Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Otomatik Dondurucu Değirmeninde Kriyogrinding ile Hücre Ekstrelerinin Hazırlanması

8.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61164

⸱

29 Ocak 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Florida State University College of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Biz bozulma ve proteinlerin denatürasyonu en aza indirgeyen bir kriyojenik dondurucu değirmen kullanarak maya veya diğer hücrelerden tüm hücre özleri hazırlanması için güvenilir bir yöntem açıklar. Hücre ekstreleri fonksiyonel protein komplekslerinin saflaştırılması, proteomik analizler, ko-immünopresipite çalışmaları ve labile protein modifikasyonlarının saptanması için uygundur.

Özet

Genetik manipülasyon kolaylığı ve tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae ökaryotik hücresel makine güçlü evrimsel koruma önde gelen bir genetik model organizma yaptı. Ancak, verimli protein izolasyonu hücrelerin optimal bozulmasına bağlı olduğundan, hücresel proteinlerin biyokimyasal analizi için maya kullanımı enzimatik olarak sindirimi pahalı olan hücre duvarı tarafından engellenir (liticase veya zimolyase kullanarak), ve mekanik olarak bozması zor (geleneksel boncuk çırpıcı kullanarak, bir Fransız presi veya kahve öğütücü) örneklerin ısıtılmasına neden olmadan, bu da protein denatürasyon ve bozulmaya neden olur. Sıvı azot (LN2)altında maya hücrelerinin harç ve havaneli kullanılarak elle öğütülmesi numunelerin aşırı ısınmasını önlese de, emek yoğundur ve operatörler arasında hücre lysis'inde değişkenliğe maruz kalır. Uzun yıllar boyunca, biz başarıyla otomatik bir dondurucu değirmenhücrelerinin kriyogrinding kullanarak yüksek kaliteli maya özleri hazırlanıyor. LN2 kullanımı ile elde edilen -196 °C'lik sıcaklık biyolojik materyali proteazlar ve nükleazlar tarafından bozulmasına karşı koruyarak bozulmamış proteinlerin, nükleik asitlerin ve diğer makromoleküllerin alınmasını sağlar. Burada bu tekniği ayrıntılı olarak "patlamış mısır" olarak bilinen hücrelerin dondurulmuş damlacıkları oluşturmak için LN2 içine damla akıllıca eklenmesi ile bir lysis tampon hücrelerin in bir süspansiyon dondurma içeren maya hücreleri tomurcuklanma için açıklar. Bu patlamış mısır sonra yavaş yavaş çözülür ve çözünmez enkaz kaldırmak için santrifüj ile açıklığa kavuşturulmuş bir dondurulmuş "toz" özü oluşturmak için bir dondurucu değirmende LN2 altında pulverize edilir. Elde edilen ekstreler protein veya nükleik asit saflaştırma, proteomik analizler veya ko-immünoprepitasyon çalışmaları gibi downstream uygulamaları için hazırdır. Bu teknik, çeşitli mikroorganizmalar, bitki ve hayvan dokuları, mercanlar da dahil olmak üzere deniz numuneleri ve adli ve permafrost fosil örneklerinden DNA/RNA izole etmek için hücre ekstresi hazırlanması için yaygın olarak uygulanabilir.

Giriş

Maya protein çalışmaları için popüler bir model organizma, bu araştırmacılar için kullanılabilir genetik ve biyokimyasal araçların bir bolluk ile basit bir ökaryotik organizma olduğu gibi1. Sağlam hücre duvarlarından dolayı, araştırmacıların karşılaştıkları bir zorluk, hücresel içeriklere zarar vermeden hücreleri verimli bir şekilde dinleyerek. Enzimatik lysis (zimolyaz)2,3, kimyasal lysis4, fiziksel lysis donma-çözülme5, basınç tabanlı (Fransız basın)6,7, mekanik (cam boncuk, kahve öğütücü)8,9, sonication tabanlı10 ve kriyojenik2,11içeren maya hücrelerinin bozulması yoluyla protein özleri elde etmek için farklı yöntemler mevcuttur . Hücre lisisinin ve protein veriminin etkinliği kullanılan tekniğe bağlı olarak önemli ölçüde değişebilir, böylece lysate için istenilen downstream uygulaması için sonuç veya uygunluk etkiler. Kararsız, geçici çeviri sonrası modifikasyonları olan veya ısıya duyarlı proteinleri incelerken, hazırlık sırasında numune kaybını veya bozulmasını en aza indirecek bir yöntem kullanmak özellikle önemlidir.

Özü hazırlama tekniğiŞeyAvantaj -larıDezavantaj -larıAkış aşağı analiziBaşvuru
Fransız basını: Zymolyase kullanılarak enzimatik ön işlem ile yüksek basınçlı homogenizer (diğer adıyla Mikroakışkanlaştırıcı)Zymolyase-20T, mikroakışkan yüksek basınçlı homojen. Kırıcı, hava tahrikli, yüksek basınçlı pompa (oran 1:250; gerekli hava basıncı 0.6-l MPa) ve ek bir geri basınç ünitesi ile özel bir bozulma odası oluşur. İşlem için en az 20 mL numune boyutu gereklidir.Kombine protokol kullanılarak elde edilen nihai toplam bozulma 95 MPa basınçta 4 geçişle %100'e yaklaşırken, Zymolyase olmadan sadece homojenizasyon kullanılarak 95 MPa'da 4 geçişle sadece %32'lik bir bozulma yaşandı.Küçük ölçekli uygulamalar için uygun değildir. Enzimler büyük ölçekli preparatlar için pahalı alabilirsiniz.Protein arınması6
Boncuk çırpıcı: Zymolyaz e-misli bir fastprep aletinde cam boncuklarla lysed işlenmiş hücrelerKabaca eşit hacimde soğuk, kuru, asitle yıkanmış 0,5 mm cam boncuk, lysis tamponundaki belirli bir hücre peleti hacmine eklenir ve hücreler güçlü manuel ajitasyon ile bozulur.Özellikle protein arınması yerine, atasözü amacıyla birçok farklı küçük maya kültüründen özler yaparken yararlıdır.Cam boncuk işlemi sırasında, proteinler sert protein denatürasyonuna yol açan geniş köpük neden sert tedavi edilir. Hücre kırılması miktarı değişirken, proteozis ve proteinlerin modifikasyonu mekanik kırılma sırasında ekstrenin 4°C'nin üzerinde ısınmasından kaynaklanabilir.Çoğunlukla DNA ve RNA analizleri, aynı zamanda jel elektropheorez denaturing tarafından protein analizi, ya da Batı lekeleme olmadan.8
Ozmotik şok ve Dounce homojenizasyon kombinasyonu kullanılarak izlenme ardından zimolyaz tedavisiHücre duvarlarının enzimatik sindiriminden sonra, spheroplastlar bir Dounce homogenizer'de 15-20 vuruşluk dar bir havanele (açıklık 1-3 μm) ile lizededilir.BJ926 veya EJ101 gibi proteease-eksik suşları kullanmak için avantajlı. Bu maya hücrelerini kırmak için en nazik yoludur ve bu nedenle karmaşık enzimatik işlevleri (örneğin, çeviri, transkripsiyon, DNA çoğaltma) yürütebilir ve hangi makromoleküler yapıların bütünlüğü (örneğin, ribozomlar, splicesomes) muhafaza edilmelidir özleri hazırlamak için en uygundur. Kromatin çalışmaları (Bloom ve Carbon, 1982) veya nükleer protein özleri için kullanılabilen sağlam çekirdeklerin izole edilmesinde de yararlıdır (Lue ve Kornberg, 1987).Spheroplast lysis prosedürünün en büyük dezavantajları, özellikle büyük ölçekli preparatlar için (>10 litre) nispeten sıkıcı ve pahalı olması ve uzun kuluçka süreleri proteoziz veya protein modifikasyonuna yol açabilir.  Kromatin preparatları için, diferansiyel santrifüj (nükleozom merdiven bütünlüğüne dayalı) tarafından üretilenlerden farklı veya daha düşük kalitede dir.Kromatin çalışmaları için bozulmamış çekirdekleri izole etmek, karmaşık enzimatik işlevleri yerine getirebilen ekstreler,
makromoleküler yapılar, nükleer protein özleri.		2
Bir harç/havaneli veya blender kullanarak Sıvı Azot taşlama tarafından flaş dondurulmuş hücrelerin Hücre BozulmasıHücreler hemen sıvı nitrojen içinde dondurulur ve daha sonra bir havaneli kullanarak bir harç elle öğütülerek, ya da sıvı azot varlığında bir Waring blender kullanılarak lysed.Protokol hızlı ve kolay. Bu çok büyük kültürler de dahil olmak üzere maya hücrelerinin değişen miktarlarda barındırabilir. En büyük avantajı, hücrelerin aktif olarak büyüyen durumdan hemen sıvı nitrojene (−196°C) alınması, proteazlar ve nükleazlar gibi bozunatif enzim aktivitelerinin azalması ve proteinleri (örn. fosfatazlar ve kinases) değiştiren aktivitelerdir. Özellikle büyük ölçekli protein arıtma için tek bir maya kültüründen bütün hücre özleri yapmak için uygundur.Biraz dağınık ve dikkatsiz araştırmacı için potansiyel olarak tehlikeli. Küçük numuneler (yani, 10- 100 ml maya kültürleri) kolayca işlenmez, çünkü blender'da etkili bir şekilde kırılmak için yeterli dondurulmuş hücre kümeleri kütlesi yoktur. Tek tek numuneleri işlemek ve kullanımlar arasındaki ekipmanı temizlemek zaman alır.Büyük ölçekli protein arınması için tek bir maya kültüründen bütün hücre özleri.2
Otolsis, Boncuk değirmenipH 5.0, 50 °C, 24 saat, 200 devir / Ø 0.5 mm, 5 × 3 dk/3 dkÖzellikle küçük ölçekli ekstre hazırlama için hızlı ve verimli bir şekildeIsı üretimi makromoleküllerin denatürasyonuna ve bozulmasına yol açar. Boncuk dayak ekipmanları gerekli.Küçük ölçekli analizler.10
Otolsis, SonicationpH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 rpm, 4 × 5 dk/2 dk, pulser %80, güç %80Sonication ekipman genellikle çoğu kurumda mevcuttur.Isı üretimi makromoleküllerin denatürasyonuna ve bozulmasına yol açar. Sonication ekipman gerekli. Yavaş lysis 24 saatten fazla sürebilir.Maya hücre duvar hazırlıkları.
Kaynama ve donma-çözülme işlemiStandart bir dondurucu ve ısıtma bloğu veya sıcak su banyosu dışında özel ekipman gerekli değildir.Verimli, tekrarlanabilir, basit ve ucuz.Isı üretimi makromoleküllerin denatürasyonuna ve bozulmasına yol açar.PCR tarafından DNA analizi.5

Tablo 1: Maya özlerinin hazırlanmasında kullanılan yöntemlerin karşılaştırılması.

Kriyogrinding (aka kriyojenik taşlama / kriyojenik frezeleme) genellikle nicel veya nitel analizler için güvenilir bir şekilde sıcaklığa duyarlı örneklerden nükleik asitler, proteinler veya kimyasallar almak için kullanılır. Biyoteknoloji, toksikoloji, adli tıp12,13,çevre bilimi, bitki biyolojisi14 ve gıda bilimi gibi çeşitli alanlarda birçok uygulama için başarıyla kullanılmaktadır. Bozulmamış biyolojik makromoleküllerin izolasyonu genellikle sıcaklığa bağlıdır. Son derece düşük sıcaklıklar proteazların ve nükleazların inaktif kalmasını sağlar ve bu da sonraki analizler için bozulmamış proteinlerin, nükleik asitlerin ve diğer makromoleküllerin güvenilir bir şekilde izole edilmesini sağlar. Gerçekten de, bir dondurucu değirmeni tipik olarak -196 °C (LN2kaynama noktası) bir örnek sıcaklığı korur, böylece DNA / RNA veya protein denatürasyonu ve bozulmaen en aza indirir.

Dondurucu değirmeni, paslanmaz çelik uç fişler arasında toz haline getirilecek numuneyi içeren bir şişe içinde katı metal bir çubuğu veya silindiri hızla ileri geri hareket ettiren bir elektromanyetik taşlama odası kullanır. Alet, taşlama odası içinde bir manyetik alan oluşturur ve hızla tersine çevirir. Manyetik alan ileri geri kayıyorgibi, mıknatıs fişlere karşı örnek ezerek 'kriyogrinding' ve patlamış mısır pulverization elde. Dondurucu değirmeni harç ve havanelinin yerini alır ve birden fazla numunenin (veya aynı anda en fazla 4 küçük numunenin) yüksek tekrarlanabilirlik ile sıralı olarak işlenmesine izin verir ve manuel taşlama ile ilişkili kullanıcı-kullanıcı değişkenliğini önler. Örnekler işlendikten sonra, hücre ekstreleri çeşitli akış aşağı uygulamaları için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Maya Patlamış Mısır Hazırlanması

  1. YPD ortamının 0,5 L'lik maya hücrelerini 1 x 107 hücre/mL yoğunluğuna kadar büyütün. Coulter Sayacı veya başka bir yol kullanarak hücreleri sayın.
  2. 2.400 g ve 4 °C'de 10 dk santrifüj hücreleri.
  3. Her numuneyi 500 mL buz gibi deiyonize 18 mega Ohm Milli-Q su ile bir kez yıkayın.
  4. 15 mL buz gibi Lysis Tamponunda resuspend peletleri [20 mM HEPES-KOH pH 7.5, 110 mM KCl, %0.1 Ara, gliserol, taze eklenen azaltıcı ajan 10 mM β-merkaptoetanol, proteaz inhibitörü kokteyli, 10 μM proteozom inhibitörü MG-132, 1 mM deasetlaz inhibitörü sodyum bütirat ve fosfataz inhibitörleri (1 mM sodyum vanatrat, 50 mM sodyum florür, 50 mm sodyum β-gliserfofos]. Ek ayrıntılar için Malzemeler Tablosuna bakın. Örnekler bir sonraki adım için hazır olana kadar yeniden askıya alınmış hücreleri buzüzerinde tutun.
    NOT: Çok çeşitli iyonik olmayan deterjanlar içeren çok çeşitli lisis tamponları, alt akım uygulamasına dayalı olarak içerdiği numuneler ve özel inhibitörlerle kullanılabilir. Proteaz ve proteazomal inhibitörlerin dahil edilmesi protein bozulmasını önlemek için çok önemlidir, özellikle de ekstreler çözüldükten sonra.
  5. Yavaş yavaş bir veya daha fazla 50 mL santrifüj tüpler kuru buz üzerinde tutulan ve jant hemen altında kadar LN2 ile dolu içine önceden soğutulmuş serolojik pipet kullanarak bir seferde hücre süspansiyon bir damla ekleyerek snap dondurulmuş maya patlamış mısır olun. Hızlı buharlaşma nedeniyle kaybını telafi etmek için sık sık tüp sıvı nitrojen kadar top. Azot boğulması ile ilgili tehlikeleri önlemek için iyi havalandırılan bir alanda çalışın.
    1. 50 mL'lik bir tüp yerine, patlamış mısır hazırlığı için birbirine bağlanmış birden fazla 50 mL tüp (veya kriyojenik sıcaklıkları tolere edebilen büyük plastik santrifüj şişesi gibi büyük ağızlı herhangi bir kap) kullanın(Şekil 1A). Büyük konteyner ve açılması, daha kolay bu büyük agregalar oluşturmak için patlamış mısır kümeleme önler gibi patlamış mısır hazırlanmasıdır. Patlamış mısır için 0,3-0,5 cm'lik bir boyut aralığı, dondurucu değirmenini kullanarak uygun taşlama/pulveizasyon elde etmek için idealdir(Şekil 1B).
    2. LN2'nin -80 °C'de depolamadan önce patlamış mısır içeren tüplerden tamamen buharlaştığından emin olun. Maya patlamış mısırı hazırladıktan sonra -80 °C'de muhafaza edildiğinde birkaç yıl stabil olarak durmak mümkündür.

figure-protocol-1
Şekil 1: Maya patlamış mısır hazırlama. (A) Maya "patlamış mısır" LN hücre süspansiyon dropwise dondurma tarafından yapılır2. Biz bir lastik bant ile birlikte düzenlenen ve kuru buz dolu bir buz kovası yerleştirilir bir ila üç 50 mL tüpler kullanın. Tüpler ln ile doldurulur2 sadece kendi jantlar altında kadar ve tüm hücre süspansiyon patlamış mısır içine yapılmış kadar neredeyse tam tutmak için sık sık sıvı nitrojen ile tepesinde(B) patlamış mısır boyutu optimal taşlama verimliliği önemli bir belirleyicidir. Patlamış mısırın boyut aralığı 0,3 ile 0,5 cm arasında olmalıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Kriyogrinding

  1. Başlamak için, dondurucu değirmeni soğutmak, şişeleri, malzemeleri öğütmek ve tüm numuneler için makineyi çalıştırmak için yeterli LN2 olduğundan emin olun. Beşten az numune için LN2'nin 30-35 L'si yeterli olacaktır. Dondurucu değirmen odasını dolgu hattına kadar LN2 ile doldurun.
    UYARI: LN2 ile ilgili tüm adımlar iyi havalandırılan bir alanda yapılmalı ve boğulma riskini önlemek için dondurucu değirmeninin kendisi böyle bir alanda bulunmalıdır. Uygun ayakkabı, laboratuvar önlüğü, güvenlik gözlükleri, nitril eldiven bir taban tabakası, sonra termal eldiven, nitril eldiven başka bir çift takip dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman giyin. LN2'yikullanırken çok dikkatli olun.
  2. LN2 sıçrama kaçınarak, yavaş yavaş dondurucu değirmen kapağını kapatın ve makine nin soğuması için birkaç dakika bekleyin. Bir sonraki adıma geçmeden önce buharlaşmadan kaynaklanan kaybı telafi etmek için hazneyi LN2 ile doldurmak gerekebilir.
    NOT: LN2'yi yalnızca dolgu satırına kadar gerektiğinde yeniden doldurun. Bu makine için hem tehlikeli hem de zararlı olabilir gibi oda aşırı doldurmayın. Otomatik dolum sistemleri, buharlaşan LN2'yi doğrudan dondurucu değirmenine bağlı bir depolama tankından doldurabilen dondurucu değirmeni için kullanılabilir.
  3. Pre-chill büyük taşlama şişeleri ve manyetik impactor bar LN onları dunking tarafından2 ayrı bir küçük dewar tutulur. LN2 köpürmeyi durduğunda tüm LN2'yi decant. Sonra taşlama şişesine örnek / maya patlamış mısır ekleyin ve iki paslanmaz çelik uç fişleri ile sıkıca mühür.
    1. Taşlama verimliliğini azaltabileceğinden öğütme şişesinin üçte birinden fazlasını numuneyle doldurmayın. Bunun yerine, daha büyük örnekler iki veya daha fazla şişeye bölünerek ve sırayla öğütülerek işlenebilir. Daha küçük taşlama şişeleri daha küçük numuneler için kullanılabilir (3 mL'ye kadar).
  4. Öğütme şişesini dondurucu değirmen odasına yerleştirin ve yerine kilitleyin. Kapağı kapat.
  5. Tomurcuklanan maya için, 14 kırma hızında 2 dakika/çevrim (döngüler arasında soğutma için 2 dk mola ile) için toplam üç döngü için numuneleri öğütün. Makine döngüleri tamamladıktan sonra durduğunda, dondurucu değirmenkapağını yavaşça açın ve toz dondurulmuş hücre lisatı ile şişenin kilidini dikkatlice açın ve dondurucu değirmeninden çıkarın. Birden fazla küçük şişe kullanılırsa, bir seferde bir şişe kaldırmak ve kuru buz onları yerleştirmek için hızlı bir şekilde çalışır.
    NOT: Genellikle aynı örnek türüne sahip farklı boyutlardaki şişeler kullanılırken taşlama parametrelerini ayarlamaya gerek yoktur. Ancak, çevrim sayısı ve taşlama oranı gibi taşlama parametrelerinin, kullanım kolaylığına bağlı olarak farklı numune tipleri için ampirik olarak belirlenmesi gerekir. Çoğu memeli hücresi ve yumuşak doku1-2 döngü içinde 10 kırma hızında lyse olacaktır. Bakteri, maya, sinek larvası ve erişkin meyve sinekleri gibi numunelerin kuruması zor olan 3-6 döngü maksimum hızda, kemik, diş vb. sert dokular 10 döngüye kadar sürebilir. Çözülmüş numunenin küçük bir aliquot önce ve sonra kısık verimliliğini belirlemek için bozulmamış, unlysed hücrelerin sayısını saymak için taşlama dan önce ve sonra mikroskop altında görülebilir. Tomurcuklanan maya dan protein ve DNA salınımı üzerinde kriyogrinding parametrelerinetkisi mükemmel bir analiz daha önce yayınlanmıştır15.
  6. Numunenin çözülmesine izin vermemek için hızlı bir şekilde çalışarak, açma aletini kullanarak son parçalardan birini dikkatlice sökün (taşlama sırasında biraz gevşek leşmiş gibi görünen iseçin). Daha sonra, impactor çubuğunu çıkarmak için bir çift uzun çalgı kullanın (kuru buzlu bir kovada önceden soğutulmuş olan). LN2 ile önceden soğutulmuş ve kuru buz üzerinde tutulan bir polistiren tartım kabıüzerine taşlama şişesi üzerine ters ve dokunarak toz haline getirilmiş örnek toplamak.
  7. Toz dondurulmuş hücre lisatının tamamı öğütme şişesinden çıkarıldıktan sonra, tartım kabından toz lanmış lysate'yi 50 mL'lik tüpe dökün ve en iyi sonuçlar için hemen yavaş erime basamadına geçin. Alternatif olarak, dondurulmuş toz lysate'yi bir gecede -80 °C'de saklayın, ancak bu bazı bozulmalara neden olabilir.
  8. Buz ve su% 50 bulamaç ile bir buz kovası hazırlayın ve manyetik karıştırıcı ile bir karıştırma plakası üzerine yerleştirin. Numuneleri tutmak için bir tel rafı veya buz bulamacına uygun başka bir rafı batırın.
    1. Daha sonra, yavaş yavaş bir manyetik karıştırıcı kullanarak bulamaç sürekli ajitasyon ile bir buz bulamaç banyosu örnekleri eritin. Eriyen buzu değiştirmek için daha fazla buz ekleyin (buz kovasının taşmasını önlemek için bazı suyun atılması gerekebilir). Birkaç inhibitörleri sulu tamponlar kısa yarım yaşamları olduğundan, ek proteaz inhibitör kokteyl (Malzemeler Tablosubakınız) ve 10 μM proteozom inhibitörü MG-132 örnekleri erimeye başladıktan sonra lysate (yaklaşık 30 dakika sonra) ekleyin.
    2. Erime işlemini hızlandırmak için her 5 dakikada bir tüplerin dışında oluşan buz kaldırın. Numunelerin oda sıcaklığında veya daha yüksekte hızlı bir şekilde çözülmesinin önemli ölçüde bozulmaya yol açabileceğini unutmayın.
  9. Numuneler tamamen çözüldükten sonra (numune miktarına bağlı olarak bir saatten fazla sürebilir), hücre enkazının büyük bir kısmını lysat'tan çıkarmak için 4 °C'de 20 dk'da ~3.220 g'de lysat'ı santrifüj edin.
  10. Supernatant'ı buz üzerinde önceden soğutulmuş 50 mL polikarbonat santrifüj tüplere aktarın ve numuneleri 4 °C'de 20 dakika boyunca 16.000 g'da santrifüj edin (Bkz. Malzeme Tablosu).
  11. Bulutlu lipid tabakasını(Şekil 2),önceden soğutulmuş serolojik pipetler kullanarak soğutulmuş 15 mL tüpe rahatsız etmeden, tüpteki sıvı sütunun merkezinden oluşan açık bir süpernatantı sadece açık bir süpernatant aktarın. Lipidlerin ve enkazların taşınmasını önlemek için santrifüj tüpündeki tüm lysate'yi çıkarmaktan kaçının. Santrifüj tüpünde kalan lysather spin sonra ekstre küçük miktarlarda kurtarmak için birden çok kez santrifüj edilebilir.
    NOT: Herhangi bir denatüre proteinile birlikte lipidler bulutlu/sütlü görünür ve sıvı/hava arabiriminin üst kısmında ve bazen çözünmez hücresel enkazdan oluşan peletin üzerinde yer alır (Şekil 2).

figure-protocol-2
Şekil 2: Santrifüj tüpündeki tabakaları ayıklayın. 20 dk için 16.000 g santrifüj aşağıdaki bir tüp tüm hücre ekstresinin önemli görünür özellikleri gösterilir. Her özelliğin göreceli bolluğu örnektürüne, hücrelerin büyüme evresine (üstel karşı sabit), hücreleri askıya almak için kullanılan lisis tamponunun miktarına ve lysis etkinliğine bağlıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Ekstre daha fazla kurtarmak için 5 dakika için kalan lysate santrifüj. Bu 5 dk santrifüjü mümkün olduğunca çok net özü kurtarmak için gerekirse birden çok kez tekrarlayın. Peletyakın tüp altına yakın lipidler içeren bulutlu lysate atın.
  2. Protein kompleksi saflaştırma, immünopresipitasyon ve proteomik analiz gibi downstream uygulamaları için bu özleri kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Her iki yöntemle hazırlanan hücre özlerinde göreceli geri kazanım proteinlerini değerlendirmek için maya hücresi lysis için 4 °C'de cam boncuk frezeleme ve -196 °C'de otomatik kriyogrindyöntemi olmak üzere iki farklı yöntem karşılaştırdık. Bu çalışma için, bir tomurcuklanan maya suşu YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2::ura3 ubi3-Δub--Δub-kullanmayı seçti 2 ubi4-Δ2::LEU2 [pUB39] [pUB221])16 yüksek bir kopya plazmi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mayadan alınan yerli proteinlerin incelenmesinin bir sınırlaması, sert hücre duvarlarından dolayı maya hücrelerinin verimsiz bir şekilde çalışmasıdır. Çeşitli yöntemler geliştirilmiş olmasına rağmen, elimizde en tutarlı ve verimli yöntem patlamış mısır gibi dondurulmuş maya hücrelerinin flaş kriyogrinding olduğunu. Bu yöntem, tomurcuklanan mayadan elde edilen yüksek kaliteli tüm hücre ekstrelerinin diğer lysis yöntemlerine göre güvenilir bir şekilde hazırlanmasını sağlar. Temsili sonuçlar kriyogrinding 4 ° C

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Gunjan laboratuvarındaki araştırmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Bilim Vakfı ve Florida Sağlık Bakanlığı'nın finansmanı ile desteklenmiştir. Lisans öğrencisi John Parker'a teknik yardım için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Vidalı kapaklı 50 mL polikarbonat tüplerBeckman357002Santrifüj tüpleri
BD Bacto PeptoneBD Biosiences211677Maya YPD medya bileşeni
BD Bacto Maya ÖzüBD Biosiences212750Maya YPD medya bileşeni
Beckman Avanti santrifüjBeckmanB38624Yüksek hızlı santrifüj
Beckman JLA-9.1000Beckman366754Rotor
D-(+)-Dekstroz SusuzMP Biyomedikal901521Maya YPD medya bileşeni
Eppendorf A-4-44Eppendorf22637461Sallanan kova rotoru
Eppendorf soğutmalı santrifüj 5810 REppendorf22625101Soğutmalı santrifüj
GliserolSIGMA-ALDRICHG5150-1GAHacim ayırıcı ve kriyoprotektan
HEPESFisherBiotechBP310-100Tampon
HIS6 antikoruNovagen70796HIS etiketi için antikor
KClSIGMA-ALDRICHP9541-1KGİyonik gücü korumak için tuz
MG-132CALBIOCHEM474790Proteazom İnhibitörü
Fosfataz inhibitörü kokteyliThermoFisher ScientificA32957Fosfataz inhibitör kokteyli
Ponceau SSIGMAP7170-1LProtein Lekesi
Proteaz inhibitörü kokteyliThermoFisher ScientificA32963Proteaz inhibitörü kokteyli
Rotor JLA 25.500BeckmanJLA 25.500Rotor
Sodyum ButiratEM ScienceBX2165-1Histon Deasetilaz İnhibitörü
Sodyum FlorürSigma-AldrichS6521Fosfataz İnhibitörü
Sodyum VanadatMP Biyomedikaller159664Fosfataz İnhibitörü
Sodyum ve beta;-gliserofosfatAlfa Aesar13408-09-8Fosfataz İnhibitörü
Spex Certiprep 6850 dondurucu değirmenSPEX Numune Hazırlama6850Dondurucu Değirmen
TALON Metal Afinitesi ReçineBD Biosiences635502HIS etiketli proteinleri aşağı çekmek için
Tween 20VWR InternationalVW1521-07Noniyonik deterjan
ve beta;-MerkaptoetanolAMRESCOM131-250MLİndirgeyici ajan

Kaynaklar

  1. Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
  2. Dunn, B., Wobbe, C. R. Preparation of protein extracts from yeast. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 13, Unit 13 (2001).
  3. Holm, C., Meeks-Wagner, D. W., Fangman, W. L., Botstein, D. A rapid, efficient method for isolating DNA from yeast. Gene. 42 (2), 169-173 (1986).
  4. Nandakumar, M. P., Marten, M. R. Comparison of lysis methods and preparation protocols for one- and two-dimensional electrophoresis of Aspergillus oryzae intracellular proteins. Electrophoresis. 23 (14), 2216-2222 (2002).
  5. Silva, G. A. D., Bernardi, T. L., Schaker, P. D. C., Menegotto, M., Valente, P. Rapid yeast DNA extraction by boiling and freeze-thawing without using chemical reagents and DNA purification. Brazilian Archives of Biology and Technology. 55, 319-327 (2012).
  6. Baldwin, C., Robinson, C. W. Disruption of Saccharomyces cerevisiae using enzymatic lysis combined with high-pressure homogenization. Biotechnology Techniques. 4 (5), 329-334 (1990).
  7. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  8. Hudspeth, M. E., Shumard, D. S., Tatti, K. M., Grossman, L. I. Rapid purification of yeast mitochondrial DNA in high yield. Biochimica et Biophysica Acta. 610 (2), 221-228 (1980).
  9. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. Journal of Visualized Experiments. (80), e50921(2013).
  10. Bzducha-Wróbel, A., et al. Evaluation of the efficiency of different disruption methods on yeast cell wall preparation for β-glucan isolation. Molecules. 19 (12), 20941-20961 (2014).
  11. Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
  12. Smith, B. C., Fisher, D. L., Weedn, V. W., Warnock, G. R., Holland, M. M. A systematic approach to the sampling of dental DNA. Journal of Forensic Sciences. 38 (5), 1194-1209 (1993).
  13. Sweet, D., Hildebrand, D. Recovery of DNA from human teeth by cryogenic grinding. Journal of Forensic Sciences. 43 (6), 1199-1202 (1998).
  14. Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Dean, J. F. An improved method of RNA isolation from loblolly pine (P. taeda L.) and other conifer species. Journal of Visualized Experiments. (36), e1751(2010).
  15. Singh, M. R., Roy, S., Bellare, J. R. Influence of Cryogenic Grinding on Release of Protein and DNA from Saccharomyces cerevisiae. International Journal of Food Engineering. 5 (1), (2009).
  16. Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Paik, J., Gunjan, A. Histone levels are regulated by phosphorylation and ubiquitylation-dependent proteolysis. Nature Cell Biology. 11 (8), 925-933 (2009).
  17. Liang, D., Burkhart, S. L., Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. Histone dosage regulates DNA damage sensitivity in a checkpoint-independent manner by the homologous recombination pathway. Nucleic Acids Research. 40 (19), 9604-9620 (2012).
  18. Singh, R. K., Gonzalez, M., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. Novel E3 ubiquitin ligases that regulate histone protein levels in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 7 (5), 36295(2012).
  19. Gunjan, A., Verreault, A. A Rad53 kinase-dependent surveillance mechanism that regulates histone protein levels in S. cerevisiae. Cell. 115 (5), 537-549 (2003).
  20. Gill, P., et al. Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis. Nature Genetics. 6 (2), 130-135 (1994).
  21. Alain, K., et al. DNA extractions from deep subseafloor sediments: novel cryogenic-mill-based procedure and comparison to existing protocols. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 355-362 (2011).
  22. Mohammad, F., Buskirk, A. Protocol for Ribosome Profiling in Bacteria. Bio-Protocol. 9 (24), 3468(2019).
  23. Liew, Y. J., et al. Identification of microRNAs in the coral Stylophora pistillata. PLoS One. 9 (3), 91101(2014).
  24. Lopez de Heredia, M., Jansen, R. P. RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications: a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5 (14), (2004).
  25. Grant, L. J., et al. Purified plant cell walls with adsorbed polyphenols alter porcine faecal bacterial communities during in vitro fermentation. Food & Function. 11 (1), 834-845 (2020).
  26. Lolo, M., et al. Cryogenic grinding pre-treatment improves extraction efficiency of fluoroquinolones for HPLC-MS/MS determination in animal tissue. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (5), 1933-1937 (2007).
  27. Santos, D., et al. Determination of Cd and Pb in food slurries by GFAAS using cryogenic grinding for sample preparation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (3), 183-189 (2002).
  28. da Silva, E. G. P., et al. Fast method for the determination of copper, manganese and iron in seafood samples. Journal of Food Composition and Analysis. 21 (3), 259-263 (2008).
  29. Kamogawa, M. Y., Nogueira, A. R. A., Costa, L. M., Garcia, E. E., Nobrega, J. A. A new strategy for preparation of hair slurries using cryogenic grinding and water-soluble tertiary-amines medium. Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy. 56 (10), 1973-1980 (2001).
  30. Sillen, A., Hall, G., Richardson, S., Armstrong, R. Sr-87/Sr-86 ratios in modern and fossil food-webs of the Sterkfontein Valley: Implications for early hominid habitat preference. Geochimica Et Cosmochimica Acta. 62 (14), 2463-2473 (1998).
  31. Nielsen-Marsh, C. M., et al. Sequence preservation of osteocalcin protein and mitochondrial DNA in bison bones older than 55 ka. Geology. 30 (12), 1099-1102 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

S v AzotMaya H cresi LizisiProtein EkstraksiyonuN kleik Asit zolasyonuH cre Par alamaOtomatik De irmenNumune Haz rlamaProteaz nhibisyonu
Otomatik Dondurucu Değirmeninde Kriyogrinding ile Hücre Ekstrelerinin Hazırlanması
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.