Bu protokol, canlı hayvan intravital mikroskopisi kullanılarak CCL5 aracılı periosteal iskelet kök hücre göçünün gerçek zamanlı olarak saptanmasıdır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Farelerde Periosteal İskelet Kök Hücrelerinin CCL5 Kaynaklı Göçünün Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Periosteal iskelet kök hücreleri (P-SSC' ler) ömür boyu kemik bakımı ve onarımı için gereklidir, bu da onları kırık iyileşmesini artırmak için tedavilerin geliştirilmesi için ideal bir odak noktası haline getirir. Periosteal hücreler, kırık iyileşmesi için yeni kondrositler ve osteoblastlar sağlamak için hızla bir yaralanmaya göç eder. Geleneksel olarak, bir sitokinin hücre göçünü teşvik etme etkinliği sadece transwell veya scratch tahlil yapılarak in vitro olarak gerçeklenmiştir. Multifotoni ekscitasyonu kullanılarak intravital mikroskopideki gelişmelerle, yakın zamanda 1) P-SSC'lerin göçmen geni CCR5 ve 2) CCL5 olarak bilinen CCR5 ligand ile tedavinin kırık iyileşmesini ve CCL5'e yanıt olarak P-SSC'lerin göçini iyileştirdiği keşfedilmiştir. Bu sonuçlar gerçek zamanlı olarak yakalandı. Burada açıklanan, CCL5 ile tedavi edildikten sonra kalvarial dikiş iskelet kök hücresi (SSC) nişinden yaralanmaya doğru P-SSC geçişini görselleştirmek için bir protokoldür. Protokol, bir fare kısıtlaması ve görüntüleme montajının yapımını, fare kalvarisinin cerrahi olarak hazırlanmasını, bir calvaria kusurunun indüksiyonunu ve zaman atlamalı görüntülemenin kazanılmasını detaylandırıyor.
Giriş
Kırık onarımı embriyonik iskelet gelişimi ve tadilattan farklı dinamik, çok hücreli bir süreçtir. Bu süreçte, hasarlı dokudan gelen yaralanma sinyallerinin indüksiyonunu, kırıkların genel stabilitesi ve sabitlenmesi için kritik öneme sahip olan iskelet sapı/progenitör hücrelerinin hızlı bir şekilde işe alınması, çoğalması ve daha sonra farklılaşması takip eder1. Özellikle, kırık iyileşmesinin erken aşamaları, esas olarak periosteal yerleşik hücrelere atfedilen yumuşak nasır oluşumunu gerektirir2. Kemikler yaralandığında, periosteal hücrelerin bir alt kümesi hızla yanıt verir ve callus3 içindeki ye....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm fareler patojen içermeyen koşullarda muhafaza edildi ve tüm prosedürler Baylor College of Medicine'ın Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.
1. Fare hazırlığı
- Cross Mx1-Cre17 ve Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 fare (Jackson Laboratuvarı'ndan satın alındı) αSMA-GFP fareleri ile (burada Drs tarafından sağlanmıştır). Ivo Kalajzic ve Henry Kronenberg) Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) muhabir fareleri üretmek için (
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İskelet atalarının göçmen veya dolaşım potansiyeline sahip olduğu önerilmiştir20. Son zamanlarda, Mx1-Cre +Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) muhabir fareleri üretildi ve P-SSC'ler Mx1+α SMA+ çift etiketleme ile işaretlendi (Şekil 2A,B). Mx1+α SMA+ P-SSC'lerin önemli göçü 24-48 saat y.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Kemik iyileşmesi sırasında periosteal hücreler, bir yaralanma callusu içinde yeni farklılaşmış kondrositlerin ve osteoblastların ana kaynağıdır3. Kemik iliğine benzer şekilde periosteum4,5,6'da osteojenik/kondrojenik SSC'ler de tanımlanmıştır. Endojen P-SSC fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek teknik olarak zordur. Genellikle, SSC'lerin göçmen dinamikleri in vitro olarak değerlendirilir ve karşılık ge.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
L.C.O. ve D.P., "Kemik Onarımında Periosteal İskelet Kök Hücreleri" (BAYM) başlıklı bekleyen bir patenti açıkladılar. P0264US. P1). Geri kalan yazarlar rakip çıkar beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Bu çalışma Teksas Kemik Hastalıkları Programı Ödülü, Caroline Wiess Hukuk Fonu Ödülü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri NIAMS tarafından R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 to D.P. BCM Optik Görüntüleme ve Vital Mikroskopi Çekirdeği'ndeki M.E. Dickinson ve T.J. Vadakkan'a ve NIH (AI036211, CA125123 ve DK056338) fonlarıyla BCM İleri Teknoloji Çekirdeklerine teşekkür ederiz.
.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| ½ ” optik direk | ThorLabs | TR2 | Görüntüleme montajı için |
| 1 mL şırınga | BD | 309659 | |
| 27G iğne | BD PercisionGlide 305111 | ||
| 29G insülin şırıngası | McKesson | 102-SN05C905P | |
| 50 mL konik tüp | Falcon | 352098 | Fare kısıtlaması için |
| Ayarlanabilir açılı plaka | Renishaw | R-PCA-5023-50-20 | Görüntüleme montajı için |
| Alkollü mendiller | Coviden | 6818 | |
| betadin cerrahi önlük | Henry Schen | 67618-151-16 | |
| Buprenorfin SR-LAB | ZooPharm | 1mg/mL Sürekli Salım | |
| Combo III | Personel veterinerinden elde edilen | /A | 37.6 mg/mL Ketamin; 1.9 mg / mL Ksilazin; 0.37 mg / mL Asepronazin |
| Lamel | Fisher | 12-545-87 | 24 x 40 premium superslip |
| İnce uç forcepts | FST | 11254-20 | |
| Ketamin | KetaVed | 50989-161-06 | 100 mg / mL |
| Leica TCS SP8MP DM6000CFS | Leica Microsystems | N/A | |
| Matrigel | R & D Systems | 344500101 | |
| Tıbbi bant | McKesson | 100199 | 3" x 10 yds (7,6 cm x 9,1 m) |
| Metoselüloz | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 19560 | |
| Mikrodiseksiyon makası | FST | 1456-12 | |
| Motorlu kademe | Anaheim otomasyonu | N/A | |
| İğne tutucu | FST | 12500-12 | |
| Emilemeyen sütürler | McKesson | S913BX | monofilament naylon 5-0 emilmeyen sütürler takılı C-1 ters kesme iğnesi |
| Oftalmik merhem | Rugby | 0536-1086-91 | |
| RANTES | Biolegend | 594202 | 10 & mikro; G/50 ve Mikro; L |
| ½ için dik açılı kelepçe; ” Gönderi, 3/16" Hex | ThorLabs | RA90 | Görüntüleme montajı için |
| Yaylı 3/16" Altıgen kilitleme ve frak14; ” kelebek vida | ThorLabs | TS25H | Görüntüleme montajı için |
| Steril pamuklu çubuklar | Henry Schen | 100-9249 | |
| Steril DPBS (1x) | Corning | 21-030-CV | |
| Steril örtüler | McKessen | 25-517 | |
| Cerrahi eldivenler | McKessen | 3158VA | |
| Üçlü antibiyotik merhem | Taro Pharmaceuticals USA, Inc. | 51672-2120-2 | |
| Vacutainer kan alma seti | BD | REF 367298 | 12 "tüplü 25G kelebek iğne infüzyon seti |
Kaynaklar
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture. ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
