Yöntem makalesi

Bilinçli farelerde strese bağlı hiperglisemiyi azaltmak için intraperitoneal insülin tolerans testinden önce iklimlendirme

2.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61179

⸱

22 Mayıs 2020

 ,  ,  , 
1Division of Metabolism, Endocrinology and Nutrition, VA Puget Sound Health Care System, 2Department of Medicine, University of Washington

Bu makalede

Özet

Glikoz seviyelerinde strese bağlı yükselmeler, farelerde bilinçli bir intraperitoneal insülin tolerans testinden elde edilen verilerin yorumlanmasını zorlaştırabilir. Bu yazıda, strese bağlı hiperglisemiyi sınırlamak için insülin tolerans testini gerçekleştirmeden önce fareleri kullanıma, enjeksiyonlara ve kan örneklemesine alıştırmak için bir yöntem açıklıyoruz.

Özet

İnsülin tolerans testi, kemirgenlerde tüm vücut insülin duyarlılığını değerlendirmek için metabolik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Tek bir intraperitoneal insülin enjeksiyonunu takiben zaman içinde kan şekeri seviyelerinin ölçülmesini içeren nispeten basit bir testtir. Bilinçli durumda gerçekleştirildiği ve kanın genellikle bir kuyruk parçası yoluyla toplandığı göz önüne alındığında, taşıma ve kan alma ile ilgili kaygı nedeniyle hayvanlardan bir stres tepkisi ortaya çıkarma potansiyeline sahiptir. Bu nedenle, kan şekerinde strese bağlı bir artış meydana gelebilir ve bu da birincil son nokta ölçüsünün, yani kan şekerinde insülin aracılı bir azalmanın tespit edilmesini ve yorumlanmasını zorlaştırır. Bu, birçok fare suşunda görülmüştür ve insülin uygulamasından sonra glikoz seviyelerinin düşmek yerine artabileceği diyabetik db / db farelerde oldukça yaygındır. Burada, insülin tolerans testini gerçekleştirmeden önce fareleri kullanıma, enjeksiyonlara ve kan örneklemesine alıştırmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bunun strese bağlı hiperglisemiyi azalttığını ve tüm vücut insülin duyarlılığını daha doğru bir şekilde yansıtan verilerle sonuçlandığını bulduk.

Giriş

Kemirgenlerde metabolik testler, glikoz homeostazını düzenleyen çeşitli parametreleri değerlendirmek için rutin olarak yapılır1. Tüm vücut insülin etkisini in vivo değerlendirmek için altın standart hiperinsülinemik-öglisemik klemp2'dir. Bu test, öglisemiyi korumak için glikoz infüze edilirken dolaşımdaki insülin seviyelerini yükseltmek için insülinin uygulanmasını içerir. Öglisemiyi korumak için gereken glikoz infüzyon hızı, insülin etkisinin göstergesidir. Metabolik araştırmalarda güçlü bir araç olmasına rağmen, farelerde kelepçe tekniği teknik olarak zorlu ve emek yoğundur ve bu nedenle metabolik bir fenotipi karakterize etmede ilk tarama aracı olarak pek uygun değildir. Bu nedenlerden dolayı, genellikle daha basit olan intraperitoneal insülin tolerans testi (ITT) seçilir.

ITT, açlık süresinin ardından (tipik olarak 4-6 saat) bilinçli durumda gerçekleştirilir. İntraperitoneal olarak bir insülin bolusu uygulanır, ardından kan şekeri genellikle 60 dakika süren bir zaman dilimi boyunca izlenir. İnsülinin insüline duyarlı dokulara glikoz alımını kolaylaştırma kabiliyeti nedeniyle kan şekeri seviyelerinin düşmesi beklenir; Bunun meydana gelme derecesi, tüm vücut insülin etkisinin göstergesidir. Bazı durumlarda, insülin uygulamasından sonra glikoz seviyelerinin düşmek yerine paradoksal olarak arttığı gösterilmiştir. Bu fenomen muhtemelen bir stres tepkisine atfedilir. Kullanım, enjeksiyonlar ve kan örneklemesinin tümü streseneden olabilir 3,4,5, bu da hipotalamik-hipofiz-adrenal eksenin (HPA) ve otonom sinir sisteminin (ANS) aktivasyonuna neden olabilir6,7,8. Hem HPA hem de ANS'nin dolaşımdaki glikoz seviyelerindeki artışa katkıda bulunduğu iyi bilinmektedir 9,10,11. Bir ITT'nin başlangıcında strese bağlı hipergliseminin varlığı, insülin uygulaması üzerine glikozdaki düşüşün hızı ve büyüklüğü ile etkileşime girdiği için sorunludur12. Bu, insülin direncinin varlığı ile ilgili yanlış sonuçlara yol açabilir. Bu nedenle, bir ITT sırasında stresin glikoz seviyeleri üzerindeki kafa karıştırıcı etkisini azaltmak için, ITT'yi gerçekleştirmeden önce fareleri kullanım, enjeksiyonlar ve kan örneklemesine alıştırmak için bir yöntem geliştirdik.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler, VA Puget Sound Health Care System'in Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

NOT: Hipoglisemi yaşayan hayvanların izlenmesi ve/veya müdahalesi için yerel gereksinimler burada açıklananlardan farklı olabilir.

1. Oruç (t= -210 dk)

  1. Karanlık döngü sona erdikten sonra, fareleri selüloz veya kağıt yatak takımı gibi besleyici olmayan yatak takımlarına sahip yeni bir kafese aktarın (fareler tarafından tüketilirse metabolik uç noktaları etkileyecek olan mısır koçanı yatağı değil)13). Oruç süresi boyunca farelere suya ad libitum erişim sağlayın. Fare grupları arasında günün oruç saati ve süresi ile tutarlı olun. Gösterilen veriler için, yiyecekler 0700 ile 0800 saatleri arasında, yani karanlık döngünün sona ermesinden 1-2 saat sonra çıkarıldı.
  2. Kafes(ler)i ITT'nin gerçekleştirileceği yere taşıyın. Bu, sıcaklık, gürültü, ışık veya hareket gibi stres faktörlerinin en aza indirildiği sessiz bir alan olmalıdır.

2. Alışma (t = -150 ila -60 dakika)

ÖNEMLİ: Fareleri mümkün olduğunca nazikçe tutun. Mümkünse bir emniyet cihazı kullanmaktan kaçının.

  1. -150 dakikada vücut ağırlığını ölçün. Bu, ITT için uygulanacak insülin hacminin hesaplanması için kullanılacaktır.
  2. Fareyi nazikçe kuyruğundan alın ve kuyruğu nazikçe tutarken düz bir masa üstü yüzeyine koyun. Kuyruğun ucunda küçük bir kesi yapmak için 20 G'lik bir iğne (veya cerrahi makas) kullanın. Bölgede bir damla kan oluşmaya başlamalıdır.
  3. Fareyi pürüzsüz ve sert bir yüzeye yerleştirin ve fareyi kuyruğundan nazikçe tutun.
    1. Bu sırada kan şekerini kaydetmek için, elde taşınan bir glukometrenin test şeridine kuyruk ucundan bir damla kan yerleştirin. Gerekirse, bir damla kan elde etmek için kuyruğa çok nazikçe masaj yapın.
  4. Bir insülin şırıngasına 100 μL steril salin çekin. Fareyi hafifçe tırmalama kullanarak alın ve intraperitoneal olarak enjekte edin. Salin enjeksiyonunun zamanını kaydedin.
    1. Birden fazla fare üzerinde çalışılıyorsa, aşağıdaki sonraki adımlar için zaman tanımak için farelere 1 dakikalık aralıklarla salin enjekte edin.
  5. Salin enjeksiyonundan 15 dakika sonra, fareyi kuyruğundan nazikçe alın. Kuyruk ucundaki kan pıhtısını nazikçe çıkarmak için gazlı bez kullanın.
    1. İsteğe bağlı: Adım 2.3'te açıklandığı gibi bu sırada kan şekerini tekrar kaydedin.
  6. Salin enjeksiyonundan 30 dakika sonra, fareyi yavaşça kuyruğundan alın. İstenirse, adım 2.3'te açıklandığı gibi başka bir kan şekeri ölçümü alın.
  7. Fareyi kafese geri koyun ve diğer fareler için gerektiği kadar tekrarlayın. Fareleri -90 dakikaya kadar rahatsız etmeyin.
  8. -90 dakikada, istenirse kan şekeri seviyelerinin ölçümü de dahil olmak üzere 2.3 ila 2.6 arasındaki adımları tekrarlayın.
  9. Fareyi kafese geri koyun, gerektiği kadar diğer fareler için tekrarlayın. ITT'ye kadar fareleri rahatsız etmeyin (bunun için temel kan şekeri ölçümü -5 dakikada yapılır).

3. İnsülin Tolerans Testi (t= -5 ila +60 dk)

  1. İstenilen doz 4 μL / g vücut ağırlığında enjekte edilebilecek şekilde steril salin içinde çalışan bir düzenli insülin çözeltisi (DİKKAT) hazırlayın.
    NOT: Yanlışlıkla enjeksiyon hipoglisemiye neden olabileceğinden, insülin ile çalışırken dikkatli olunmalıdır.
  2. Farelerde müdahale gerektiren hipoglisemi gelişmesi durumunda elinizin altında bulundurmak için steril salin içinde% 25 (h / h) dekstroz çözeltisi hazırlayın.
  3. -5 dakikada, fareyi kuyruğundan nazikçe alın. El tipi bir glukometrenin test şeridine kuyruk ucundan bir damla kan koyarak şu anda temel kan şekeri seviyesini belirleyin. Gerekirse, bir damla kan elde etmek için kuyruğa çok nazikçe masaj yapın.
  4. İnsülin çalışma solüsyonunu bir insülin şırıngasına (tipik bir doz aralığı 0.5-2.0 U / kg için 4 μL / g vücut ağırlığı) hazırlayın. Fareyi hafifçe tırmalama kullanarak alın ve intraperitoneal olarak enjekte edin. İnsülin enjeksiyonunun rekor süresi.
    1. Birden fazla fare üzerinde çalışılıyorsa, sonraki kan örneklemesi ve aşağıdaki veri kaydı için zaman tanımak için farelere 1 dakikalık aralıklarla insülin enjekte edin.
  5. İnsülin enjeksiyonundan 15 dakika sonra, fareyi kuyruğundan nazikçe alın. Kuyruk ucundaki kan pıhtısını nazikçe çıkarmak için gazlı bez kullanın. Bu sırada kan şekerini adım 3.3'te açıklandığı gibi tekrar belirleyin.
  6. Fareyi kafese geri koyun ve hipoglisemi belirtileri (örn. aşırı uyuşukluk) olup olmadığını izleyin. Farelerde hipoglisemi semptomları gelişirse, 5. adımda anlatıldığı gibi kan şekerini ölçün ve gerekirse dekstroz uygulayın. Dekstroz müdahalesi geçiren bir fare bu sırada ITT protokolünden çıkarılacaktır.
  7. İnsülin enjeksiyonundan 30 dakika sonra 3.5 ve 3.6 adımlarını tekrarlayın.
  8. İnsülin enjeksiyonundan 45 dakika sonra 3.5 ve 3.6 adımlarını tekrarlayın.
  9. İnsülin enjeksiyonundan 60 dakika sonra 3.5 ve 3.6 adımlarını tekrarlayın.
  10. Fareleri, ITT'den kurtarmaya yardımcı olmak için kafesin tabanında birkaç yiyecek peleti içeren ev kafeslerine geri koyun. 30 dakika boyunca izlemeye devam edin ve fareler normal aktivite / davranışı geri kazanmadıysa, adım 3.6'da açıklanan prosedürü izleyin.
    NOT: Şekil 1 , yukarıdaki iklimlendirme ve ITT prosedürünü özetlemektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 2A ve Şekil 3A , strese bağlı hiperglisemi ile tutarlı olarak, insülin uygulamasını takip eden 15 dakika içinde diyabetik db / db farelerde kan şekeri seviyelerinde paradoksal bir artış gösteren temsili verilerdir (sırasıyla bireysel ve ortalama veriler). Aynı prosedüre tabi tutulan kontrol diyabetik olmayan littermatlarda (db / + veya +/+) kan şekerinde herhangi bir artış görülmediğini unutmayın. ITT prosedürüne alışmanın kan şekerindeki bu artışı hafifle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Hiperinsülinemik-öglisemik klemp, in vivo insülin etkisini değerlendirmek için altın standart olarak kabul edilir. Klempi gerçekleştirme metodolojisinde yapılan değişiklikler, tekniğin, karotis arter yoluyla kan örneklemesini ve juguler ven yoluyla infüzyonları mümkün kılmak için daha önce iki kateterli bir sistem14 kullanılarak kateterize edilmiş bilinçli, dizginlenmemişfarelerde 2 yapılmasına neden olmuştur. Bu, prosedür sırasında fareler...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi P30 DK-017047 (Washington Üniversitesi Diyabet Araştırma Merkezi, Hücre Fonksiyon Analizi Çekirdeği) ve Amerika Birleşik Devletleri Gazi İşleri Bakanlığı, VA Puget Sound Health Care System (Seattle, WA) tarafından desteklenmiştir. Bu yazının içeriği, ABD Gazi İşleri Bakanlığı veya Birleşik Devletler Hükümeti'nin görüşlerini temsil etmemektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dekstroz-50Pfizer Enjektablları00409-6648-16Fare hipoglisemi yaşarsa kullanım içindir.
Gazlı bez pedleriFisher Scientific22037907Kuyruk ucundaki kan pıhtısını çıkarmak için.
GlukometreAccu-ChekM001_usKan şekerini ölçmek için.
Gram ölçeğiVücut ağırlığını ölçmek için.
İnsülin (Novolin R)Novo Nordisk0169-1833-11Enjeksiyon için.
İnsülin şırıngalarıVWRBD-329461Enjeksiyonlar için.
Dakika zamanlayıcı
Steril 20 G iğneVWRBD-305175Kuyruk kesme için.
Steril salinLifeshield1261699Enjeksiyonlar için.
Cerrahi makasGüzel Bilim Araçları14088-10Kuyruk kesmek için.
Test şeritleriAccu-Chek06908217001_usKan şekerini ölçmek için.

Kaynaklar

  1. Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease Models & Mechanisms. 3 (9-10), 525-534 (2010).
  2. Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments. (57), e3188(2011).
  3. Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (6), 42-51 (2004).
  4. Tabata, H., Kitamura, T., Nagamatsu, N. Comparison of effects of restraint, cage transportation, anaesthesia and repeated bleeding on plasma glucose levels between mice and rats. Lab Animal. 32 (2), 143-148 (1998).
  5. Olfe, J., Domanska, G., Schuett, C., Kiank, C. Different stress-related phenotypes of BALB/c mice from in-house or vendor: alterations of the sympathetic and HPA axis responsiveness. BMC Physiology. 10, 2(2010).
  6. Ghalami, J., Zardooz, H., Rostamkhani, F., Farrokhi, B., Hedayati, M. Glucose-stimulated insulin secretion: Effects of high-fat diet and acute stress. Journal of Endocrinological Investigation. 36 (10), 835-842 (2013).
  7. Thorens, B. Brain glucose sensing and neural regulation of insulin and glucagon secretion. Diabetes, Obesity and Metabolism. 13, Suppl 1 82-88 (2011).
  8. Pekow, C. Defining, measuring, and interpreting stress in laboratory animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (2), 41-45 (2005).
  9. Chan, O., Inouye, K., Riddell, M. C., Vranic, M., Matthews, S. G. Diabetes and the hypothalamo-pituitary-adrenal (HPA) axis. Minerva Endocrinol. 28 (2), 87-102 (2003).
  10. Rosmond, R. Role of stress in the pathogenesis of the metabolic syndrome. Psychoneuroendocrinology. 30 (1), 1-10 (2005).
  11. Nonogaki, K. New insights into sympathetic regulation of glucose and fat metabolism. Diabetologia. 43 (5), 533-549 (2000).
  12. McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 849-855 (2009).
  13. Zahorsky-Reeves, J., LW, C. Housing mice on corncob bedding versus hardwood chip may confound research models. American Association for Laboratory Animal Science. , AALAS Scientific Session (10 October) (2010).
  14. Niswender, K. D., Shiota, M., Postic, C., Cherrington, A. D., Magnuson, M. A. Effects of increased glucokinase gene copy number on glucose homeostasis and hepatic glucose metabolism. Journal of Biological Chemistry. 272 (36), 22570-22575 (1997).
  15. Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
  16. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  17. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
  18. Barrett, A. M., Stockham, M. A. The effect of housing conditions and simple experimental procedures upon the corticosterone level in the plasma of rats. Journal of Endocrinology. 26, 97-105 (1963).
  19. Heinrichs, S. C. Neurobehavioral consequences of stressor exposure in rodent models of epilepsy. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 34 (5), 808-815 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fare Al t rmantraperitoneal EnjeksiyonKan Glukoz l mKuyruk Kesme rneklemesiBilin li Fare TestiT m V cut ns lin Duyarl lTutma AdaptasyonuDb Db Fare Modeli
Video yakında

İlgili makaleler