Böceklerde Kritik Termal Limitlerin Yüksek İş Gücü Tahlilleri

Böceklerin Termal sınırları
Sıcaklık da dahil olmak üzere çevre koşullarındaki değişim, organizmaların performansını, fitnessını, hayatta kalma ve coğrafi dağılımını etkileyen önemli bir faktördür^1,2. Üst ve alt ısı sınırları bir organizmanın tolere edebileceği ortamların teorik aralığını belirler ve bu nedenle, bu sınırlar özellikle iklim değişikliği karşısında bitki ve hayvan dağılımlarının önemli belirleyicileridir^3,4. Bu nedenle, termal limitleri doğru bir şekilde ölçmeprotokolleri ekolojistler, fizyologlar, evrimbiyologları ve koruma biyologları için önemli araçlardır.

En bol ve çeşitli karasal hayvanlar olarak, böcekler sık sık termal sınırların ölçümleri için kullanılır. Kritik termal maksima (CT_max)ve kritik termal minima (CT_min)termal tolerans^5,6,,7'dekiintra-ve interspesifik değişimi değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. CT_max ve CT_min büyüme, üreme çıkışı ve davranış dahil olmak üzere birden fazla fenotip için ölçülebilir iken, en sık lokomotor fonksiyon⁵uygulanır^,6,7. Böylece, CT_max (Ayrıca ısı nakavt sıcaklığı denir) ve CT_min genellikle böcekler motor fonksiyonunu kaybetmek ve dik kalmak mümkün değildir yüksek ve düşük sıcaklıklar olarak tanımlanır^{5,6,7,8,9,10,11}. CT_min soğuk koma başlangıcı ile çakışıyor, soğuk sıcaklıklar tarafından getirilen bir geri dönüşümlü felç⁶. Termal sınırlarda felç genellikle geri dönüşümlü iken, bu sıcaklıklara sürekli maruz kalma ekolojik ölüme yol açar⁵.

Termal limitleri ölçmek için ortak yöntemler
Termal limitleri ölçmek için çeşitli aparatlar kullanılmıştır (Sinclair vd.)'de özetlenmiştir. ⁶. Kısaca, böcekler ısıtılır veya kuvözlerde soğutulur^12,13, sıvı banyoları 11^batıkkaplar¹¹,^14,15,16, alüminyum bloklar^10,17, veya ceketli kaplar¹⁸, ve locomotion sona erene kadar izlenir. Tsursırasında böcekleri izlemek için, en yaygın yöntem, bireylerin sürekli olarak gerçek zamanlı olarak veya geriye^,dönük olarak kaydedilen video^6,9,10,11,^15,,17ile izlendiği doğrudan gözlemdir. Doğrudan gözlem yöntemleri minimum ekipman gereksinimlerine sahip olmakla birlikte, emek yoğun ve limit iş gücü. Alternatif olarak, böcekler perçin^6,19,^,20,,21 veya aktivite monitörleri¹³kullanarak düşmek gibi ayrık zamanlarda bireylerin toplayarak dolaylı olarak görülebilir.

Termal limitleri ölçmek için dolaylı yöntemler genellikle daha yüksek-iş gücü ve doğrudan gözlem yöntemleri daha potansiyel olarak daha az hata eğilimli. Dolaylı izleme için en yaygın yöntem ceketli sıcaklık kontrollü sütun^{kullanır 6,8,19,20,21}. Böcekler tünekli bir sütunun içine yerleştirilir ve iç haznenin sıcaklığı, sütunun ceketli astarı aracılığıyla sıcaklık kontrollü sıvı banyosundan sıvı pompalayarak kontrol edilir. Termal sınırına ulaşan bireyler levreklerinden düşer ve ayrı sıcaklıklarda veya zaman aralıklarında toplanır. Bu yöntem CT_miniçin iyi çalışıyor olsa da , CT_maxiçin uygun bulunmuştur , çünkü sinekler gönüllü olarak sıcaklık artar sütunun alt dışarı yürümek. Burada açıklanan yeni yöntem, otomatik ölçümler sırasında tek tek sinekler içeren bu sorunu aşar.

Gözlem yöntemine ek olarak, üst ısı limitlerini değerlendirmek için iki tür sıcaklık rejimi kullanılır. Dinamik tahliller motor fonksiyonu kaybolana kadar giderek artan sıcaklık oluşur; bu sıcaklık dinamik CT_max⁷,^8,,9,13. Buna karşılık, statik tahliller motor fonksiyonu kaybolana kadar sabit stresli sıcaklık oluşur; bu zaman noktası ısı nakavt süresi (ısı KDT), ayrıca statik CT_max (sCT_max)Jørgensen ve ark.^7,8,9,16,22tarafından yeni bir kağıt olarak adlandırılır . CT_max ve ısı nakavt tahlilleri (ısı KD tahlilleri) farklı birimleri ile ölçümler üretmek rağmen, iki özelliğin matematiksel modelleme onlar ısı toleransı hakkında karşılaştırılabilir bilgi vermek gösterir ve her ikisi de ekolojik ilgili^8,9. Dinamik tahliller, çevre koşullarına kıyasla karşılaştırılabilir bir sıcaklık verim, ve ısı toleransı büyük farklılıklar olduğunda tercih edilir, yaygın olarak farklı termal nişler ile türler arasında karşılaştırmalar gibi. Ancak, ısı yaralanması birikimi için yüksek Q10 nedeniyle, statik bir tetkik ısı toleransı intraspesifik varyasyon gibi küçük etki boyutları, tespit etmek için tercih edilebilir⁹. Ayrıca, pratik konuşma, statik bir test dinamik bir test daha az gelişmiş ekipman gerektirir.

Amaç
Bu makalenin amacı, hareketli böceklerin termal sınırlarını değerlendirmek için gelecekteki araştırmalarda kullanılabilecek CT_min ve ısı KD tahlilleri için yöntemleri resmileştirmektir. Protokoller daha önce kurulmuş metodolojilerden uyarlanmıştır ve yüksek iş ortası, otomatik ve uygun maliyetli olacak şekilde tasarlanmıştır. Her iki tahlil de kısa bir süre içinde (~2 saat) tamamlanabilir, bu da birden fazla denemenin tek bir günde yapılabileceği ve tekrarlanabilirlik veya doğrudan ödün vermeden büyük miktarda veri üretülebilir. Bu kurulum ile, 96 sineğin ısı toleransı aynı anda ölçülebilir, CT_dk için kolon 100'den fazla sinek tutabilir, tüneme için yeterli yüzey alanı olması koşuluyla.

CT_min'i gözlemlemek için kullanılan yüksek iş yapma yöntemi, sinekleri otomatik olarak saymak için bir kızılötesi sensör eklenmesiyle ortak ceketli sütun metodolojisini değiştirir. Sayım için kızılötesi sensör kullanımı ilk olarak 1996²³ yılında Shuman ve ark. tarafından önerilmiştir, ancak yaygın olarak benimsenmemiştir. Kızılötesi sensörün eklenmesi, ayrı aralıklarla veri toplamak yerine sürekli veri üretimine olanak tanır. Bu protokol ayrıca, el ile veri girişini ve ayrık zaman noktalarında jakuzi sütunun altında toplama tüplerini el ile değiştirme gereksinimini ortadan kaldırarak deneyci hatasını en aza indirir.

ısı KDT kayıt için yüksek iş yapma yöntemi böceklerde ısı toleransı iki önceki çalışmalardan değiştirilir^10,12. Bireysel sinekler sıcaklık kontrollü bir kuluçka makinesinde 96 kuyu plakasında saklanır ve video kaydedilir. Bu protokol, denemeler kaydı nisbeten oynatılarak gözden geçirilip doğrulanabildiği için ısı KDT'yi belirlemede deneyci önyargısını en aza indirir. Bu protokol ayrıca video çözümlemesi hızlandırmak için kullanılabilecek özel Python komut dosyaları kümesi sağlar. Bireysel kuyuların kullanımı, diğer bireylerin hareket veya düşme zaman oluşabilir girişim ortadan kaldırır, bireylerin grupları aynı arenada gözlendiğinde bir sorun olabilir^10,17. Ayrıca, sıcaklık kontrollü inkübatör tüm 96 kuyular arasında istikrarlı bir sıcaklık sağlar, sıcaklık gradyanı bazen bir sıcaklık kontrollü alüminyum blok¹⁰arasında gözlenen aksine. Ayrıca, 96 iyi kayıt yönteminin dinamik CT_max ve potansiyel OLARAK CT_min ölçmek için uyarlanabileceğini unutmayın (Bkz. Tartışma).

Her protokolü göstermek için, Drosophila melanogaster genetik referans paneli (DGRP) belirli satırları yetişkin Drosophila melanogaster kadınların termal sınırları karşılaştırıldı²⁴. Ön deneyler termal toleransta önemli farklılıklar gösterdiği için bu çizgiler seçilmiştir. Bu tahliller, termal tolerans farklılıkları nı ayırt etmek için sağlam yöntemler olduğunu kanıtlamıştır. Aşağıdaki iki protokol, yüksek verimli CT_min test (bölüm 1) ve yüksek verimli ısı KD test (bölüm 2), herhangi bir hareketli böcek yaşam evresi için CT_min ve ısı KDT verileri üretmek için gerekli eylemleri açıklamak, cihazlar sığabilecek yeteneğine sahip, yetişkin Drosophilagibi. CT_min için de böcek tünemek mümkün olması esastır. Burada, her bir titreyen yetişkin Drosophila melanogastergösterilmiştir. Ancak, değişiklikler diğer takson veya yaşam aşamaları⁶için gerekli olabilir. Küçük değişiklikler, CT_min teşrinindeki daha büyük numuneleri yerleştirmek için daha büyük açıklıklara sahip tüneme malzemesi kullanmak veya Yavaş hareket eden bir böceğin ince KDT'sini veya ısı KD tamortasındaki yaşam aşamasını ayırt etmek için daha kaliteli bir kamera kullanmak olabilir. Bu protokol sinek hazırlama yöntemlerini tanımlamaz, ancak tekrarlanabilirlik sağlamak için yetiştirme protokollerini standartlaştırmak önemlidir²⁵ (Garcia ve Teets²⁶ ve Teets ve Hahn^27'yebakınız). Sağlanan protokoller, cihazların nasıl inşa edilip kurulaaçıklanacağını, ölçümlerin nasıl kaydedilene ve veri analizinin kısa bir açıklamasını içerir.

1. Yüksek iş itimat CT_min teşp

1. Ceketli sütunun montajı (Şekil 1A, Şekil 2)
   1. En geniş (7 cm x 6,35 cm x 0,3 cm) ve en dar (5,7 cm x 5,1 cm x 0,3 cm) akrilik boruları demir testeresi ile eşit uzunlukta (31,5 cm) kesin (Şekil 2A). Bu iki tüp ceketli sütunun en dış ve en iç duvarları olacaktır.
   2. Orta büyüklükteki (6,35 cm x 5,7 cm x 0,3 cm) akrilik borudan demir testeresiyle iki halka (2 cm genişliğinde) kesin(Şekil 2A). Bu iki halka iç ve dış tüpler arasında spacers olacak, sıvı akışı için iki uzun akrilik tüpler arasında bir boşluk oluşturma.
   3. Dikkatle dış (en geniş) akrilik tüp, üst ve bir alt bir delik iki delik matkap. Her deliğin tüpün ucundan 3,5 cm olduğundan emin olun. Tüpün zıt taraflarındaki delikleri delin (Şekil 2B).
   4. Çatlamayı azaltmak için, tüpün üzerine gelecekteki deliğin üzerine bant yerleştirin ve matkabın en düşük tork ayarında çok yavaş bir şekilde delin.
   5. Diş ipliği musluğunu kullanarak, hortum adaptörlerinin dış tüpün iki deliğe vidalanması için her iki deliği de bağlayın. Çatlamayı azaltmak için yağlayıcı kullanın ve el ile yavaşça iplik kullanın.
   6. İki boşluk, her iki ucunda (alt ve üst) olmak üzere iç ceketin üzerine kaydırın. Boşluk ile iç ceketin ucu arasında küçük bir boşluk (0,5 cm) bırakın(Şekil 2B).
   7. Kaynak yerine akrilik çimento kullanarak spacers.
   8. İç tüp ve spacers setleri üzerinde çimento sonra, delikleri ile büyük dış tüp içine bu yapı kaydırın. Dış ve iç tüplerin her iki uçta da sifonu çektiğinden emin olun. Spacers sonundan 0,5 cm olacak ve sütunun her iki ucunda küçük siperler oluşturacaktır(Şekil 2C).
   9. Dış tüpü akrilik çimento kullanarak, cihazı bir arada tutmak için ayarlanabilir çelik kelepçeler kullanarak uzaya kaynak layın. Çimentonun ayarını bekle.
   10. Hortum adaptörlerini şimdi boşluklara ve iç tüpe sabitlenmiş dış tüpün deliklerine yerleştirin.
       NOT: Bağdaştırıcılar sadece dış tüpiçine iplik değil, iç ve dış tüpler arasındaki açık alana. Hortum adaptörleri çok fazla iplik varsa, bir testere ile uygun uzunlukta onları kısaltmak.
   11. Hortum adaptörlerini dış tüpteki ipliklerine silikon dolgu ile kapatın.
   12. Ceketli sütunun her iki ucundaki iç ve dış taki tüpler arasındaki iki siperi silikon dolgu ile doldurun.
   13. Kolontest etmek için, hortum adaptörleri için 0,6 cm çapında boru takın. Sütunun altındaki adaptörü borulu bir su kaynağına, sütunun üst kısmındaki adaptörü ise farklı bir boru parçasıyla bir drenaja bağlayın.
   14. Alttan yukarıya kadar aparatın içinden su geçirin ve sızıntıolup olup yok edin. Sızıntı varsa, nereden geldiklerini belirleyin ve silikonla kapatın.
2. Ceketli kolon ve Drosophila Huni Monitörü (DFM) kurulumu
   1. Ceketli sütunu üç uçlu retort kelepçesi ile retort standına sabitle. Sütunu bir ucunu tavana, diğerucunu da laboratuvar tezgahına açık olarak dikey olarak hizalayın (Şekil 1B).
   2. Sıcaklık kontrollü soğutuculu banyodan sıvı giriş intibatını ve çıktısını 0,6 cm çapında plastik borulu kolon adaptör nozullarına bağlayın(Şekil 1B). Sıvı girişini sütunun altındaki meme ve sıvı çıktısını sütunun üst kısmındaki meme ile bağlayın.
   3. İki 3 cm kalınlığında dairesel köpük yalıtım fişleri (sütunun en iç bölmesinin açılmasıyla aynı çevre) kesin. Fişlerin rahatça uyduğundan emin olun ve her iki uça da takıldığında en içteki sütunu kapatın(Şekil 1B).
   4. Fişlerden birinin ortasından bir delik delin ve bir termokuplun çıplak ucunu yaklaşık 5 cm delikten geçirin ve bantla sabitleyin. Termokuplun diğer ucunu bir termokupl veri kaydedicisine takın.
   5. Termokupl veri kaydedicisini bilgisayara bağlayın.
   6. Dikme plastik oluk koruma iki adet (5 cm x 7 cm, ~ 0,5 cm çapında açıklıklar ile) perne malzemesi olarak işlev için sütun içinde. Bir parça korumayı sütunun^üstünden 2/3'lük, diğer^1/3'ünü ise sütunun üst kısmından yerleştirin ( Şekil1B).
   7. Alt fişi (termokupl olmadan) ve üst fişi (termokupl ile) sabitlayın. Fiş sütunun üst tarafına takıldığında, termokuplun sütunun kenarlarına dokunmadığından emin olun.
   8. Retort standındaki sütunun yüksekliğini, sütunun alt kısmı ile tezgah üstü arasında 25 cm'lik bir mesafe olacak şekilde ayarlayın.
   9. Bir retort halkası (5 cm çapında) retort standına sütunun alt 5 cm altında ve sütunun yan halkası kapalı döndürün.
   10. DFM'yi doğrudan retort halkasına ayarlayın(Şekil 1B). Tüm elektronik bileşenleri bağlayın: güç kaynağı, güç kaynağı arabirimi ve bilgisayar üreticinin protokolüne göre.
   11. Bileşenler bağlandıktan sonra, DFM ve DFM yazılımının kurulumünü tamamlamak için üreticinin protokolünü izleyin.
3. Ct_Dk Tahlil
   1. Akışkan banyonun giriş ve çıkış vanalarını açık konumlara çevirin.
   2. Sıcaklık kontrollü akışkan banyoyu açmak için güç düğmesine basın ve ardından banyonun sıcaklığını 25 °C'ye yükselten ve koruyan bir programı çalıştırmak için play tuşuna basın. 25 °C'ye ulaşmak ve bakımını yapmak için sıvı banyosu ve sütun5-10 dk verin.
   3. Sütunun üst kısmındaki fişi çıkarın ve bir huni ile değiştirin (5,08 cm çapında; bkz. Şekil 1C).
   4. Sinekleri besin şişelerinden sütuna dokunun.
   5. Huniyi çıkarın ve sineklerin kaçmasına izin vermemeye dikkat edin, hızlı bir şekilde üst fişle değiştirin. Sinekler yerleşmek için 5 dakika verin, bazen tırmanmaya sinekler teşvik etmek için alt fişi dokunarak.
   6. Akışkan banyosundaki başlangıç düğmesine basın ve CT_min rampa programına başlayın (5 dk için 25 °C; 0,5 °C/dk'da 25 °C ila 10 °C; 2 dk için 10 °C; sonra 0,25 °C/dk'da 10 °C).
      NOT: Bu CT_min rampalama protokolünün diğer varyasyonları araştırma sorusuna bağlı olarak kullanılabilir (örneğin, farklı rampa oranlarının CT_min²⁸üzerindeki etkilerinin karşılaştırılması).
   7. Bilgisayardaki termokupl kayıt yazılımını açın ve ardından kayıt simgesini tıklatarak, tetkik süresince sütunun içindeki sıcaklığı her saniye kaydetmeye başlayın. Sıcaklık verilerinin daha sonra DFM'den gelen verilerle birleştirilebilmesi için her sıcaklık kaydının ikincisine özgü bir zaman damgası içerdiğinden emin olun.
   8. 15 mL konik santrifüj tüpüne %90 etanol 5 mL ekleyin ve sütunun altındaki bir rafa yerleştirin.
   9. Bazen, tırmanmak için alttaki sinekleri ikna etmek için sütunun alt fişe dokunun. Sineklerin çoğu 15 °C'ye kadar bir levrekte veya sütunun üst kısmında olacaktır.
   10. 15 °C'de alt fişi çıkarın ve etanolün alt fişinde hala sinekleri toplayın. Bu sineklerin 15 °C'de toplandığını ancak CT_dk.larının bilinmediğini unutmayın.
       NOT: Alt fişin çıkarıldığı sıcaklık, test türünün veya tedavisinin öngörülen CT_min'ine göre ve tözden önce belirlenmelidir. Bu tahlil için, ön tahlillerde bulunan bu özel DGRP hatlarının CT_min'ine göre 15 °C seçilmiştir.
   11. DFM içine 75 mm dış çaplı cam huni yerleştirin. Retort halkasını, DFM'yi ve huniyi sütunun altında olacak şekilde ayarlayın. Huninin dudağının sütunun alt kısmını tamamen mühürlediğinden emin olun (Şekil 1D).
   12. Huninin alt kısmını 15 mL toplama tüpüne takın (Şekil 1D).
   13. Yazılım simgesine tıklayarak bilgisayardaki DFM yazılımını açın. Yazılım hemen sinekler ct_minulaşmak hangi saat / tarih kaydetmeye başlayacaktır. Onların CT_min ulaşmak Sinekler nöromüsküler fonksiyon kaybetmek ve tüneklerinden düşmek, ve daha sonra DFM ile.
   14. Tüm sineklerin, üst fişi kontrol ederek sıcaklık azaldıkça tüm sineklerin CT_min'lerine ulaşıp ulaşmadığını izleyin ve sineklerin hala tünemiş olup olmadığını (yani hala nöromüsküler fonksiyonu koruyarak) kontrol edin. Tüm sinekler CT_min'lerineulaştığında deneme sona erer.
   15. Deneme nin sonunda, DFM'yi ve huniyi sütun açılışından uzağa ayarlayın. Bazı sinekler CT_min ulaşabilir ama sütun (yani bir levrek sıkışmış veya tek bir tarsal kanca ile sarkan) sıkışmış kalır. Üst fişi açın ve bu sinekleri çıkarın. Bu sineklerin CT_min'i bilinmemektedir.
   16. RStudio'daki Birleştirme komutunu kullanarak termokupl kayıt yazılımından (örn. sıcaklık, tarih ve saat) ve DFM yazılımından (yani huni, tarih ve saat üzerinden sinek sayısı) .txt çıkış dosyalarını birleştirin. Paylaşılan tarih/saat değişkenini temel alan iki dosyayı birleştirin.

2. Yüksek iş itimi ısı KD teşp

1. Aparat montajı ve hazırlanması
   1. Bir yapıştırıcı ile, çelik dokuma tel örgü (~ 1,5 mm diyafram) bir 96 iyi no-alt plaka altına düzeltmek.
   2. Mıknatısları, sıcak tutkal tabancası ve sıcak tutkal ile 96 kuyunun alt tabakasının alt tarafına takın(Şekil 3).
   3. 96 kuyu plakası için tasarlanmış yapışkan film ile özel bir septum kapak zanaat için, bir sırtlı plastik levha oluşturmak için birlikte iki film yapışkan kenarları sopa.
   4. 96 iyi plaka üzerinde plastik levhalar yerleştirin ve plakanın dört tarafına yapıştırmak için bant kullanın. Plaka üzerinde her kuyuya açılan üzerinde, bir maket bıçağı (yani, 96 toplam x) ile plastik levha bir 'x' kesti.
   5. ANEsthetize CO₂ ile uçar ve bir aspiratör ve septum kapağı ile modifiye 96 iyi dipsiz plaka her kuyuiçine ayrı ayrı yükleyin. Sinekler CO₂ ile anestezi edilirken septum kapağı 96 kuyu plakasından çıkarın ve sıkı bir açık kapak ile değiştirin.
   6. Sinekyüklü 96 iyi dipsiz plaka yerleştirin ve gıda üzerinde net bir sıkı montaj kapağı ile. Sineklerin CO₂ anestezisi ile titreşinin başlangıcı arasında en az 48 saat olduğundan emin olun (2.2.1-2.2.5. adım).
      NOT: Modifiye edilmiş 96 kuyu nun alt plakasının alt kısmı örgüden yapılmıştır, bu nedenle CO₂ ile uyuşturulmuş sinekler bir deneme başlamadan önce en az 48 saat boyunca gıdaya yüklenebilir ve bırakılabilir. Herhangi bir plastik kap >8.5 cm genişliğinde x 13 cm uzunluğunda ve en az 2 cm derinliğinde 1 cm derinliğinde bir tabaka gıda kullanılabilir.
   7. Bir web kamerasını, sıcaklık kontrollü bir kuluçka makinesinin içine bantla sabitleyin. Kamerayı doğrudan yukarı doğru tarayın (Şekil 4). Kameranın yaklaşık 10 cm yukarısında bir kuluçka rafını emniyete ala.
      NOT: Web kamerası, kuyu yüzeyinin mümkün olduğunca görünümünde olduğundan emin olmak için 96 kuyu plakasını aşağıdan gösterir ve kaydeder (örn. plakanın kuyu duvarları tarafından görüntülenmeden engellenmez). Sinekler KDT'lerine ulaştıklarında kuyunun dibine düşerler; Bu durumda, web kamerasına en yakın yan, ve bu nedenle görünümünde ne kadar onların kuyu görüş merkezinden ne olursa olsun.
   8. Web kamerasını bir bilgisayara bağlayın.
   9. Bantla birlikte, rafın altına beyaz bir kağıt (8,5 cm x 13 cm; 96 kuyu plakasının alt kısmı tam alanı) takın (Şekil 4). Web kamerası üzerinden görüntülendiğinde kağıdın tüm çerçeveyi doldurduğundan emin olun.
   10. Kuvöze bir ışık kaynağı yerleştirin. Aydınlatmayı nemlandırmak ve parlamayı en aza indirmek için kağıt veya diğer malzemeleri kullanın.
       NOT Adım 2.1.10 her kuvöze özgüdür, çünkü ışıklandırma ve yansımalar kuvözler arasında farklılık gösterir. Amaç, web kamerası ile bakıldığında her kuyudaki sinekler ile plakanın arkasındaki beyaz kağıt levha arasında iyi bir kontrast sağlamak için kuvözde yeterli aydınlatmaya sahip olmaktır.
2. Isı KD teşpin ingerçekleştirme
   1. Kuvöze 37,5 °C'ye ayarlayın ve kuvöze ulaşmak ve istenilen sıcaklığı korumak için yaklaşık 30 dakika bekleyin. Tam sıcaklık değerlendirilen böcek ve diğer zaman hususlar bağlıdır.
   2. Kuvözde ters çevrilmiş 96 plakayı, plakanın alt kısmı (kafes tarafı) tepsinin altındaki beyaz kağıda ters yerleştirin(Şekil 4). Tepsideki ve web kamerası çerçevesindeki kuyuların (sütun ve satır adları) yönünü dikkate alın. 96 kuyu plakasının kenarları boyunca renkli bant ve beyaz kağıt parçasının kenarları oryantasyonu doğrulayabilir (Şekil 4).
      NOT: KD ısı testi sırasında plakaiçindeki sıcaklığı bir termokupl ile kaydederek kuvöz sıcaklığının 96 kuyu plakasının içindeki sıcaklıkla tutarlı olduğundan emin olun. Isı KD testini yapmadan önce birden fazla termokupl ile 96 kuyu plaka kuyuları arasında sıcaklık ihmal edilebilir bir varyasyon olup olmadığını kontrol etmek de ihtiyatlı olduğunu kontrol etmek için ihtiyatlı olduğunu.
   3. Kuluçka makinesinin kapısını kapatın.
   4. Video kayıt yazılımına Kaydet'i tıklatın.
   5. 2 saat sonra, tüm sineklerin son dinlenme noktasına ulaştığını ve hareket etmeyi bıraktığını görmek için kaydı kontrol edin. Tüm sinekler hareket etmeyi durdurduktan sonra, video kayıt yazılımında Durdur'u tıklatın. Burada test edilen ve 25 °C'de yetiştirilen genotipler için, sineklerin çoğu KDT'lerine 37,5 °C'de 60 dakika ile ulaşırlar (ayrıca bakınız Jørgensen ve ark.^9).
   6. Sineklerden kurtulun.
   7. Sineklerin ısı KDT'lerine ulaştığında videodaki zamanı yaklaşık olarak belirlemek için özel Python komut dosyalarını(Tamamlayıcı Kodlama Dosyaları 1-3)kullanın.
      NOT: Adım 2.2.7 isteğe bağlıdır. Video analizini hızlandırmak için, her kuyudaki piksel yoğunluğundaki değişiklikleri ölçmek için bir dizi özel Python komut dosyası geliştirilmiştir (bkz. Ek Kodlama Dosyası). Sinekler hareket etmeyi bıraktığında, piksel yoğunluğu sabittir ve sinekler yere düştüğünde videodaki yaklaşık zamanı bulmak için bu verilerin bir çizimi kullanılabilir. Veri çözümlemesi otomatikleştirmek için bu komut dosyası kullanmak mümkün olsa da, video daki şu anda hafif kusurlar piksel yoğunluğundaki değişikliklerle gerçek KD süresi arasındaki küçük tutarsızlıklara yol açar.
   8. Video dosyasını açın ve her bir kuyuda her sinek KDT kaydedin. Denemeler ve gözlemciler arasındaki ısı KDT'nin en tutarlı ölçüsü, bir sineğin son istirahat noktasına ulaştığı zamanı kaydetmektir.
   9. Videoyu tersten izleyin, tek bir kuyuya odaklanın ve sineğin son dinlenme noktasından ilk hareket ettiği zamanı belirtin. Her kuyu için bu işlemi tekrarlayın.

Drosophila melanogaster Genetik Referans Paneli 'nden (DGRP) gelen dişilerin termal limitleri (yani, CTmin ve ısı KDT) açıklanan iki protokolden elde edilen yüksek veri yi göstermek için ölçüldü. CTmin, DGRP hatları 714 (n = 37) ve 913 (n = 45) kullanılarak titreedildi. Isı KDT teşitlenildi ve DGRP hatları 189 (n = 42) ve 461 (n = 42) ile karşılaştırıldı ve video dosyaları el ile analiz edildi. Videoyu izlemek de dahil olmak üzere deneylerin toplam süresi her protokol için <2 saat olarak gerçekleşti.

DGRP Line 913'teki kadınlar, DGRP Hattı 714'teki kadınlara göre anlamlı olarak daha düşük ortalama CTmin sıcaklıklara sahipti(Şekil 5A; Wilcoxon sıralama toplamı testi, W = 1585, P < 0.001). İki hat CTmin'inbelirgin dağılımlarına sahipti : 913 numaralı hat 5,00± 1,35 °C (ortalama ± SD) ve 714 numaralı hattın CTdk'sı 9,60 ± 1,53 °C idi.

37.5 °C'deki ısı KDT, DGRP hatlarından 73 ve 461'deki dişiler arasında anlamlı farklılık gösterirdi (Şekil 5B; Wilcoxon sıralama toplamı testi, W = 1658.5, P < 0.001). Her iki satırın KDT'sinde farklılık olmasına rağmen, çizgiler arasındaki ısı KDT'leri arasındaki farklılıklar kolayca tespit edildi. Hat 73 14,8 dk daha uzun ortalama KDT hattı 461 (Satır 73 ortalama KDT, 55,58 ± 6,92 dk; Satır 461 ortalama KDT, 40,78 ± 6,64 dk).

Şekil 1: CTmin tsurc için ceketli sütunun ayarlanması. (A) Monte ceketli sütun. (B) Üst ve alt fişleri iç oda mühürleme ile ceketli sütun. Termokupl üst fiş bir delik ile dişli. DFM, sütunun altındaki bir retort halkasına monte edilir ve yana doğru hareket ettirilir. (C) CTmin tofunun başlangıcı. Üst fiş çıkarıldı ve sinekler sütunun üst açılışında bir huni ile iç odaya döküldü. (D) CTdk taraması sırasında ceketli kolon ve DFM. Alt fiş sütundan kaldırıldı ve DFM ve huni sütunun altına konumlandırıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Ceketli sütunun teknik çizimi. (A) Akrilik boru her parça uzunluğu kesilmiş: i) iki spacer halkaları uzunluğu (adım 1.1.2):ii) 3,5 cm kesilmiş. en geniş akrilik boru 31,5 cm (adım 1.1.1); ve iii en dar akrilik boru 31,5 cm (adım 1.1.1) kesilmiş. (B) Akrilik borunun en geniş parçasına, her uçtan 3,5 cm ve zıt taraflarda (i; adım 1.1.2) iki delik delinmiş. İki spacer halkası (ii; adım 1.1.6 ve 1.1.7) ile akrilik boru en dar parça montaj. (C) 1.1.8-1.1.12 adımlarını sonra tamamlanan ceketli sütun. Hortum adaptörleri gri renkte gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: 96 iyi no-alt plaka alt (sol) ve üst (sağ) görünümü. Çelik dokuma örgü modifiye edilmiş 96 iyi dipsiz plaka nın altına bağlıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Bir ısı KD teşhebi için kuluçka makinesi kurulumu. (A) Web kamerası ve sahne bir mesafeden ayarlanır. (B) Deneme başlamadan önce kuvözde web kamerası ve sahne kurulumu. Web kamerası kuvöz zemine sabitlenir ve tepsi web kamerasının üzerinde ~10 cm yukarıdadır. (C) Bir ısı KD tsay sırasında web kamerası üzerinde beyaz sahnede 96 kuyu plaka oryantasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Drosophila Genetik Referans Paneli'nden (DGRP) belirli çizgilerin alt ve üst ısıl sınırları. (A) iki DGRP hattının CTmin değerleri. (B) 37.5 °C'de iki DGRP hattının KDT'sini ısıtın.

Şekil 6: Bir test veri kümesinin video analizi komut dosyalarından etkinlik çıktısı. Her çizim, 96 kuyunun bir kuyusunun etkinlik verilerini temsil eder. Toplam 84 örnek test edildi ve gösterilmiştir. Kimlik her histogramın sağında etiketlenmiş.  Bu rakamı görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ek Kodlama Dosyası 1. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ek Kodlama Dosyası 2. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ek Kodlama Dosyası 3. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.