Yöntem makalesi

Fotodönüştürülebilir Dendra2 kullanarak Yaşlanma C. Elegans Protein Ciro Vivo Quantification

DOI:

10.3791/61196

⸱

13 Haziran 2020

 , 
1Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology im Forschungsverbund, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Department of Biology and Chemistry, University of Bremen

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada fotoconvertible florofor Dendra2 erimiş protein huntingtin bozulmasını izlemek için bir protokol sunulmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteinler homeostazkorumak için bir hücre içinde sürekli olarak sentezlenir ve bozulur. İlgi çekici bir proteinin bozulmasını izleyebilmek sadece yaşam döngüsünü değil, aynı zamanda proteostaz ağındaki dengesizlikleri ortaya çıkarmak için de önemlidir. Bu yöntem, hastalığa neden olan protein huntingtin bozulmasıizlemek için nasıl gösterir. Dendra2'ye erimiş huntingtin'in iki versiyonu C. elegans sinir sisteminde ifade edilir: fizyolojik bir versiyonu veya glutaminlerin genişletilmiş ve patojenik uzantısı olan bir versiyonu. Dendra2 fotoconvertible floresan proteindir; kısa bir ultraviyole (UV) ışınlama darbesi üzerine, Dendra2 uyarma / emisyon spektrumları yeşilden kırmızıya değiştirir. Bir darbe-kovalamaca deneybenzer, dönüştürülmüş kırmızı-Dendra2 cirosu izlenebilir ve ölçülebilir, ne olursa olsun yeni sentezlenen yeşil-Dendra2 gelen girişim. Konfokal tabanlı mikroskopi ve C. elegansoptik şeffaflık nedeniyle kullanarak, bir canlı, yaşlanan organizmada huntingtin-Dendra2 bozulmasını izlemek ve ölçmek mümkündür. Nöronal huntingtin-Dendra2 dönüşümden kısa bir süre sonra kısmen bozulur ve zamanla daha da temizlenir. Bozulmayı kontrol eden sistemler mutant huntingtin varlığında eksiktir ve yaşlanma ile daha da bozulur. Aynı sinir sistemi içinde nöronal alt tiphuntingtin-Dendra2 için farklı ciro kapasiteleri sergiler. Genel olarak, Dendra2'ye kaynaşmış herhangi bir ilgi proteininin izlenmesi, sadece bozulması ve ilgili proteostasis ağının oyuncuları hakkında değil, aynı zamanda konumu, ticareti ve ulaşımı hakkında da önemli bilgiler sağlayabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaşayan bir organizmanın proteomu sürekli kendini yeniliyor. Proteinler bir hücrenin fizyolojik talebine göre sürekli olarak bozulur ve sentezlenir. Bazı proteinler hızla ortadan kaldırılırken, diğerleri daha uzun ömürlüdür. Genetik olarak kodlanmış floresan proteinler (LP)'ler kullanılırken protein dinamiklerinin izlenmesi daha basit, daha doğru ve daha az invaziv bir görevdir. FP'ler otokatalitik olarak oluşur ve herhangi bir ilgi proteinine (POI) kaynaşabilir, ancak enzimlerin katlanabilir veya oksijen1için tasarruf kofaktöre ihtiyaç duymasını gerektirmez. Yeni nesil LP'ler, belirlenen dalga boyundaki bir ışık darbesi ile ışınlama üzerine renk değiştirmek üzere tasarlandı. Bu fotoaktibl FP'ler (PAPC'ler) İçN'lerin veya içinde oturdukları organellerin veya hücrelerin etiketlemesine ve izlenmesine ve nicel ve/veya nitel parametrelerini incelemelerine olanak sağlar2. FP'ler, herhangi bir POI'nin hareketini, yönünü, hareket oranını, difüzyon katsayısını, mobil ve hareketsiz fraksiyonları, tek bir hücresel bölmede bulunduğu zamanı ve ciro oranını izlemeyi mümkün kılar. Belirli organeller için, hareket ve taşıma, ya da fizyon ve füzyon olayları belirlenebilir. Belirli bir hücre türü için, bir hücrenin konumu, bölme hızı, hacim ve şekil belirlenebilir. En önemlisi, PAAP'lerin kullanımı sürekli görselleştirme olmadan ve yeni sentezlenmiş herhangi bir sondanın müdahalesi olmadan izleme sağlar. Hem hücrelerde hem de bütün organizmalarda yapılan çalışmalar, kanser ve metastaz, sitoiskeletin montajı veya ayrışması ve RNA-DNA/protein etkileşimleri gibi biyolojik soruları vivo olarak ele almak için PADP'leri başarıyla istihdam etti3. Bu yazıda, ışık mikroskobu ve PAPC'ler nörodejeneratif hastalığın C. elegans modelinde in vivo in agregasyona eğilimli protein huntingtinin (HTT) ciro oranlarını ortaya çıkarmak için kullanılır.

Burada açıklanan protokol, huntingtin-Dendra2 (HTT-D2) füzyon proteininin stabilitesini ve bozulmasını ölçer. Dendra2 ikinci nesil monomerik PAFP4 geri dönülmez ya UV veya görünür mavi ışık yanıt olarak yeşil den kırmızı emisyon / uyarma spektrumları anahtarları, kadar yoğunluğunda bir artış ile 4,000 kat5,6. Huntingtin Huntington hastalığı (HD), ölümcül bir kalıtsal nörodejeneratif bozukluk neden sorumlu proteindir. Huntingtin exon-1 glutaminler (CAG, Q) bir streç içerir. Protein 39Q üzerinde ifade edildiğinde, bir mutant içine yanlış, toksik, ve patojenik protein. Mutant HTT toplama yatkındır ve nöronal hücre ölümü ve dejenerasyona yol açar, ya kısa oligomerik türler olarak ya da daha büyük yüksek yapılandırılmış amiloidler7.

Nematod manipülasyon kolaylığı sayesinde yaşlanma ve nörodejenerasyon eğitimi için bir model sistemidir, izojenik doğa, kısa ömrü, ve optik şeffaflık8. In vivo HTT stabilitesini incelemek için, bir füzyon yapısı C. eleganssinir sisteminde ifade edildi. 25Qs (HTTQ25-D2) fizyolojik bir streç veya 97Qs (HTTQ97-D2) patolojik bir streç içeren bir HTT-D2 transgene nematod ömrü boyunca pan-nöronsal aşırı ifade edilir9. Canlı C. eleganları kısa ve odaklanmış bir ışık noktasına tabi tutarak, tek bir nöron fotoşunla çevrilir ve dönüştürülmüş HTT-D2 zaman içinde izlenir. Bozulmuş HTT-D2 miktarını belirlemek için, yeni dönüştürülmüş HTT-D2'nin kırmızı sinyali arasındaki fark, belirlenen bir süre sonra HTT-D2'nin kalan kırmızı sinyaliile karşılaştırılır. Bu nedenle, huntingtin fizyolojik formuna göre genişletilmiş ve toksik formunda bulunduğunda nasıl bozulduğunu araştırmak mümkün olur; anterior veya posterior nöronlar Q97 karşı Q25 varlığına farklı tepki nasıl, özellikle uzun sürelerde; ve yaşlanma sırasında proteostasis ağının (PN) çöküşünün bozulma oranlarındaki farklılıklara nasıl katkıda olduğu. Bu sonuçlar sadece HTT-D2'nin cirosu üzerine küçük bir gözlem kümesini açıklar. Ancak, protein toplama ve proteostaz alanı ile ilgili daha birçok biyolojik sorular bu in vivo uygulama ile ele alınabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Nöronal Huntingtin-Dendra2 füzyon proteinini ifade eden C. eleganların nesli

  1. Bir nematod ekspresyonu vektör (yani, pPD95_75, Addgene #1494), geleneksel restriksiyon enzim sindirimi10, Gibson montaj11, ya da seçim herhangi bir yöntem tarafından POI kodlama gen klon. İstenilen dokuda veya istenilen gelişim aşamasında ifade yi yönlendirmek için bir organizatör yerleştirin. Dendra2 florofor'u N- veya C-terminalolarak İçN ile çerçeveye yerleştirin.
  2. Füzyon yapısını ifade eden transgenik C elegans üretin (örn. mikroenjeksiyon yoluyla)12.
    NOT: Transgeni taşıyan plazmid ekkromozomal bir dizi olarak kalacaktır. Yapının entegrasyonu gerekli değildir, ancak istenirse yapılabilir13. Bu protokolde, C. elegans pan-nöronal promotör Prgef-1kontrolü altında füzyon yapı huntingtin exon 1-Dendra2 (HTT-D2) taşıyan bir plazmid ile mikroenjekte edildi. C. elegans ekspresyonu omurgası Kreis ve ark.14'ten, Q25 veya Q97 ile huntingtin exon 1'den, Dendra2 ise 15 juenemann ve ark.15'ten,Dendra2 ise Hamer ve ark.16'danelde edilip edinildi.

2. Yaş eşleştirme ve C. elegans bakım

  1. Yaş, alkalin hipoklorit çözeltisi tedavisi17 ile veya 20 °C'de 4 saat boyunca yumurtlayarak tüm nematodlarla eşleşir. Yumurta döşeme için, taze tohumlu nematod büyüme medya (NGM) plaka üzerine 10 gravid yetişkin yerleştirin ve çıkarmadan önce 4 saat bırakın. Bu zaman açıklığı nda yatırılan yumurtalar senkronize nematodlara yol açacaktır.
  2. Nematod büyüme medya deneysel C. elegans tutun (NGM) plakaları bakteriyel gıda kaynağı E. coli OP50 ile tohumlu, standart nematod yetiştiriciliği aşağıdaki18.
  3. Nematodları 20 °C'de istenilen aşamaya kadar yetiştirin. Bu protokol için gerekli yaşlar 4 ve 10 gündür.
    NOT: 4. günde genç erişkinler, gonadlarında yumurta bulunması ve yüksek hareketlilikleri ile tanımlanabilir. 10 yaş arası nematodlar post-doğurgandır ve doku bozulması ve lokomotif düşüşüne uğrar19.
  4. Gün 10 nematodlar için, gün 3 L4 aşamasından sonra günlük geçiş, bir kez nematodlar doğurgan, karışık bir nüfus önlemek için.

3. Görüntüleme için mikroskopi slaytlarının hazırlanması

  1. Görüntüleme günü mikroskopi slaytlarını hazırlayın. Bir mikrodalga, genel sınıf eritmek% 3 (w / v) ddH2O. biraz soğumaya bırakın bir konsantrasyonda agarose.
  2. 1 mL pipet ucunu kesin ve yaklaşık 400 μL erimiş agarose aspire edin. Yavaşça temiz bir cam slayt üzerine agarose birkaç damla yerleştirin ve hemen üstüne başka bir slayt yerleştirin, agarose ince bir yastık ikisi arasında oluşturulan emin olun. Yavaşça kaydırmadan veya üst kaydırağı kaldırmadan önce kurumasını bekleyin.
  3. Agarose pad slaytları kurumasını önlemek için nemli bir kapta yerleştirin. Bunlar 2-3 saat içinde kullanılabilir.
    NOT: Nematodlar içinde sıkışıp olabilir gibi agarose küçük kabarcıklar oluşumunu önlemek.

4. Konfokal mikroskop parametrelerinin tanımı

NOT: Nematodları ve veri toplamayı monte etmeden önce, konfokal toplama yazılımındaki tüm ayarları tanımlayın. Ayarlar, tercih edilen görüntüleme donanımına ve yazılımlarına uyarlanabilir.

  1. Konfokal yazılımı açın ve lazer görüntüleme ayarlarını tanımlayın. 486-553 nm yeşil Dendra2 ve 580-740 nm kırmızı Dendra2 için uyarma / emisyon için ışık yolu ayarlayın. Florofor yoğunluğuna göre her iki kanalın/lazerin gücünü ve kazancını ayarlayın. Dijital kazancı veya mahsupı değiştirmeyin ve iğne deliğini tamamen açık olarak ayarlayın.
  2. Edinme kurulumunu tanımlayın: sıralı bir kanal modu seçin ve her kareyi izleyin. Tetkik modunu çerçeve olarak, çerçeve boyutunu ise 1 satır adımla 1.024 x 1.024 olarak ayarlayın. Ortalama yöntemi ve tek yönlü çizgi modu ile ortalama 2 ve ortalama ayarlayın. Bit derinliğini 8 bit olarak ayarlayın.
  3. Dendra2'nin dönüştürülmesi için çok boyutlu satınalma ayarlarını tanımlayın. Dönüştürme ve beyazlatma için 405 nm diyot lazer seti kullanın 60% enerji gücü. Varsa, dedektörleri korumak için güvenli ağartma GaAsP etkinleştirin.
  4. Arasında 0,0 ms aralığı olan iki döngüden oluşan bir zaman dizisi seçin ve normal başlangıç ve durdurma yı seçin. 2'nin 1'ini tarayıp 30 yineleme için tekrarlayın. Yoğunluk %50'ye düştüğünde beyazlatmayı durdurun.
  5. Edinme/piksel inhızını dönüştürme için hızlı (örn. maksimum = 12) ve anlık bir görüntüyü yakalamak için orta hız (örneğin, orta = 5) olarak tanımlayın.
    NOT: Burada tanımlanan ağartma parametreleri kılavuzdur. Diğer Dendra2 etiketli İçN'ler için lazer güç ayarları ve ağartma yinelemeleri ve değerleri ampirik olarak oluşturulmalıdır.

5. C. eleganların mikroskopi slaytlarına monte

NOT: Mümkünse, konfokal mikroskop kurulumuna yakın bir montaj stereomikroskopyerleştirin ve görüntülemeden hemen önce nematodları monte edin.

  1. Agarose ped in karşı tarafındaki cam kapak slayt, kalıcı bir marker ile dört kareler ile bir pencere çizmek ve onları numaralandırmak.
  2. Pipet 15 l levamisole agarose ped ortasında. Levamisole konsantrasyonu nematod un yaşına göre değişir: Görüntüleme günü 4 nematod2 mM levamisole kullanırken; görüntüleme günü 10 nematod0.5 mM levamisole kullanın.
  3. Bir tel çekme kullanarak sıvı içine dört nematod aktarın. Kirpik çekme yardımı ile, yavaşça bir pencere kare için her bir nematod taşıyın. Kirpik, E. coli OP50'nin herhangi bir izinin seyreltilmesi ve floresan arka planının sinyal edinimini etkilememesi için kirpikleri döndürün.
  4. Nematodların neredeyse hareket etmeyi bırakmasını bekleyin ve agarose ped ile kapak kayması arasındaki levamisole tabakasındaki nematodları hareketsiz hale getirmek için sıvının üzerine hafifçe bir kapak fişi yerleştirin.
  5. Nematodları görüntülemek için ters gelen slaydı konfokal sahneye yerleştirin.

6. Yeşil Dendra2 Dönüşüm: Zaman sıfır veri toplama

NOT: Darbe kovalamaca deneyleri, Dendra2 füzyon proteinini geri dönülmez bir şekilde yeşil yayan florofordan kırmızı bir proteine dönüştürerek başlar.

  1. Mikroskobun mercejini kullanarak, yeşil floresan altında 20x hedefi olan ilk nematod'u bulun. Baş veya kuyruk odaklanın ve konfokal moduna geçin.
  2. EGFP yeşil kanal (ex/ em = 486-553 nm) yeşil Dendra2 görselleştirmek için 488 nm mavi lazer ile canlı lazer tarama başlatın. Tek bir nöron seçin ve odak haline getirmek. Zoom 3x ve lazer ışını hedef artırmak4.
    NOT: Nematod başına bir nöron seçin. Her nöron bir örnek veya veri noktası oluşturacaktır.
  3. Maksimum projeksiyon düzlemini bulun ve floroforparlaklığına göre, renk aralığı göstergesi tarafından tanımlanan doymuş ancak aşırı pozlanmayan bir görüntü elde etmek için kazancı veya lazer gücünü artırın veya azaltın. Bu tanımlandıktan sonra, taramayı durdurun.
    NOT: Çok uzun süre veya çok fazla güç ile örnek ışınlama etmeyin, görünür mavi 488 nm ışık ile uyarma da Dendra2 dönüştürebilirsiniz gibi, yavaş ve daha az verimli de olsa4.
  4. Yazılımda, ilgi alanları (ROI) seçmek ve seçilen nöronun etrafına ilk yatırım getirisini çizmek için sekmeyi açın. Nematod'un başını ve ilk Yatırım Getirisi'ni kapsayan daha büyük bir ikinci ilgi bölgesi tanımlayın.
  5. Beyazlatma ayarlarında, elde edilecek, ağartılacak ve analiz edilecek ilk Yatırım Getirisi'ni seçin. İkinci Yatırım Getirisi'nin elde edilip analiz edilmesi ancak ağartılmamamasını seçin.
  6. Tarama hızını maksimuma ayarlayın (yani, hızlı piksel deyanımı) ve seçili Dendra2 nöronları dönüştürmek için denemeyi başlatın.
    NOT: Deneme yapıldıktan sonra elde edilen resim iki resimle sonuçlanır: biri dönüşümden önce ve diğeri dönüştürmeden önce ve diğeri. Yeşil kanal için, ilk görüntü yeşil Dendra2 dönüşüm nedeniyle ikinci görüntü azalır daha yüksek bir yeşil sinyal olmalıdır. Kırmızı kanal için, ilk görüntü negatif olmalı ve dönüşüm sonrası görüntüde kırmızı bir sinyal görünarak sinyal göstermemelidir. Yeşil sinyal azalmazsa, dönüştürme gerçekleşmedi ve 405 lazer gücü veya yineleme sayısı gibi ayarlar değiştirilmelidir. İlk görüntüde kırmızı bir sinyal varsa, kullanılan 488 nm lazer gücü çok yüksekti ve yeşil Dendra2'nin bir kısmı zaten kırmızıya dönüştürülmüştü. Bu durumda yeni bir nöron/nematod seçilmelidir.
  7. Dönüşümden hemen sonra, kırmızı kanalda (ex/em = 580-740 nm) Dendra2'yi görselleştirmek için yeşil 561 nm lazerle canlı tarama yapmaya başlayın. Aşırı pozlamayı önlemek için aralık renk göstergesini kullanarak dönüştürülmüş nöronun odak noktasını ve ilgili maksimum projeksiyonu bulun.
  8. Tbmöhız hızını daha düşük piksel inyanış hızına (örneğin, 5x) ayarlayın ve her iki kanalın anlık görüntüsünü daha yüksek çözünürlükte elde edin. Bu resim dönüştürmeden sonra zaman noktası sıfır (T0) olarak tanımlanır.
    NOT: Dönüştürülen görüntünün edinme hızı çeşitli olabilir. Ancak, bir kez seçildikten sonra, bu hız veri toplama boyunca sabit kalması gerekir.
  9. Tcan'ı tanımlanabilir bir ad ve/veya sayıyla kaydedin ve ardından sıfır etiketi (T0) seçin.
    NOT: Dönüştürme den önce kırmızı sinyal eksikliğini ve daha sonra görünümünü göstermek için dönüştürme deneyinin (adım 6.6) görüntüsünü kaydetmek de tavsiye edilir.

7. Seçilen ikinci zaman noktasında veri toplama için dönüştürülmüş kırmızı Dendra2'nin görüntülenmesi

  1. Zaman içinde Dendra2 bozulmasını izlemek için, aynı nematod/nöronu yeniden görüntülemek için ikinci bir zaman noktası tanımlayın. İlgili biyolojik sorunu çözmek için deneysel olarak ikinci zaman noktasını seçin. Burada açıklanan protokol için, Dendra2 hem 2 saat (T2) hem de 24 saat (T24) sonrası dönüşümde görüntülenir.
    1. Seçilen zaman diliminde, göz parçası ve kırmızı floresan kullanımı ile aynı nematod / nöron bulabilirsiniz.
    2. İlgili nematod/nöron T0 görüntüsünü açın ve görüntü ayarlarını yeniden yükleyin/yeniden kullanın. T0, T2 ve T24 h görüntülerini alırken anlık görüntünün edinme ayarlarının tam olarak aynı olduğundan emin olun.
    3. Kırmızı kanalda canlı tarama, odak dönüştürülmüş kırmızı nöron getirmek. Kırmızı Dendra2 zaman içinde bozulduğu için aralık göstergesi daha az yoğun bir maksimum projeksiyon gösterir. Herhangi bir edinme parametrelerini değiştirmeyin ve ilk görüntüyle aynı hızda (örneğin, 5x) anlık görüntü elde etmeyin.
  2. 4 saat veya daha uzun bir süre sonra Dendra2'nin bozulmasını izlemek için, dönüşümden sonra nematodları kurtarın.
    1. Dört nematodun dönüştürülmesive görüntülenmesinden hemen sonra slaytı mikroskoptan çıkarın. Kapak kapağını hafifçe çıkarın ve bir tel çekme kullanarak, agarose pedden her nematodu kaldırın.
    2. Her nematod'u uygun şekilde etiketlenmiş ve tanımlanabilir bir NGM plakasına ayrı ayrı yerleştirin.
    3. İkinci kez nokta için, taze bir agarose ped üzerine tekrar nematod monte ve bölüm 6 talimatları aşağıdaki dönüştürülmüş kırmızı Dendra2 görüntüleme ile devam edin.

8. Dönüştürülmüş Dendra2 görüntü analizi

NOT: Dendra2 bozulmasıanalizi Fiji / ImageJ yazılım20ile gerçekleştirilir.

  1. Fiji'yi açın ve .lsm dosyasını Fiji çubuğuna sürükleyip bırakın. Dönüşümden hemen sonra çekilen T0 görüntüsünü ve dönüşümden sonra seçilen zaman noktasında çekilen aynı nematod görüntüsünü (T2 veya T24 h) açın.
    NOT: Dendra2'ye kaynayan ilgi proteininin bozulmasını izlemek için sadece kırmızı kanalın analiz edilmesi gerekir.
  2. Menüden ölçüm parametrelerini belirleyin: Analiz | Ölçümleri Ayarlayın. Alan ve Tümleşik Yoğunluk işlevlerini seçin.
  3. Kırmızı kanalla elde edilen görüntüyü seçin. Fiji çubuğundan Çokgen Seçim Aracı'nı seçin.
  4. T0 görüntüsündeki dönüştürülmüş nöronu belirleyin ve seçim aracını kullanarak etrafına bir yatırım getirisi çizin.
    1. Nöronun hatlarını düzgün bir şekilde tanımlamak için, çubuk Görüntü'den seçerek yoğunluk eşiklerini vurgulayın | Ayarla | Eşik. Eşiğe dikkat etmek ve çokgen aracıyla bu alanı izlemek için çubuk imleci sürükleyin. Doğru bir yatırım getirisi oluşturmak için, yeşil kanaldan seçilen nöron kontur unu kullanmak da mümkündür.
  5. Seçim kırmızı kanal penceresinde yapıldıktan sonra Analiz Et | Ölçün. Sonuçlar adlı bir açılır pencere görüntülenir ve Alan, IntDenve RawIntDeniçin YG değerlerini içerir.
  6. İkinci zaman noktasının (T2 veya T24 h) görüntüsü için aynı seçim ve ölçüm işlemini gerçekleştirin.
  7. Elde edilen değerleri bir elektronik tablo yazılımına kopyalayın, dönüşümden sonra T0'daki değerleri ve dönüşümden sonra T2 veya T24 h değerlerini uygun şekilde kaydetmeye özen gösterir.

9. Dendra2 bozunma oranının hesaplanması

  1. Bozulma oranını hesaplamak için, önce 1 (veya %100) bir değer atayın zaman sıfırdan bozulma zaman (yani, dönüşüm hemen sonra, kırmızı Dendra2 dönüştürülmüş tüm hala mevcut olduğunda). Bu, T0 intRawDen değerini tek başına bölünmesi sonucu ortaya çıkar.
  2. Kırmızı Dendra2 yoğunluk sinyalinin zaman içinde azaltılmasını ve bozulmayı hesaplamak için, ikinci zaman noktasının RawIntDen değerini (örneğin, T2 veya T24 h) T0 RawIntDen değerine bölün. Elde edilen sayı 1'den az olmalıdır. Bu değerler, T0'ı %100 olarak tanımlayarak yüzde olarak da ifade edilebilir.
  3. Dönüştürülmüş her nematod için bölüm 7 tekrarlayın. Dendra2'nin bozulmasının grafik gösterimi için, y ekseninde elde edilen floresan düşüş yüzdesi veya oranı değerlerini içeren bir dağılım çizimi veya çubuk grafiği çizin. İstenilen herhangi bir istatistiksel analiz uygulayın ve grafiküzerinde gösterin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotoconvertible protein Dendra2 ile çerçeve içinde huntingtin ekson-1 protein parçasını ifade eden iki nematod suşmikroenjeksiyon ile elde edilmiş ve plazmidler ekstrakromosomal dizi olarak tutulmuştur. Füzyon yapısı tüm C. elegans sinir sistemi gelişiminden yaşlanma boyunca ifade edildi. Burada HTT-D2 fizyolojik 25 poliglutamin streç (HTTQ25-D2, Şekil 1A)veya 97 glutamin (HTTQ97-D2, Şekil 1B)

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir proteinin işlevini anlamak için sentezini, yerini ve bozulmasını anlamak önemlidir. Yeni, kararlı ve parlak LP'lerin geliştirilmesiyle, İçN'lerin görselleştirilmesi ve izlenmesi daha kolay ve verimli hale gelmiştir. Dendra2 gibi genetik olarak ifade edilen füzyon PAFP'leri bir İçN'nin stabilitesini incelemek için benzersiz bir konuma sahiptir. Mor-mavi ışığa maruz kaldıktan sonra, Dendra2 korunmuş amino asitlerin bir üçlü içinde kesin bir yerde tatili. Florofor küçük bir yapısal değişime uğrar, yeşilden

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz DFG (KI-1988/5-1 JK, NeuroCure Doktora Bursu MLP mükemmellik NeuroCure Küme tarafından) finansman için kabul ediyoruz. Ayrıca Leibniz Moleküler Farmakoloji Enstitüsü Berlin Görüntüleme Çekirdek Tesisi (FMP) görüntüleme kurmak sağlamak için kabul ediyoruz. Buna ek olarak, laboratuvarda Dendra2 sistemini kuran ve talimatlar veren Diogo Feleciano'ya teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Agar-Agar Kobe ICarl Roth GmbH + Co. KG5210.2NGM bileşeni
Agaroz, Evrensel SınıfBiyo & Sell GmbHBS20.46.500Montaj sürgü bileşeni
BD Bacto PeptoneBD-Bionsciences211677NGM bileşeni
Deckglä ser-18x18mmCarl Roth GmbH + Co. KG0657.2Kapak fişleri
EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27Carl Zeiss AGObjektif
Fiji/ImageJ 1.52pNIHAnaliz Yazılımı
Levamisol HidroklorürAppliChem GmbHA4341Anestezik
LSM710-ConfoCor3Carl Zeiss AGLazer Taramalı Konfokal Mikrooskop
Stereomikroskop montajıLeica Camera AGMontaj mikroskobu
nöronal-HTTQ25-Dendra2bu kağıtC. elegans suş
nöronal-HTTQ97-Dendra2bu makaleC. elegans suşu
OP50 Escherichia coliCAENORHABDITIS GENETİK MERKEZİ (CGC)OP50Nematod besin kaynağı
Sodyum KlorürCarl Roth GmbH + Co. KG3957.2NGM bileşeni
Standart-Objektträ gerCarl Roth GmbH + Co. KG0656.1Cam slaytlar
ZEN2010 B SP1Carl Zeiss AGKonfokal edinim yazılımı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).
  2. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments. Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).
  3. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).
  4. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).
  5. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
  6. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).
  7. Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005(2015).
  8. Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).
  9. Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons. Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).
  10. Addgene. Plasmids 101: A Desktop Resource. , 3rd Edition, https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition 45-50 (2020).
  11. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  12. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  13. Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments. (82), e50773(2013).
  14. Kreis, P., et al. ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
  15. Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).
  16. Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).
  17. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
  19. Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. , 1-19 (2005).
  22. Ross, C. A., Poirier, M. A. What is the role of protein aggregation in neurodegeneration? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).
  23. Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2. Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).
  24. Tsvetkov, A. S., et al. Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration. Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).
  25. Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).
  26. Feleciano, D. R., et al. Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).
  27. Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
  28. Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. High resolution measurement of membrane receptor endocytosis. Journal of Biological Methods. 5 (4), 105(2018).
  29. Gunewardene, M. S., et al. Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells. Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Dendra2 PhotoconversionConfocal MicroscopyHuntingtin DegradationProteostasis NetworkNeuronal SubtypesLive ImagingFluorescence QuantificationAging Organism

İlgili makaleler