Rotasyonel İvmeye Dayalı Sıçanlarda Diffüz Aksonal Beyin Hasarıİn İndüksiyonu

Travmatik beyin hasarı (TBI) Amerika Birleşik Devletleri'nde ölüm ve sakatlık önemli bir nedenidir. Tüberküloz tüm yaralanmaya bağlı ölümlerin yaklaşık% 30 katkıda^1,2. TBI önde gelen nedenleri yaş grupları arasında farklılık ve düşme dahil, spor sırasında yüksek hızlı çarpışmalar, kasıtlı kendine zarar, motorlu araç kazaları ve saldırılar^1,2,3.

Beyin diffüz aksonal yaralanma (DAI) rotasyonel ivme ile indüklenen TBI belirli bir türüdür, yaralanma sonra anında sınırsız kafa hareketi sonucu beynin sallayarak veya patlama yaralanması^4,5,6,7,8. DAI kötü sonuç ile ilişkili uzun süreli nörolojik bozulmaya yol açan yaygın aksonal hasar içerir, külfetli sağlık maliyetleri, ve 33-64% mortalite oranı^{1,2,4,5,9,10,11}. DAI patogenezi içine önemli son araştırmalara rağmen, en iyi tedavi seçenekleri 11 , 12^,,13,1214üzerinde bir fikir birliği olmamıştır.¹⁴

Son yıllarda, çok sayıda deneysel modeller doğru DAI^{11, 12,,15,16}farklı yönlerini çoğaltmak için çalıştık.¹² Ancak, bu modeller dai benzersiz sunumu verilen sınırlamalar diğer odak yaralanmaları ile karşılaştırıldığında var. Bu önceki modeller sadece beyaz madde bölgelerinde aksonal yaralanmalara neden değil, aynı zamanda fokal serebral yaralanmalara neden. Klinik olarak, DAI mikro kanamalar eşlik eder, hangi beyaz maddeye zarar önemli bir neden teşkil edebilir.

DAI'nin temel klinik özelliklerini taklit etmek için sadece iki hayvan modeli gösterilmiştir. Gennarelli ve arkadaşları ilk lateral kafa rotasyon cihazı üretilen 1982, insan olmayan bir primat modelinde DAI ile komaya neden olmak için darbesiz kafa dönme ivmesi kullanarak¹⁵. Bu primat modeli, 10-20 ms içinde başın 60° üzerinden yerinden edilmesi için kontrollü tek rotasyon uğrama neden oldu. Ancak, primat modelleri çok pahalı^4,11,16. Önceki modele göre kısmen, rotasyonel ivme beyin hasarı bir domuz modeli 1994 yılında tasarlanmıştır (Ross ve ark.) benzer sonuçlar¹⁴.

Bu iki hayvan modeli, tipik patolojinin farklı sunumlarını üretseler de, DAI patogenezi kavramlarına büyük ölçüde katkıda bulunmaktadır. Hızlı baş rotasyonu genellikle DAI indükleme için en iyi yöntem olarak kabul edilir, ve kemirgenler hızlı kafa rotasyonçalışmaları için daha az pahalı bir model sağlamak^11,16. Burada, kafatası kırıkları veya çürükler olmadan yaygın beyaz madde hasarına neden olan DAI basit, tekrarlanabilir ve güvenilir bir kemirgen modelini doğrulıyoruz. Bu mevcut model DAI patofizyolojisi ve daha etkili tedavilerin geliştirilmesi daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.

Deneyler Helsinki ve Tokyo Bildirileri'nin ve Avrupa Topluluğu'nun Deneysel Hayvanlarının Kullanımına İlişkin Yönergeler'in önerileri doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. Deneyler Negev Ben-Gurion Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı.

1. Farelerin deneysel prosedüre hazırlanması

NOT: 300-350 g ağırlığında yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçanları seçin.

1. Bu deneylerin kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesinden yapılıyor.
2. Sıçanları 22 ± 1 °C oda sıcaklığında, 12 saat Açık ve 12 saatlik karanlık döngülerle koruyun. Sıçan chow ve su reklam libitum sağlayın.
3. 06:00 ile 12:00 arasında tüm deneyleri gerçekleştirin.
4. Anestezi neden sürekli bir isoflurane yönetim sistemi kullanın. Buharlaştırıcı sisteminin isoflurane ile dolu olduğundan emin olun.
   1. Fareleri %2 isoflurane ile anestezi.
   2. Bir dış uyaranlara yanıt olarak hareket veya pedal refleks eksikliği gözlemleyerek sıçan tamamen anestezi olduğunu onaylayın.

2. Diffüz aksonal yaralanma indüksiyonu

NOT: Cihaz aşağıdaki bileşenlerden oluşur: 1) şeffaf plastik silindir, 2) demir ağırlığı (1308 g), 3) silindirik bir tüpten oluşan dönme mekanizması, eksenin döndüğü iki rulman ve bir kafa fiksasyonu (kulak pimleri için); 4) üzerinde iki rulman sabit olan yatay platform.

1. Cihazı ağır ve kararlı bir laboratuvar masasına yerleştirin.
2. Ağırlığı 120 cm yüksekliğe yükseltilmiş bir dize takın.
3. Serbestçe düşen ağırlığın cıvataya çarpmasına izin vererek dönme mekanizmasını etkinleştirin. Yanal kafa döndürme cihazı kullanılarak kemirgenin başı 0'dan 90°'ye doğru hızla döndürülür.
4. Diffüz aksonal beyin hasarı indüksiyon sonra, bir kurtarma odasına sıçan transfer.

3. Rotasyonel Kinematik/Biyomekanik parametrelerin ölçümü.

1. Rotasyonel kinematik/biyomekanik parametreleri aşağıdaki gibi ölçün:
   
   
   
   burada F_o - kuvvet hayvan kafasına (kg) uygulanır; M – kuvvet momenti; K – kinetik enerji; m – düşen ağırlığın kütlesi; g - yerçekimi ivmesi; h – yükseklik (cm); D – kulak pimleri arasındaki mesafe (cm).
   NOT: Hayvanın kafasına uygulanan kuvveti hesaplamak için (F_o),düşen ağırlığın kütlesini, ağırlığın düştüğü yüksekliği ve kulak pimleri arasındaki mesafeyi bilmek gerekir. Diğer parametreler değişmeden kalır.

4. 48 saat sonra Nörolojik Şiddet Puanının Değerlendirilmesi

NOT: Nörolojik açıklar değerlendirildi ve nörolojik Şiddet Puanı kullanılarak derecelendirildi, daha önce açıklandığı gibi^17,18,19. Motor fonksiyon ve davranış değişiklikleri bir nokta sistemi tarafından öyle değerlendirilir ki maksimum 24 puan ciddi nörolojik disfonksiyon temsil eder. 0 puan sağlam nörolojik durumu gösterir. Aşağıdaki davranışsal fonksiyonlar değerlendirilir.

1. Farenin merkezinde bırakıldığında bir daireden (50 cm çapında) çıkamamasını değerlendirin. 30 dk, 60 dk ve 60 dk'dan fazla süren üç ayrı seans için bunu gerçekleştirin.
2. 20 dk, 40 dk ve 60 dk üzerinde süren üç seansta düzeltme refleksi kaybı için sıçanı test edin.
3. Hemipleji için test gerçekleştirin, pozisyonda zorunlu değişikliklere direnmek için sıçan yetersizlik.
4. Arka ekstremitenin fleksiyonunu test etmek için fareyi kuyruğundan kaldırın.
5. Düz yürüme yeteneğini test etmek için yere sıçan yerleştirin.
6. Üç ayrı refleks için test: pinna refleks, kornea refleks, ve ürkme refleks.
7. Tedavi ve secde kaybına dayalı bir klinik notu ile sıçan oranı.
8. Yerleştirme için ekstremite reflekslerini test edin. Testi sol ve sağ ön bacaklarda, sonra sol ve sağ arka bacaklarda yapın.
9. Işın dengeleme görevi ile işlevsel bir test gerçekleştirin. Işın 1,5 cm genişliğinde olmalıdır. 20 s, 40 s ve 60'tan fazla oturumları için testi çalıştırın.
10. 8,5 cm genişliğinde, 5 cm genişliğinde ve 2,5 cm genişliğinde üç farklı genişlikte kiriş li fare üzerinde ışın yürüyüş testi yapın.

5. 48 saat sonra histolojik muayene için beyin toplama

1. Yaralanmadan 48 saat sonra, ilham verici gaz karışımlarını O 2/80% CO₂ile değiştirerek fareleri ötenaziye edin.₂ CO_2'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi yönergelerine uygun olarak önceden belirlenmiş bir oranda teslim edilmesini sağlayın.
   1. Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi yönergelerine uygun olarak ölüm onayı sağlamak.
2. Transkardiyak olarak sıçana 4 °C sıcaklıkta %0,9 heparinize salin, ardından 0,1 M fosfat tampon salininde %4 paraformaldehit 500 mL (pH 7.4) ile perfuse.
3. Perfüzyon dan sonra, bir giyotin ile decapitation gerçekleştirin.
4. Beyin dokusuzarar önlemek için kemik kesme forceps ile calvarias kaldırarak beyin toplama gerçekleştirin.
5. Hemen beyni çıkarın ve 4 °C'de 48 saat için %4 tamponlu formaldehit çözeltisi düzeltin.
6. Koku ampul yüz görsel korteks ve bisect serebellums ve beyin sapları için 5 mm koronal bölümlere beyin bloğu.
7. Parafin katıştırma işleminden sonra, mikrotom kesiti ile talamustan koronal ve sagital kesitleri (5 μm) uzağa kesin.

6. İmmünokimyasal boyama ve muayene

1. Dilimleri yumuşak bir fırçayla, slayt başına 1 dilim le cam slaytlara yavaşça yerleştirin.
2. βAPP'ın immünokimyasal boyamalarını üretin.
   1. Ksilen ile dilimleri deparafinize (5 dakika her biri için 3 kez) ve oda sıcaklığında etanol kademeli olarak azaltılmış konsantrasyonları ile rehydrate: 3 dakika 100% etanol iki kez, 3 dk 95% etanol iki kez, 3 dk 90% etanol, 3 dk% 70 etanol ve DDW 3 dk.
   2. Endojen peroksidaz aktivitesini engellemek için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %3 H₂O₂ ile deparafinize edilmiş ve rehidrata olmuş beyin bölümlerini tedavi edin.
   3. Antijen alımı için 5 dk için 98 °C'de 0,01 M sodyum sitrat (pH 6.0) içeren kuluçka bölümleri.
   4. Soğuması için oda sıcaklığında 20 dakika tampon slaytlar tutun.
   5. 5 dk boyunca iki kez fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi ile yıkama bölümleri.
   6. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca %2,5 normal at serumu ile bölümleri bloke eden serumda seyreltilmiş primer tavşan anti-APP (1:4000) ile 4 °C'de geceleme yi engelleyin.
   7. Primer antikorda kuluçkadan sonra PBS'deki bölümleri oda sıcaklığında yıkayın.
   8. Uygun seyreltilmiş biyotinylated ikincil antikor da kuluçka bölümleri 15 dakika ve oda sıcaklığında iki kez 3 dakika PBS ile yıkayın.
   9. Streptavidin-peroksidaz içinde 15 dakika kuluçka ve oda sıcaklığında iki kez 3 dakika PBS tekrar yıkayın.
   10. Arabelleğe alkan substrat çözeltisi (pH 7.5) içeren inkübasyon kesitleri hidrojen peroksit ve 3,3-diaminobenzidin kromojen çözeltisi içerir ve renk geliştirilinceye kadar ışıktan korunur.
   11. Reaksiyonu durdurmak için slaytları oda sıcaklığında 5 dk boyunca DDW ile kuluçkaya yatırın.
   12. Oda sıcaklığında 3 dakika hematoksilin ile karşı leke bölümleri ve akan musluk suyu ile 5 dakika yıkayın.
   13. Oda sıcaklığında giderek artan etanol konsantrasyonları ile slaytlar dehydrate: DDW 2 dk, 2 dk 70% etanol, 2 dk% 90 etanol, 2 dk etanol 95%, 2 dk 100% etanol ve 3 dk ksilene üç kez.
   14. Kuru ve montaj ortamı ile monte.
3. 200x'lik mikroskop büyütme si lik dilimleri, mikroskop kullanarak 20 mm objektif lensle inceleyin.

Tablo 1 protokol zaman çizelgesini göstermektedir. Bu DAI modelinde mortalite oranı %0 idi. Mann-Whitney testi, müdahaleden sonraki 48 saat içinde 15 dai sıçana kıyasla 15 DAI sıçanda nörolojik açığın anlamlı olarak daha fazla olduğunu göstermiştir (Mdn = 1 vs. 0), U = 22.5, p < 0.001, r = 0.78 (bkz. Tablo 2). Veriler sayımlarda ölçülür ve ortanca ve yüzde 25-75 aralığı olarak sunulur.

Beyin dokusunun talamik bölümlerinin temsili fotomikrografları Şekil 1'degösterilmiştir. Fotomikrograflarda sıçanlarda izole DAI'den sonra aksonal ve nöronal βAPP immünoreaktivitesi kontrol grubuna göre 48 saat sonrası yaralanma (67.46 ± 30 vs. 0 ± 0), U = 0, p < 1.1E-06, r = 0.92 saptandı. Veriler sayı olarak ölçülür ve ortalama ± SD olarak sunulur.

Tablo 1: Protokol zaman çizelgesinin gösterilmesi. Farklı zamanlarda sıçanların çeşitli gruplar gösterilir: DAI = Deneyin başında diffüz aksonal beyin hasarı; 48 saat içinde nörolojik Şiddet Skoru belirlendi ve her iki grupta da βAPP immünokimyasal boyama yapıldı.

Tablo 2: Nörolojik şiddet skoru. 2 çalışma grubu için DAI'den 48 saat sonra nörolojik açık. Mann-Whitney testi, müdahaleden sonraki 48 saat içinde 15 dai sıçana kıyasla 15 DAI sıçanda nörolojik açığın anlamlı olarak daha fazla olduğunu göstermiştir (Mdn = 1 vs. 0), U = 22.5, p < 0.001, r = 0.78. Veriler sayımlarda ölçülür ve ortanca ve yüzde 25-75 aralığı olarak sunulur.

Şekil 1: İmmünokimyasal inceleme. Beyin dokusunun talamik bölümlerinin temsili fotomikrografları, sıçanlarda izole DAI(B) 48 saat sonrası yaralanmadan sonra kontrol grubuna (A) göre aksonal ve nöronal immünoreaktivite saptandı. βAPP immünreaktivitesi 15 DAI sıçanının tümünün ilgi gösterdiği bölgede saptandı ve hiçbir sahte sıçanda saptanmadı. Mann-Whitney testi, βAPP -pozitif akson sayısının 15 DAI sıçanı için DAI (67.46 ± 30 vs. 0 ± 0 ), U = 0, p< 1.1E-06, r = 0.92'den sonra 48 h'de sahte yaralı hayvanlara göre anlamlı olarak daha fazla olduğunu göstermiştir. Görüntüler orijinal büyütme * 200 bulunmaktadır. Veriler sayı olarak ölçülür ve ortalama ± SD olarak sunulur.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.