Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kemirgenlerde Kapalı Başlı Hafif Travmatik Beyin Hasarının Preklinik Değerlendirmesi için Düşük Yoğunluklu Patlama Dalgası Modeli

2.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61244

⸱

6 Kasım 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Geriatrics Research Education and Clinical Center, Veterans Affairs, 2Division of Gerontology and Geriatric Medicine, University of Washington, 3Department of Neurosurgery, University of Florida, 4Department of Neurosurgery, West Virginia University, 5Division of Pharmaceutical Sciences, University of Cincinnati, 6Central Illinois Neuro Health Sciences, Bloomington, IL, 7Neuro-research, Dallas, TX

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, hafif ila orta dereceli travmatik beyin hasarının nörobiyolojik ve patofizyolojik etkilerini araştırmak için kemirgenler için bir patlama dalgası modeli protokolü sunuyoruz. Patlamaya bağlı hafif ila orta dereceli travmatik beyin hasarının güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde üretilmesini sağlayan basınç sensörleriyle donatılmış, gazla çalışan, tezgah üstü bir kurulum kurduk.

Özet

Travmatik beyin hasarı (TBH) büyük ölçekli bir halk sağlığı sorunudur. Hafif TBI, nörotravmanın en yaygın şeklidir ve Amerika Birleşik Devletleri'nde çok sayıda tıbbi ziyarete neden olur. Şu anda TBI için FDA onaylı bir tedavi bulunmamaktadır. Askeri ilişkili, patlamaya bağlı TBI insidansının artması, etkili TBH tedavilerine olan acil ihtiyacı daha da vurgulamaktadır. Bu nedenle, insan patlaması ile ilişkili TBI'nın yönlerini özetleyen yeni klinik öncesi TBI hayvan modelleri, hafif ila orta dereceli TBI'nın altında yatan nörobiyolojik ve patofizyolojik süreçlere yönelik araştırma çabalarını ve TBI için yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesini büyük ölçüde ilerletecektir.

Burada, hafif ila orta derecede patlamaya bağlı TBI'nın moleküler, hücresel ve davranışsal etkilerinin araştırılması için güvenilir, tekrarlanabilir bir model sunuyoruz. Tutarlı test koşulları sağlamak için piezoelektrik basınç sensörleri ile donatılmış gazla çalışan bir şok tüpünden oluşan bir tezgah üstü kurulum kullanarak, kemirgenlerde kapalı kafalı, patlamaya bağlı hafif TBI için adım adım bir protokol açıklıyoruz. Kurduğumuz kurulumun faydaları, göreceli olarak düşük maliyeti, kurulum kolaylığı, kullanım kolaylığı ve yüksek verim kapasitesidir. Bu non-invaziv TBI modelinin diğer avantajları, patlama tepe aşırı basıncının ölçeklenebilirliğini ve kontrollü tekrarlanabilir sonuçların üretilmesini içerir. Bu TBH modelinin tekrarlanabilirliği ve alaka düzeyi, nörobiyolojik, nöropatolojik, nörofizyolojik ve davranışsal analizler de dahil olmak üzere bir dizi aşağı akış uygulamasında değerlendirilmiş ve bu modelin hafif ila orta dereceli TBI etiyolojisinin altında yatan süreçlerin karakterizasyonu için kullanılmasını desteklemektedir.

Giriş

Travmatik beyin hasarı (TBI), yalnızca Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl iki milyondan fazla hastane ziyaretine neden olmaktadır. Genellikle araba kazalarından, spor etkinliklerinden veya düşmelerden kaynaklanan hafif TBI, tüm TBH vakalarının yaklaşık %80'ini temsil eder1. Hafif TBI 'sessiz hastalık' olarak kabul edilir, çünkü hastalar genellikle ilk hakareti takip eden günlerde ve aylarda açık semptomlar yaşamaz, ancak daha sonraki yaşamlarında TBI ile ilişkili ciddi komplikasyonlar geliştirebilir2. Ayrıca, patlamaya bağlı hafif TBI, askerlik hizmeti üyeleri arasında yaygındır ve kronik CNS disfonksiyonu ile ilişkilendirilmiştir3,4,5,6. Patlamaya bağlı hafif TBI7,8 insidansının artması nedeniyle, hafif TBI ile ilişkili nörobiyolojik ve patofizyolojik süreçlerin klinik öncesi modellenmesi, TBI için yeni terapötik müdahalelerin geliştirilmesinde odak noktası haline gelmiştir.

Tarihsel olarak, TBI araştırması, nispeten daha düşük sayıda şiddetli insan TBI vakasına rağmen, öncelikle ciddi nörotravma formlarına odaklanmıştır. Şiddetli insan TBH'si için klinik öncesi kemirgen modelleri, her ikisi de güvenilir patofizyolojik etkiler üretmek için iyi kurulmuş olan kontrollü kortikal etki (CCI)9,10 ve sıvı perküsyon hasarı (FPI)11 modelleri de dahil olmak üzere geliştirilmiştir12,13. Bu modeller, bugün TBI'da nöroinflamasyon, nörodejenerasyon ve nöronal onarım hakkında bilinenlerin temelini atmıştır. TBİ'nin patofizyolojisi hakkında önemli bilgiler geliştirilmiş olmasına rağmen, şu anda TBI için etkili, FDA onaylı bir tedavi bulunmamaktadır.

Daha yakın zamanlarda, TBI araştırmasının odak noktası, etkili terapötik müdahaleler geliştirme nihai hedefi ile TBI ile ilişkili patolojilerin daha geniş bir spektrumunu içerecek şekilde genişletilmiştir. Bununla birlikte, hafif TBH için ölçülebilir etkiler gösteren az sayıda preklinik model oluşturulmuştur ve hafif TBI spektrumunu araştıran sadece az sayıda çalışma yapılmıştır2,14,15. Hafif TBH, tüm TBH vakalarının büyük çoğunluğunu oluşturduğundan, yeni terapötik stratejiler geliştirmek için insan durumunun etiyolojisi ve nöropatofizyolojisi üzerine araştırmaları kolaylaştırmak için hafif TBI'nın güvenilir modellerine acilen ihtiyaç vardır.

Biyomedikal mühendisleri ve havacılık fizikçileri ile birlikte, hafif ila orta TBI için ölçeklenebilir, kapalı başlı bir patlama dalgası modeli oluşturduk. Bu klinik öncesi kemirgen modeli, askeri mücadelede, spor etkinliklerinde, araba kazalarında ve düşmelerde elde edilen hafif TBI ile ilişkili patlama dalgaları ve hızlanma / yavaşlama hareketi de dahil olmak üzere kuvvet dinamiklerinin etkilerini araştırmak için özel olarak geliştirilmiştir. Patlama dalgaları, insanlarda hafif TBI'ya neden olan kuvvet dinamikleri ile ilişkili olduğundan, bu model, inç kare başına pound (psi) * milisaniye (ms) olarak ölçülen bir dürtü ile tutarlı bir Friedlander dalga formu üretmek üzere tasarlanmıştır. Dürtü seviyesi, klinik öncesi araştırmalar yapmak için fareler ve sıçanlar için tanımlanmış akciğer öldürücülük eğrilerinin altına düşecek şekilde ölçeklendirilir16,17,18. Ek olarak, bu model, hayvanın başının hızlı dönme kuvvetleri nedeniyle darbe ve contrecoup yaralanmasının araştırılmasına izin verir. Bu tür yaralanmalar, hem askeri hem de sivil popülasyonlarda gözlenenler de dahil olmak üzere çeşitli klinik TBI sunumlarına özgüdür. Bu nedenle, bu çok yönlü model, TBI'nın çoklu klinik sunumlarını kapsayan bir ihtiyaca uygundur.

Burada sunulan preklinik model, daha önceki bir dizi çalışmanın gösterdiği gibi, klinik hafif TBI ile ilişkili güvenilir ve tekrarlanabilir patofizyolojik değişiklikler üretir17,19,20,21,22,23. Bu modelle yapılan çalışmalar, düşük yoğunluklu bir patlama dalgasına maruz kalan sıçanların nöroinflamasyon, aksonal yaralanma, mikrovasküler hasar, nöronal hasara bağlı biyokimyasal değişiklikler ve kısa süreli plastisite ve sinaptik uyarılabilirlikte eksiklikler sergilediğini göstermiştir19. Bununla birlikte, bu hafif TBI modeli, orta ila şiddetli invaziv TBI modellerinin kullanıldığı çalışmalarda yaygın olarak gözlenen doku hasarı, kanama, hematom ve kontüzyon19 dahil olmak üzere makroskopik nöropatolojik değişikliklere neden olmamıştır10,24. Önceki araştırmalar19,21,22,23, bu klinik öncesi modelin hafif ve orta derecede TBI17,19,20,21,22,23'ün etyolojisinin altında yatan nörobiyolojik ve patofizyolojik süreçleri karakterize etmek için kullanılabileceğini göstermiştir. Bu model aynı zamanda yeni terapötik bileşiklerin ve stratejilerin test edilmesine ve etkili TBI müdahalelerinin geliştirilmesi için yeni, uygun hedeflerin belirlenmesine izin verir19,21,22,23.

Bu model, kemirgenlerde moleküler, hücresel ve davranışsal sonuçlar üzerindeki hızlı dönme kuvvetlerinin yanı sıra patlama dalgalarının neden olduğu etkileri araştırmak için geliştirilmiştir. Burada sunulan patlama dalgası modeline benzer şekilde, gazla çalışan aşırı basınç dalgaları kullanarak hafif ila orta TBI'yı özetlemeye çalışan bir dizi klinik öncesi model geliştirilmiştir2,14,17,25,26,27,28. Diğer modellerin sınırlamalarından bazıları şunlardır: hayvan tel örgülü bir gurney'e sabitlenir ve kafa darbe üzerine hareketsiz hale getirilir; periferik organlar, politravmanın kafa karıştırıcı değişkenlerini yaratan beyne ek olarak dalgaya maruz kalır; ve modeller büyük ve sabittir, bu da kritik parametrelerin değiştirilmesini ve insan TBI'sını anımsatan daha iyi model koşullarına uyarlanmasını sınırlar.

Bu tezgah üstü, gazla çalışan şok tüpü kurulumunun faydaları, satın alma ve çalıştırma giderleri için göreceli düşük maliyetinin yanı sıra kurulum ve kullanım kolaylığıdır. Ayrıca, kurulum yüksek verimli çalışmaya ve kontrollü tekrarlanabilir patlama dalgalarının üretilmesine ve hem farelerde hem de sıçanlarda in vivo sonuçlara izin verir. Tutarlı test koşullarını (yani, sabit patlama dalgası ve aşırı basınç) kontrol etmek için kurulum, basınç sensörleri ile donatılmıştır. Bu modelin TBI için avantajları, yaralanma şiddetinin ölçeklenebilirliğini ve hafif TBI'nın invaziv olmayan, kapalı başlı bir prosedür kullanılarak indüklenmesini içerir. Zirve aşırı basıncı ve ardından gelen beyin hasarı, tutarlı bir şekilde ölçeklenebilir bir şekilde daha kalın polyester membranlarla artar17. TBI şiddetini membran kalınlığı ile ölçeklendirme yeteneği, spesifik sonuç ölçümlerinin (örneğin, nöroinflamasyon) belirginleştiği seviyeyi belirlemek için yararlı bir araçtır. Periferik organlar için koruyucu kalkan sağlanması, akciğer veya torasik yaralanma gibi sistemik yaralanmanın kafa karıştırıcı değişkenlerini önleyerek veya azaltarak hafif TBI mekanizmalarına odaklanmış araştırmalara da izin verir. Dahası, bu kurulum, patlama dalgasının kafaya çarptığı / nüfuz ettiği yönün seçilmesine izin verir (yani, kafa kafaya, yana, üste veya alta) ve bu nedenle farklı TBI kaynaklı hakaret türleri araştırılabilir. Burada tarif edilen hafif ila orta dereceli TBI'yı indüklemek için standart prosedür, hızlı dönme kuvvetleri nedeniyle darbe ve kontrekupa yaralanması ile birlikte patlama dalgası yaralanmasının etkilerini değerlendirmek için yan maruziyeti kullanır. Ayrıca, sadece patlamaya bağlı yaralanmayı araştırmak için, yukarıdan aşağıya patlama dalgasına maruz kalma bu modelde kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Protokol, Cincinnati Üniversitesi ve West Virginia Üniversitesi'nin hayvan bakım yönergelerini takip etmektedir. Hayvanları içeren tüm prosedürler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri (IACUC) tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ilkelerine göre gerçekleştirilmiştir.

1. Patlatma TBI kurulumunun kurulumu

  1. Çelik tahrikli ve sürücü bölümünden oluşan şok borusu, polyester membran, sabitleme cıvataları, basınç sensörleri, çevresel organları korumak için polivinil klorür (PVC) boru kalkanı, 9,53 mm yüksek basınçlı hidrolik hat ve hızlı bağlantı erkek ve dişi ataşmanları, yüksek akışlı gaz regülatörü ve duvara montaj braketli bir gaz silindiri dahil olmak üzere kurulum için gerekli olan tüm çalışma parçalarını edinin. B ve Malzeme Tablosu).
    NOT: Burada kullanılan tahrikli ve sürücü bölümünün özellikleri (bkz. Şekil 2 ve Malzeme Tablosu), farelerde hafif ila orta dereceli TBI'yı indüklemek için tutarlı bir kısa süreli ölçekli patlama dalgası (bkz. Şekil 3C, D) üretmek üzere oluşturulmuştur. Bu amaçla konik tasarımlı (6° konik) kısa sürücü bölümü seçilmiştir. Tahrik ve sürücü bölümlerinin uzunluğu ve çapı, özellikle patlama dalgası29,30,31,32, sıkıştırma dalgası18 veya şok dalgası dinamiklerini33 araştırmak için değiştirilebilir. Sıçanlarla yapılan deneyler için, şok tüpünün boyutlarının, ilgili vücut ölçekleme parametrelerini korumak için karşılaştırılabilir kuvvetler verecek şekilde uyarlanması gerekir17 (bkz.
  2. Kurulumun bireysel çalışma parçalarını, hayvan deneyleri için onaylanmış laboratuvar alanında sağlam, temizlenmesi kolay bir yüzeye (tercihen kemirgenlerde kullanım için paslanmaz çelik) sabitlenmiş makine slayt tablolarına monte edin.
    NOT: Patlama dalgası deneyleri önemli miktarda gürültü üretir; bu nedenle, ses emici laboratuvar alanında, gürültünün diğer deneylere/laboratuvar gruplarına müdahale etmeyeceği bir yer seçin.
    1. PVC boru kalkanını şok tüpü kurulumuna dik olarak sabitleyin, böylece kemirgenin gövdesi tamamen kaplanır ve sadece kafa çıkıntı yapar.
      NOT: Burada açıklanan hafif ila orta derecede TBI'yı indüklemek için standart prosedür için, başın merkezi, fareler için tahrik edilen bölümün sonundan 5 cm uzakta bulunur.
    2. OSHA ve diğer tüm ilgili güvenlik düzenlemelerine uygun olarak kuruluma yakın duvara monte gaz silindiri.
      NOT: Basınçlı hava, helyum veya azot gazı, kemirgen şok tüpü modellerinde patlama dalgalarını üretmek için yaygın olarak kullanılır. Burada sunulan tüm veriler helyum kullanılarak üretilmiştir, çünkü bu gaz daha kısa bir süre boyunca daha yüksek aşırı basınç üretir34 ve murin denekleri için uygun ölçeklendirmeye izin verir.

2. Basınç sensörü kayıtları kullanılarak kurulum ve patlama dalgası özelliklerinin değerlendirilmesi.

  1. Şok tüpünü hazırlayın.
    1. Tutarlı kopma sağlamak için polyester membranı bükülmeden ve çatlak üretmeden dikkatlice kesin.
    2. Membranı tahrik ve sürücü bölümleri arasına yerleştirin. Bağlantı cıvatalarını sıkarak bölümleri sabitleyin.
    3. Sistemin hava geçirmez olduğundan ve membranın sürücü ve tahrik bölümleri arasında sıkıca sabitlendiğinden emin olun.
    4. Gaz deposunu 9,53 mm yüksek basınçlı hidrolik hortum ve ataşmanları şok borusuna hızlı bir şekilde bağlayın
      NOT: Sürücü ve tahrikli kesitler, kesitler arasında tam bir membran sızdırmazlığı sağlamak için hassas toleranslara göre işlenir. Bu, gaz sızıntısına izin vermez ve herhangi bir conta / o-ring malzemesinin kullanılmasını engeller ve üretilen dalga formunda daha fazla tutarlılık sağlar.
  2. Patlama dalgalarını izlemek için basınç sensörlerini takın (bkz. Şekil 1C).
    1. Kafa yerleştirme alanına bir basınç sensörü ve şok tüpünün çıkışına üç sensör yerleştirin (bkz. Şekil 1C ve 2).
    2. Patlama dalgası uygulamasından hemen önce basınç sensörlerinden kaydı başlatın. Bir sensör sinyal şartlandırıcısı ve veri toplama kartı kullanarak basınç dalgası verilerini saniyede 500.000 kare hızında kaydedin (bkz.
      NOT: Yeterli işitme koruması sağlamak için OHSA onaylı kulaklıklar takın.
    3. Gaz akışının ani, hızlı bir basınç artışı oluşturmasına izin vermek için sıkıştırılmış gaz tankının ana valfini tamamen açın.
      NOT: Gaz aşırı basıncı, polyester membranı parçalayarak tahrik edilen bölüm içinde bir sıkıştırma dalgasına dönüşen ve borudan kafa yerleştirme alanı yönünde çıkan bir şok dalgası serbest bırakır.
    4. İşlemden hemen sonra gaz akışını kapatın.
      NOT: Kurulum, gaz akışını otomatik olarak ve hızlı bir şekilde durdurmak için bir yaylı geri dönüş valfi ile donatılabilir.
    5. Tepe aşırı basıncını ve grafik verilerini belirlemek için özel yazılı bilgisayar programını kullanarak basınç dalgası kayıtlarını analiz edin. Veriler, üretilen dalganın düzlemselliğini göstermek için her bir sensörle ayrı ayrı grafiklendirilebilir veya birbiri üzerine yerleştirilebilir (bkz. Şekil 3C,D).
      NOT: Analiz teknik olarak daha kolay erişilebilir bir yazılım kullanılarak yapılabilir, ancak büyük veri kümeleri nedeniyle, bu programların grafikler oluşturmada uzun gecikmeleri vardır.
  3. Belirlenen TBI çalışmasının amacı için yeterli olan deneysel koşullar oluşturun ve modelin bir Friedlander dalgasıyla karşılaştırılabilir bir tepe aşırı basıncı, süresi ve dürtü ölçümü ile tutarlı bir patlama dalgası ürettiğini doğrulayın (bkz. Şekil 3). Yukarıda belirtilen bilgisayar yazılımını kullanarak bu parametreleri doğrulayın.
    1. 2.1.1 adımlarını tekrarlayarak kurulumu kalibre edin. 2.2.5'e kadar. ve kurulumun ayarlanması gerekip gerekmediğini belirlemek için basınç dalgası kayıtlarını kullanın (temsili veriler için bkz. Şekil 3).
    2. Kurulumu değiştirin (gerekirse).
      NOT: Patlama dalgası özellikleri, kurulumdaki küçük değişikliklerle ayarlanabilir. Örneğin, başın tahrik edilen bölümün sonuna kadar olan mesafesi, kafa seviyesindeki patlama dalgası kuvvetini etkiler. Polyester membranın kalınlığı pik aşırı basınç seviyesini belirler ve daha kalın membranlar pik seviyelerini arttırır (bkz. Şekil 3A,B). Ek olarak, kurulum, patlama dalgasının kafaya çarptığı / nüfuz ettiği yönün seçilmesine izin verir (yani, kafa üstü, yan, üst veya alt) ve bu nedenle, tek başına patlama dalgası yaralanması veya hızlı dönme kuvvetleri nedeniyle darbe ve kontrekupa yaralanması ile kombinasyon halinde gibi farklı yönler araştırılabilir.
    3. İstenen patlama dalgası özelliklerini (gerekirse) belirlemek ve tekrarlanabilirliği denetlemek için 2.1.1 ile 2.2.4 arasındaki adımları yineleyin.
    4. Kurulumun ölçeklenebilirliğini değerlendirmek için farklı kalınlıktaki polyester membranlarla 2.1.1 ila 2.2.4 arasındaki adımları tekrarlayın (temsili veriler için bkz. Şekil 3A,B).

3. Kemirgenlerde deneysel düzeneğin hazırlanması ve hafif TBI'nın indüklenmesi

NOT: İklimlendirmek için TBI deneylerinin başlamasından 30 dakika ila 1 saat önce kemirgenleri tutma alanına aktarın. Prosedürün gürültüsünden en az etkilenen tutma alanını seçin.

  1. Deney için gerekli tüm malzemeleri hazırlayın ve doğru kurulum için kurulumu kontrol edin (örneğin, parametreleri çalışmanın amacına göre ayarlayın) (~ 5 – 10 dakika).
    NOT: Yaralanma şiddeti, polyester membranın kalınlığı seçilerek ayarlanabilir. Çalışmalarımıza dayanarak, farelerde hafif ila orta derecede TBI için 25,4 ila 102 μm'lik bir membran kalınlığı kullanılmaktadır35. Sıçanlarda hafif ila orta derecede TBI üretmek için daha önce 76,2 ila 127 μm kalınlığında membranlar kullanmıştık19.
    1. Polyester membranı dikkatlice kesin, tahrik ve sürücü bölümleri arasına yerleştirin ve bağlantı cıvatalarını sıkarak sabitleyin.
    2. Hızlı serbest bırakma bağlantı parçaları kullanarak gaz tankını şok tüpüne bağlayın. Membranın sürücü ve tahrik bölümleri arasında sıkıca sabitlendiğinden emin olun.
    3. Adım 2.2.2 ve 2.2.5'te açıklandığı gibi TBI indüksiyonu sırasında patlama dalgası özelliklerini izlemek için şok tüpünün çıkışına 120 ° aralıklarla üç basınç sensörü yerleştirin.
    4. Şok tüpü aparatının ucundan olan mesafenin, takılı mikrometreyi kullanarak her bir konu için doğru olduğundan emin olun. Tutarlı yaralanma değerlendirmesine izin vermek için kemirgen başının pozisyonunu (yani pozisyon, mesafe) çalışmalar içinde sabit tutun.
      NOT: 1.2.1.'de belirtildiği gibi, patlama dalgasının kafayı etkilediği yönün seçilmesiyle farklı yaralanma türleri indüklenebilir. Burada tarif edilen hafif ila orta dereceli TBI'yı indüklemek için prosedür için, vücut, patlama dalgasının başın yan tarafını etkilediği şok tüpüne dik olarak yerleştirilir. Bu ortamda, kafanın serbest hareketliliğine izin verilir ve bu nedenle darbe ve kontrekupa etkilerinin üretilmesine izin veren patlama dalgasına ve hızlı dönme kuvvetlerine maruz kalır.
    5. Yazılımın grafik kullanıcı arayüzünü (GUI) kullanarak basınç sensörlerinden kaydı başlatın.
  2. Anestezi ve kemirgenlerin kurulumda konumlandırılması
    1. Kemirgenleri tutma odasından transfer edin ve oksijende% 4 izofluran ile anesteziyi indükleyin ve sıkıntı ve ağrıyı azaltmak için oksijende% 2 izofluran ile koruyun.
      NOT: Devam etmeden önce hayvanın ayak parmağına veya kuyruk sıkışmasına tepki vermediğinden emin olun. Anestezi indüksiyonunun, sahte kontroller de dahil olmak üzere tüm deney hayvanları için tutarlı olduğundan emin olun. Bu prosedür düşük seviyeli ve kısa süreli anestezi gerektirir.
    2. Tamamen anestezi altındaki kemirgenleri, periferik organları patlama dalgasından korumak için yastıklama ile PVC boru kalkanına yerleştirin.
      NOT: Kontrol denekleri anestezi altına alınır ve kuruluma yakın bir yere yerleştirilir, ancak doğrudan patlama dalgasına maruz bırakılmaz. Kontrollerin şok tüpü tarafından üretilen gürültüye maruz kaldığından emin olun.
    3. Kemirgenin başını kafa yerleştirme alanına yerleştirin ve doğrudan koruma aparatına yerleştirilmiş bir destek veya bir gazlı bez pedi ile aşağıdan destekleyin. Her bir kemirgenin anatomisine göre, koruyucu kalkanın kenarı ile hizalanmış oksipital kondil ile baş hizalamasını belirleyin.
      NOT: Mortaliteyi azaltmak için basınç dalgasını doğrudan beyin sapına yönlendirmekten kaçının. Beyin sapının solunum merkezi ve servikal omuriliğin yaralanmasının, TBI36,37,38'in kemirgen modellerinde solunum anormalliklerine ve hatta ölüme katkıda bulunduğu bilinmektedir.
  3. Kemirgenlerin patlama dalgasına maruz kalması.
    1. Membranı parçalayan bir basınç artışı üretmek ve bir basınç dalgasının oluşumunu doğrulayan yüksek bir patlama üretmek için sıkıştırılmış gaz tankının ana valfini hızla açın. Membran, deneyden sonra çıkarıldığında görsel olarak yırtılacaktır.
      NOT: Daha fazla analiz için kemirgenin yaşadığı dönme ivmesinin darbe ve kontrekupa etkilerini yakalamak için yüksek hızlı bir kamera kullanılabilir.
    2. Patlamayı duyduktan hemen sonra gaz akışını kapatın.
  4. Patlama dalgasına maruz kalmaktan kurtarma
    1. Patlama dalgasına maruz kaldıktan sonra, kemirgeni cihazdan çıkarın ve yanlarındaki şok tüpüne doğrudan bitişik düz bir yüzeye yerleştirin.
    2. Doğru refleks süresini (RRT) belirlemek için denekleri izleyin. Patlama dalgasına maruz kalmadan, doğal sağ refleksi yeniden kazanana kadar geçen süreyi kaydetmek için bir kronometre kullanın. (bkz. Şekil 4A).
    3. Denekler haklı reflekslerini geri kazanır kazanmaz, onları sonraki 24 saat boyunca advers reaksiyonlar (yani nöbetler, nefes almada zorluk, bedensel bir delikten kanama) açısından izlendikleri kendi ev kafeslerine yerleştirin.
    4. İlk izleme periyodundan sonra, denekler araştırmacının seçtiği çeşitli biyokimyasal, nöropatolojik, nörofizyolojik ve davranışsal testler kullanılarak analiz edilebilir (aşağıya bakınız).
  5. Bir sonraki deneme için kurulumu ve alanı hazırlayın.
    1. Kokuyu gidermek için kurulumu deterjanla temizleyin.

4. Patlama dalgası / dönme kuvvetlerine ve kontrollerine maruz kalan kemirgenler için aşağı akış uygulamaları

NOT: Önceki çalışmalarda, bir patlama dalgasına ve dönme kuvvetlerine maruz kaldıktan sonra çeşitli zaman noktalarında hafif ila orta dereceli TBI'nın etkileri, biyokimyasal, nöropatolojik, nörofizyolojik ve davranışsal analizler de dahil olmak üzere aşağı akış uygulamaları kullanılarak kemirgenlerde değerlendirilmiştir19.

  1. Biyokimyasal analiz
    1. Tanımlanmış deneysel zaman noktalarında (hafif TBI sonrası saatlerden günlere), açıklandığı gibi standart protokolleri kullanarak biyokimyasal analiz için doku (örneğin, beyin, kan) hasat edin19.
    2. Hafif TBI'nın nörobiyolojik ve patofizyolojik süreçler üzerindeki etkisini değerlendirmek için biyokimyasal analiz (yani, immünoblotlama, ELISA, vb.) için doku kullanın.
  2. Nöropatolojik analiz
    1. Tanımlanmış deneysel zaman noktalarında (hafif TBI'dan sonraki saatlerden günlere kadar), kemirgenleri transkardiyal olarak salin çözeltisi ile perfüze edin ve ardından dokuyu tarif edildiği gibi% 4 paraformaldehit çözeltisi izledi19.
      NOT: Bazı uygulamalar paraformaldehit fiksasyonu ile uyumlu değildir (örneğin, gümüş boyama, immünohistokimya için bazı antikorlar).
    2. Tarif edildiği gibi nöroinflamasyon, nörodejenerasyon ve nörokimyasal değişiklikler dahil olmak üzere hafif TBI ile ilişkili nöropatolojik değişiklikleri değerlendirmek için anatomik, histolojik ve moleküler analizler için perfüzasyonlu, sabit doku kullanın19.
  3. Beyin dilimlerinde nörofizyolojik analiz
    1. Tanımlanmış deneysel zaman noktalarında (hafif TBI'dan sonraki saatlerden günlere), kemirgenleri kafa kesme yoluyla kurban edin, beyni çıkarın ve açıklandığı gibi beyin dilimleri hazırlayın19.
    2. Hafif TBI'nın bazal sinaptik özellikler ve sinaptik plastisite üzerindeki etkisini değerlendirmek için açıklandığı gibi elektrofizyolojik kayıtlar yapın19 .
  4. Davranış analizi
    1. Tanımlanmış deneysel zaman noktalarında (hafif TBI'dan sonraki saatlerden günlere), motor fonksiyon (örneğin, açık alan, rotarod, lokomotor aktivite; bkz. Şekil 4D) ve öğrenme ve hafıza (örneğin, korku koşullandırma, Barnes labirenti, Morris su labirenti) dahil olmak üzere davranışsal performansı değerlendirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Patlama dalgası kurulumunun ölçeklenebilirliği, 25,4, 50,8 ve 76,2 μm olmak üzere üç farklı membran kalınlığı kullanılarak test edilmiştir. Pik basınç seviyeleri, piezoelektrik basınç sensörleri kullanılarak kafa yerleştirme alanında ve şok tüpü aparatının çıkışında değerlendirilmiştir (bkz. Şekil 1 ve Şekil 2). Pik basınçlar, her iki sensör konumundaki membran kalınlığı ile uyumlu olarak artar (Şekil 3A, B), bu da ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, uygun maliyetli, kurulumu ve yürütülmesi kolay ve yüksek verimli, güvenilir ve tekrarlanabilir deneysel sonuçlara izin veren preklinik hafif TBI modelini sunuyoruz. Bu model, sistemik yaralanmanın kafa karıştırıcı değişkenlerini sınırlarken, hafif TBI mekanizmalarına odaklanmış araştırmalara izin vermek için periferik organlara koruyucu kalkan sağlar. Buna karşılık, diğer patlama modellerinin periferik organlara zarar verdiği bilinmektedir2,39,40.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

R. Gettens, N. St. Johns, P. Bennet ve J. Robson'a TBI modelinin geliştirilmesine katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Beyin ve Davranış Araştırma Vakfı'ndan (F.P. ve M.J.R.) NARSAD Genç Araştırmacı Hibeleri, Darrell K. Kraliyet Alzheimer Hastalığı Araştırma Fonu'ndan (F.P.) bir Araştırma Bursu ve bir PhRMA Vakfı Ödülü (M.J.R.) bu araştırmayı destekledi. Bu çalışma, Amerikan Farmasötik Eğitim Vakfı'ndan (A.F.L ve B.P.L.) DOKTORA ÖNCESI burslarla desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3/8 SAE Yüksek Basınçlı HidrolikHortum Eaton AeroquipR2-6-6-36MGrainger'dan temin edilebilir
3/8 '' Hızlı Bağlantı Dişi FişlerKarcherKAR 86410440
3/8 '' Hızlı Bağlantı Erkek FişlerKarcherKAR 86410440
ANY-labirent video izleme yazılımıStoelting Co.ANY-labirent yazılımı
Clear Mylar membranePlastics.comPOLYCLR0.003http://www.eplastics.com/Plastic/Clear_Polyester_Film/POLYCLR0-003; Berrak Mylar membran çeşitli kalınlıklarda satılmaktadır. Hepsi yukarıda listelenen satıcı tarafından satılmaktadır.
Bileşik Kayar Tabla (x2)Grizzly IndustrialG5757
Deadman Gaz Kontrol Küresel VanaConeraco Inc.71-502-01"Apollo", Grainger'dan temin edilebilir
Sürücü ve sürülen bölüm (murine)kendi tasarımı/üretimin/aDaha fazla bilgi için lütfen yazarlarla iletişime geçin
Sürücü ve sürülen bölüm (sıçan)kendi tasarımı/üretimiyokDaha fazla bilgi için lütfen yazarlarla iletişime geçin
Kulak Manşonları3M37274Grainger'dan
temin edilebilirGaz Regülatörü - Hi Flow 3500-600-580Harris3003539
Helyum GazıAirGasHE 300Tankları çeşitli boyutlarda mevcuttur
İnhalasyon Anestezi SistemiVetEquip901806
GirişModülü Ulusal EnstrümanlarNI 9223
İzofluran BaxterNDC 10019-360-40Veteriner
tarafından sipariş edildiLaboratuvar Zamanlayıcı/KronometreFisher Scientific50-550-352
Labview sürüm 12.0Ulusal EnstrümanlarVeri Edinme Yazılımı
Manyetik Kadran Göstergesi/MikrometreGrizzly IndustrialG9849
Basınç kayıt analizi içinMATLABMathWorks
Oksijen RegülatörüMedlineHCS8725M
Veri İşleme için PCDell
Polivinilklorür Boru - 25,4 mmFORMUFITP001FGP-WH-40x3
Basınç sensörleriPCB Piezotronics102A05
Alıcı USB ŞasiUlusal AletlerDAQ-9171
Sensör Sinyal DüzenleyiciPCB Piezotronics482C serisi
Paslanmaz NSF Dereceli Montaj TablasıGridmannGR06-WT2448
T Saplı Alyan Anahtarı - 3/16''S& K73310
Yazılımı

Kaynaklar

  1. Bazarian, J. J., et al. Mild traumatic brain injury in the United States, 1998--2000. Brain Injury. 19 (2), 85-91 (2005).
  2. Meabon, J. S., et al. Repetitive blast exposure in mice and combat veterans causes persistent cerebellar dysfunction. Science Translational Medicine. 8 (321), (2016).
  3. Mac Donald, C. L., et al. Detection of blast-related traumatic brain injury in U.S. military personnel. New England Journal of Medicine. 364 (22), 2091-2100 (2011).
  4. Fischer, B. L., et al. Neural activation during response inhibition differentiates blast from mechanical causes of mild to moderate traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (2), 169-179 (2014).
  5. Peskind, E. R., et al. Cerebrocerebellar hypometabolism associated with repetitive blast exposure mild traumatic brain injury in 12 Iraq war Veterans with persistent post-concussive symptoms. Neuroimage. 54, Suppl 1 76-82 (2011).
  6. Jorge, R. E., et al. White matter abnormalities in veterans with mild traumatic brain injury. American Journal of Psychiatry. 169 (12), 1284-1291 (2012).
  7. Hoge, C. W., et al. Mild traumatic brain injury in U.S. Soldiers returning from Iraq. New England Journal of Medicine. 358 (5), 453-463 (2008).
  8. Eskridge, S. L., et al. Injuries from combat explosions in Iraq: injury type, location, and severity. Injury. 43 (10), 1678-1682 (2012).
  9. Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: a new experimental brain injury model. Journal of Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
  10. Dixon, C. E., Clifton, G. L., Lighthall, J. W., Yaghmai, A. A., Hayes, R. L. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 39 (3), 253-262 (1991).
  11. McIntosh, T. K., et al. Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model. Neuroscience. 28 (1), 233-244 (1989).
  12. Thompson, H. J., et al. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. Journal of Neurotrauma. 22 (1), 42-75 (2005).
  13. Osier, N., Dixon, C. E. Mini Review of Controlled Cortical Impact: A Well-Suited Device for Concussion Research. Brain Sciences. 7 (7), (2017).
  14. Goldstein, L. E., et al. Chronic traumatic encephalopathy in blast-exposed military veterans and a blast neurotrauma mouse model. Science Translational Medicine. 4 (134), (2012).
  15. Rodriguez-Grande, B., et al. Gliovascular changes precede white matter damage and long-term disorders in juvenile mild closed head injury. Glia. 66 (8), 1663-1677 (2018).
  16. Bowen, I. G., Fletcher, E. R., Richmond, D. R., Hirsch, F. G., White, C. S. Biophysical mechanisms and scaling procedures applicable in assessing responses of the thorax energized by air-blast overpressures or by nonpenetrating missiles. Annals of the New York Academy of Sciences. 152 (1), 122-146 (1968).
  17. Turner, R. C., et al. Modeling clinically relevant blast parameters based on scaling principles produces functional & histological deficits in rats. Experimental Neurology. , 520-529 (2013).
  18. Lucke-Wold, B. P., et al. Elucidating the role of compression waves and impact duration for generating mild traumatic brain injury in rats. Brain Injury. 31 (1), 98-105 (2017).
  19. Hernandez, A., et al. Exposure to mild blast forces induces neuropathological effects, neurophysiological deficits and biochemical changes. Molecular Brain. 11 (1), 64(2018).
  20. Bittar, A., et al. Neurotoxic tau oligomers after single versus repetitive mild traumatic brain injury. Brain Communications. 1 (1), (2019).
  21. Logsdon, A. F., et al. Salubrinal reduces oxidative stress, neuroinflammation and impulsive-like behavior in a rodent model of traumatic brain injury. Brain Research. 1643, 140-151 (2016).
  22. Lucke-Wold, B. P., et al. Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury. Molecular Neurobiology. 52 (3), 1119-1134 (2015).
  23. Logsdon, A. F., et al. Altering endoplasmic reticulum stress in a model of blast-induced traumatic brain injury controls cellular fate and ameliorates neuropsychiatric symptoms. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 421(2014).
  24. Dixon, C. E., et al. A fluid percussion model of experimental brain injury in the rat. Journal of Neurosurgery. 67 (1), 110-119 (1987).
  25. Long, J. B., et al. Blast overpressure in rats: recreating a battlefield injury in the laboratory. Journal of Neurotrauma. 26 (6), 827-840 (2009).
  26. Budde, M. D., et al. Primary blast traumatic brain injury in the rat: relating diffusion tensor imaging and behavior. Frontiers in Neurology. 4, 154(2013).
  27. Genovese, R. F., et al. Effects of mild TBI from repeated blast overpressure on the expression and extinction of conditioned fear in rats. Neuroscience. 254, 120-129 (2013).
  28. Kuriakose, M., Rama Rao, K. V., Younger, D., Chandra, N. Temporal and Spatial Effects of Blast Overpressure on Blood-Brain Barrier Permeability in Traumatic Brain Injury. Scientific Reports. 8 (1), 8681(2018).
  29. Cernak, I., et al. The pathobiology of blast injuries and blast-induced neurotrauma as identified using a new experimental model of injury in mice. Neurobiology of Disease. 41 (2), 538-551 (2011).
  30. Prima, V., Serebruany, V. L., Svetlov, A., Hayes, R. L., Svetlov, S. I. Impact of moderate blast exposures on thrombin biomarkers assessed by calibrated automated thrombography in rats. Journal of Neurotrauma. 30 (22), 1881-1887 (2013).
  31. Mishra, V., et al. Primary blast causes mild, moderate, severe and lethal TBI with increasing blast overpressures: Experimental rat injury model. Scientific Reports. 6, 26992(2016).
  32. Tompkins, P., et al. Brain injury: neuro-inflammation, cognitive deficit, and magnetic resonance imaging in a model of blast induced traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 30 (22), 1888-1897 (2013).
  33. Kuriakose, M., et al. Tailoring the Blast Exposure Conditions in the Shock Tube for Generating Pure, Primary Shock Waves: The End Plate Facilitates Elimination of Secondary Loading of the Specimen. Public Library of Science One. 11 (9), 0161597(2016).
  34. Panzer, M. B., et al. A Multiscale Approach to Blast Neurotrauma Modeling: Part I - Development of Novel Test Devices for in vivo and in vitro Blast Injury Models. Frontiers in Neurology. 3, 46(2012).
  35. Logsdon, A. F., et al. A mouse Model of Focal Vascular Injury Induces Astrocyte Reactivity, Tau Oligomers, and Aberrant Behavior. Archives of Neuroscience. 4 (2), (2017).
  36. Lee, M. C., Klassen, A. C., Heaney, L. M., Resch, J. A. Respiratory rate and pattern disturbances in acute brain stem infarction. Stroke. 7 (4), 382-385 (1976).
  37. Ikeda, K., et al. The respiratory control mechanisms in the brainstem and spinal cord: integrative views of the neuroanatomy and neurophysiology. Journal of Physiological Sciences. 67 (1), 45-62 (2017).
  38. Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury. Nature. 475 (7355), 196-200 (2011).
  39. Logsdon, A. F., et al. Blast exposure elicits blood-brain barrier disruption and repair mediated by tight junction integrity and nitric oxide dependent processes. Scientific Reports. 8 (1), 11344(2018).
  40. Logsdon, A. F., et al. Nitric oxide synthase mediates cerebellar dysfunction in mice exposed to repetitive blast-induced mild traumatic brain injury. Scientific Reports. 10 (1), 9420(2020).
  41. Huber, B. R., et al. Blast exposure causes dynamic microglial/macrophage responses and microdomains of brain microvessel dysfunction. Neuroscience. 319, 206-220 (2016).
  42. Gama Sosa, M. A., et al. Low-level blast exposure disrupts gliovascular and neurovascular connections and induces a chronic vascular pathology in rat brain. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 6(2019).
  43. Abutarboush, R., et al. Exposure to Blast Overpressure Impairs Cerebral Microvascular Responses and Alters Vascular and Astrocytic Structure. Journal of Neurotrauma. 36 (22), 3138-3157 (2019).
  44. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nature Reviews: Neuroscience. 14 (2), 128-142 (2013).
  45. Petraglia, A. L., et al. Concussion in the absence of head impact: a case in a collegiate hammer thrower. Current Sports Medicine Reports. 14 (1), 11-15 (2015).
  46. Viano, D. C., Casson, I. R., Pellman, E. J. Concussion in professional football: biomechanics of the struck player--part 14. Neurosurgery. 61 (2), 313-327 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kapal kafa TBIKemirgen TBI Modeliok T p D zenene iBas n Sens r zlemePik Bas n l eklenebilirli iDo rulma Refleksi De erlendirmesiN roinflamasyon AnaliziDavran sal De erlendirme Protokol
Kemirgenlerde Kapalı Başlı Hafif Travmatik Beyin Hasarının Preklinik Değerlendirmesi için Düşük Yoğunluklu Patlama Dalgası Modeli
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.