CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres. Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).
  7. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).
  8. Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability. Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).
  9. Srivastava, S., Foltz, D. R. Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction. Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).
  10. Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly. Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).
  11. Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80. Journal of Visualized Experiment. (99), e52482(2015).
  12. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
  13. Niikura, Y., Kitagawa, K. Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins. Journal of Visualized Experiment. (109), e53732(2016).
  14. Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR. Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).
  15. Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling. Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).
  16. Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Ubikitilasyon Tanımlamaİmmünopresipitasyon ProtokolüLC-MS/MS AnaliziJel Kesme YöntemiTrypsin SindirimiProtein A BoncuklarıAnti-GFP AntikoruSentromer Kimliği
EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) Ubiquitylation tanımlamak için Kütle Spektrometresi Analizi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.