Yöntem makalesi

Hipokampustaki Ventral Tegmental Alan Glutamat Terminallerinin Kombine In Vivo Anatomik ve Fonksiyonel İzlenmesi

3.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61282

⸱

9 Eylül 2020

 ,  , 
1Department of Comparative Biomedical Sciences, Louisiana State University School of Veterinary Medicine

Bu makalede

Özet

Mevcut protokol, hipokampusa ventral tegmental alan (VTA) glutamat projeksiyonlarının izlenmesi için basit bir yöntem göstermektedir. VTA glutamat nöronlarının fototimülasyonu, VTA glutamat terminallerinin CA1 putatif piramidal ateşleme hızını in vivo olarak nasıl modüle ettiğini göstermek için CA1 kaydı ile birleştirildi.

Özet

Beyindeki nöron alt popülasyonlarının optogenetik modülasyonu, araştırmacıların in vivo ve ex vivo'daki sinir devrelerini parçalamalarına izin sağlamıştır. Bu, nöron tiplerinin bir sinir devresi içindeki rolünü ve öğrenmeye göre bilgi kodlamasındaki önemini belirlemek için bir öncül sağlar. Aynı şekilde, yöntem uyanık ve uyuşturulmış hayvanlarda iki veya daha fazla bağlı beyin bölgesinin fizyolojik önemini test etmek için kullanılabilir. Mevcut çalışma, VTA glutamat nöronlarının anestezi edilmiş farelerin CA1'deki (hipokampus) putatif piramital nöronların atış hızını nasıl modüle ettiklerini göstermektedir. Bu protokol, hipokampus katmanlarında VTA presynaptik glutamat terminallerinin izlenmesi için VTA glutamat nöronlarının adeno ilişkili virüs (AAV) bağımlı etiketlemesini kullanmaktadır. AAV vektörü tarafından barındırılan ışık kontrollü opsin (channelrhodopsin; hChR2) ve floresan proteininin (eYFP) ekspresyasyonu, VTA glutamat terminallerinin anterograd izlenmesine ve VTA glutamat nöron hücre cisimlerinin (VTA'da) fototimülasyonuna izin verdi. Yüksek empedanslı akut silikon elektrotlar, VTA fotostimülasyonuna in vivo olarak çok birimli ve tek birimli yanıtları tespit etmek için CA1'e yerleştirilmiştir. Bu çalışmanın sonuçları hipokampustaki (CA1, CA3 ve DG) presynaptik VTA glutamat terminallerinin katmana bağımlı dağılımını göstermektedir. Ayrıca, VTA glutamat nöronlarının fototimülasyonu, putatif CA1 piramidal ünitelerinin in vivo ateşlenme ve patlama hızını artırdı.

Giriş

Son on yılda, nöron tipi modülasyonun özgüllüğünü ve karmaşık sinir ağlarının haritalandırılmasını artırmak için bir dizi genetik araç geliştirilmiştir1. Özellikle, nöron alt tiplerinde belirli proteinleri ifade etmek veya alevlendirmek için nöronal hücrelerde enfekte olma ve çoğaltma yeteneğine sahip nörotropik virüsler konuşlandırılmıştır. Floresan proteinleri veya genetik olarak kodlanmış sinaptik aktivite göstergelerini barındırırken, transfected AAV vektörleri beyin bölgelerindeki sinir ağlarını etiketler ve tanımlama2,3. AAV yapısında bir promotörün seçimi, vektörün nöron tiplerinde bir miktar özgüllük(promotöre bağımlı ifade) ile ifadesini yönlendirir. Bununla birlikte, Cre-lox rekombinasyonu sayesinde, AAV yapılarınöron etiketlemesi 4,5,6,7için daha fazla özgüllükle dağıtılır. Not olarak, AAV vektörlerinde paketlenmiş fotoaktive mikrobiyal opsinler ve floresan proteinler çeşitli nöron alt tiplerinde ifade edilebilir8ve görüntüleme, nöron tipi devre izleme ve fotomodülasyon için idealdir9,10.

AAVs, soma, dendrit ve akson terminallerinde muhabir proteininin ekspresyonunun ifadesini yönlendiren bir beyin bölgesine (veya çekirdeğe) stereotaktik olarak enjekte edilen yapılar oluşturur. Bir muhabir geni (eYFP) barındıran AAV'nin sinirsel ifadesi, nöron hücre cisimlerinin etiketlenerek diğer beyin bölgelerine ve diğer beyin bölgelerine yapılan projeksiyonların anatomik olarak izlenmesini kolaylaştırır11,12,13,14. Işık kontrollü opsin taşıyan AAV-eYFP yapıları (örneğin, hChR2),6,15 görüntüleme ve16 vivo beyin bölgelerini hedeflemek için sinirsel projeksiyonların stimülasyontabanlı fizyolojik izleme için bir araç olarak dağıtılabilir. AAV serotipine bağlı olarak, nöron etiketlemenin yönü anterograd veya retrograd11,12olabilir. Önceki çalışmalar, AAV5'in nöronlarda anterograd olarak seyahat ettiğini ortaya12. Böylece, hChR2'yi ifade eden hücre cisimlerinin fotostimülasyonu beynin başka yerlerinde presynaptik etkiler üretir (hedef)17.

Burada VTA glutamat nöronlarında ve aksonal projeksiyonlarda eYFP (muhabir) ve hChR2 (opsin) ifade etmek için CaMKIIα promotörüne sahip AAV (serotip 5) kullanıldı. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, CA1, CA3 ve DG hipokampal bölgelerdeki VTA glutamat presynaptik terminallerinin katmana bağımlı dağılımını göstermektedir. Ayrıca, VTA glutamat nöronlarının fototimülasyonu, temel değerlerle karşılaştırıldığında CA1 çok birimli ve tek birimli ateşleme oranlarını vivo olarak artırdı. Bu protokol, sinir devresi izleme deneylerinden elde edilen verilerin kalitesini artırabilecek uygun fiyatlı araçlar ve ticari olarak kullanılabilen yazılımları kullanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneysel ve hayvan işleme prosedürleri Louisiana Eyalet Üniversitesi Veterinerlik Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.

1. Deneysel hayvan

  1. 5-6 haftalık fareler kullanın.
  2. 12 saat değişen ışık ve karanlık döngü standart koşulları altında kafes başına 3-5 hayvan barındırın. Yiyecek ve su reklam libitum sağlanmalıdır.

2. Kraniyotomi ve hayvan hazırlığı

NOT: Bu bölümde fare kraniyotomisi için ameliyat öncesi ve peri-operatif prosedürler açıklanmaktadır. Standart stereotaktik aparat ve uygun koordinatları kullanın (Anteroposterior: AP, Mediolateral: ML ve Dorsoventral: DV). İlgi çekici beyin bölgesinin koordinatlarını belirlemek için bir fare beyin atlasına bakın.

  1. Fareleri intraperitoneal ketamin (100 mg/kg)/ksilazin (10 mg/kg) kokteyl enjeksiyonu ile uyuşturun. Ameliyat başlamadan önce his olmamasını sağlamak için bir parmak sıkışma testi gerçekleştirin.
    NOT: Alternatif olarak, bu adım için uygun burun odasına sahip izofluran anestezisi de kullanılabilir.
  2. Hayvanın başını stereotaksik aparat üzerine hafifçe sabitlayın.
    NOT: Bu işlem sırasında hayvanları dikkatli bir şekilde ele almak önemlidir. Ayrıca, ameliyata devam etmeden önce nefes alma oranını ve diğer hayati değerleri kontrol edin. Stresi azaltmak için hayvanın ~7 dakika dinlenmesine izin verin.
    1. Stereotaksik çerçeveye, hayvanın vücudunun üzerinde yatarak yatarak bir ısıtma yastığı yerleştirin. Bu, vücut sıcaklığını korumaya ve hayvanı prosedür dışında olsa da sıcak tutmaya yardımcı olacaktır. Ameliyat sonrası bakım ve iyileşme için ısıtma yastığını saklayın.
  3. Saç derisinin üzerindeki saçları çıkarmak ve cildi iyot çözeltisi ile temizlemek için bir makas kullanın.
    1. Kafa derisindeki hissi engellemek için topikal lidokrin uygulayın.
    2. Önden oksipital bölgeye uzanan orta çizgili bir kafa derisi kesisi yapmak için neşter kullanın.
    3. Kesi alanını iyot çözeltisi ile temizleyin, ardından calvaria'yı açığa çıkarın.
      NOT: Periosteumu kalvariden çıkarmak için az miktarda% 3 hidrojen peroksit çözeltisi uygulanabilir. Bu, simge yapıların (bregma ve lambda) ve dikişlerin görünürlüğünü artıracaktır.
    4. Fare beyni stereotaktik atlası kullanarak, bregmaya göre AP ve ML koordinatlarını belirleyin.
    5. VTA enjeksiyonu için, ultra ince künt noktalı iğne şırıngasını (örneğin, Nöros şırıngası) AP koordinatlarına yerleştirin: -3,08 mm/ML: bregmaya göre 0,5 mm.
    6. İşaretli AP/ML koordinatında kafatasında 1 mm'lik bir delik (kraniyotomi) delik açmak için bir delme aleti kullanın.
      NOT: Bu adım önemli düzeyde dikkat gerektirir. Matkap ucunun beyin dokusunu ezmemesi için delme yaparken minimum basınç uygulanmalıdır. Mevcut çalışmada matkap ucu 0,8 mm idi ve matkap hızı 15.000 rpm olarak belirlendi.
      DİkKAT: Kesi veya kalvarinin temizlenmesinde hidrojen peroksit kullanılmışsa, çözeltinin tamamen çıkarılmasını sağlayın veya delmeden önce tam kuruluk sağlayın.

3. AAV kokteyl enjeksiyonu

NOT: Bu bölümde yetişkin C57BL/6 farelerin VTA'sına (23-27 g) AAV enjeksiyonu işlemi açıklanmaktadır. Açıklanan yöntem, standart stereotaktik aparatlar ve uygun koordinatlar kullanılarak herhangi bir beyin bölgesine AAV enjeksiyonu için kullanılabilir. Bu protokolü göstermek için, eYFP ve hChR2, VTA glutamat nöronlarında CaMKIIα promotörü altında AAV5 aracılı transfeksiyon kullanılarak ifade edilmiştir (Şekil 1). Cre-lox rekombinasyonu bu adım için de kullanılabilir.

  1. Bir enjektöre ultra ince künt nokta iğnesi (32 G; 100 nL doğrulukta 5 μL kapasiteli) ile bir şırınga takın. Şırınga tutucuyu bir mikromanipülatöre sabitle.
    NOT: Bu prosedür için 1,6 nL kalibrasyonlu manuel şırınna tutucu kullanılmıştır. Otomatik bir enjektör de kullanılabilir.
  2. Sıvı akışını temizlemek ve test etmek için şırınnayı çift damıtılmış su ile doldurun.
  3. Buz üzerinde AAV (serotype 5) kokteyli aliquots çözün. AAV'ler iyi ifade için viral titreyi korumak için en iyi şekilde -80 °C'de saklanır.
  4. Monte edilen şırınnayı 1.000 nL AAV çözeltisi (fosfat tamponlu salin (PBS) 10 mM), pH 7.4 ile doldurun. İğneyi bir enjeksiyon bölgesine indirmeden önce sıvının akışını onaylamak için AAV çözeltisinin 10 nL'sini dağıtın.
  5. İğneyi stereotaktik olarak istenen derinliğe (DV koordinatı) indirmek için bir mikromanipülatör kullanın. İğneyi istenen derinliğe indirdikten sonra, şırınganın enjeksiyondan önce 10 dakika yerinde kalmasını kesin.
    NOT: Bu işlem için iğne, beynin pial yüzeyinden 4,5 mm derinlikte (DV) VTA'ya indirildi. Diğer beyin bölgeleri için uygun dorsoventral koordinatı kullanın (fare beyin atlasına bakın).
  6. VTA'ya 600-800 nL AAV enjekte edin. Enjeksiyon hacmi hedef sitenin boyutuna bağlı olarak ayarlanabilir.
    1. AAV çözümünü 60 nL/dk (3 dakika aralık) hızında sunun.
    2. VTA glutamat nöronlarında ve projeksiyonlarında eYFP ve hChR2'yi ifade etmek için AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP enjekte edin.
      NOT: Cre-lox rekombinasyon yöntemi, deneyin amacına bağlı olarak da kullanılabilir.
    3. AAV enjeksiyonundan sonra iğnenin 15 dakika yerinde kalmasını izin verin. Bu, difüzyonu ve geri akışı azaltacaktır.
  7. Şırınga iğnesini çekin ve yarayı kapatmak için kesiği dikin.
  8. Ameliyat sonrası bakımın bir parçası olarak antibiyotik ve analjezi uygular. Fareyi sıcak yastıklı bir platforma yerleştirin ve uyanana kadar hayvanı izleyin.
    NOT: 3 haftalık enjeksiyondan sonra fare beyin bölümlerinde muhabir proteininin (eYFP) floresan tespiti ile AAV ekspresyolü gözlemlenebilir. Ayrıca, fotostimülasyon deneyleri 3 hafta sonra yapılabilir (Şekil 2).

4. Optogenetik ile in vivo nöral kayıtlar için kurulum

NOT: Bu bölümde, bir beyin devresinin optogenetik izlemesi (CA1'e VTA glutamat nöron projeksiyonu) ile akut nöral kayıt için adımlar açıklanmaktadır. Gerekirse, bu adıma başlamadan önce sistemi (amplifikatör ve bağlantılar) elektrik gürültüsü ve topraklama sorunları için kontrol edin. Bu adımı bir Faraday kafesinde gerçekleştirmek, kayıttaki elektrik gürültüsünü ortadan kaldırmaya yardımcı olabilir.

  1. AAV enjeksiyonundan 3 hafta sonra, fareleri intraperitoneal üretan enjeksiyonu (0.2 mg/kg) ile uyuşturun.
    DİkKAT: Üretan kanserojendir ve koruyucu giysi giyerken dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Ayrıca, bu konsantrasyonda üretan anestezi uygulamak sağkalım değildir.
  2. Hayvanın başını daha önce açıklandığı gibi stereotaktik bir çerçeveye yapıştırın (adım 2.2, Şekil 3A). Durayı ortaya çıkarmak için kraniyotomi gerçekleştirin (Şekil 3A). Parietal kemiğin bir kısmını çıkarmak için bir delme aleti (bit boyutu: 0,8 mm, hız: 15.000 rpm) kullanın.
    1. Kraniyotomi yaklaşık 3 mm x 4 mm genişliğinde olmalıdır. Kuruluğu önlemek için bu bölgeye yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) damlaları uygulayın.
  3. Diseksiyon (dijital) mikroskop altında, maruz kalan durayı çıkarmak için bükülmüş bir iğne ucu (27 G) kullanın. Bu bölgedeki hassas pial kaplamayı ve kortikal dokuları ayırmamaya dikkat edin.
  4. Zemin vidasını (tava başı Phillips vidası) tutmak için oksipital kemikte bir delik açın (bit boyutu: 0.8 mm, hız: 10.000 rpm); M0,6 x 2,0 mm).
  5. Paslanmaz çelik zemin tellerini bağlayın.
    NOT: Diğer tel türleri de kullanılabilir (Şekil 3b).
  6. Kombine fototimülasyon (VTA) ve nöral kayıt (CA1) için ultra ince (10 μm veya 1 μm) mikromanipülatörlerle donatılmış çok raylı stereotaksik bir aparat kullanın. Optik fiberi ve kayıt sinir probını sırasıyla 10 μm aralık ve 1 μm menzilli mikromanipülatöre monte edin.
    1. Gerekirse, bir kafa aşaması prob adaptörü kullanın (Şekil 3c).
      NOT: Mevcut protokolde, 4 kanallı bir kayıt elektrodu(Şekil 3d)tutmak için 32 kanallı bir kafa aşamasına bir adaptör takılmıştır. Paslanmaz çelik öğütülmüş tel, adaptörün zemin bağlantı noktasına lehimlenmişti.
  7. Ap: -3.08 mm ML: 0.5 mm koordinatlarında, 400 μm çapındaki optik fiberi VTA'ya 200 μm düşür.
    1. Optik elyafı düşürmeden önce, yükseği fiber bağlantılı bir LED kaynağına bağlı bir fiber optik kabloya (paslanmaz çelik veya seramik yüksük ile) bağlayın.
      NOT: Işık yoğunluğunun ve odağın istenildiği gibi ayarlandığından emin olun. LED ışık kaynağının seçimi hedeflenen opsinlere karşılık gelmelidir. Burada, hChR2 fotoaktivasyonu için 470 nm (mavi ışık) LED sürücüsü kullanıldı (Şekil 4a).
    2. Işık darbesini nöral kayıtla senkronize etmek için, LED sürücüsünü ve kayıt denetleyicisi dijital IN bağlantı noktasını transistör-transistör mantığı (TTL) darbesine(Şekil 4b)bağlayın. Bu, bir BNC ayırıcı kullanılarak elde edilebilir.
      NOT: TTL darbeli solunum hizmeti kullanımı, istenen darbeli tren frekansını ve süresini dijital olarak ayarlama esnekliği sağlar. Mevcut protokolde, 50 Hz18'de 10ms ışık darbeleri tetiklendi. LED sürücünün TTL kontrolü için sürücüyü "tetikleyici" olarak değiştirin. Bu modda, ışık yoğunluğu "düğme" döndürülerek düzenlenebilir. Stimülasyon frekansı deneysel değişkenlere uyum sağlayacak şekilde ayarlanabilir ve 1 ila 100 Hz arasında değişebilir. Nöral devre izleme için >20 Hz'lik bir stimülasyon frekansı önerilir.
    3. Fotoelektrik eserler üretmeden yanıt oluşturabilecek etkili yoğunluğu belirlemek için düğmeyi ayarlayın. Gerekirse, objeleri ortadan kaldırmak için optik elyafı yeniden konumlandırın19.
      NOT: Mevcut protokol için kullanılan LED sürücü ~21,8 mW ışık gücü üretir.

5. Sinirsel kayıt

  1. En az 5 mm uzunluğunda, 15-50 μm kalınlığında bir saplı akut bir sinir probu kullanın.
    NOT: Derin beyin yapılarından kayıt, daha uzun saplı sinirsel problar gerektirecektir. Mevcut çalışmada 20 mm sap uzunluğunda bir prob kullanılmıştır.
  2. Ön amplifikatör kafa sahnesini seri çevre birimi arabirimi (SPI) kablosuyla kayıt denetleyicisine bağlayın. Kayıt denetleyicisi bağlantı noktalarında LED'lerin renk aydınlatmasını kontrol edin. Yeşil ve sarı LED'ler bağlı amplifikatör kartında uygun voltajı gösterir. Kırmızı LED, çalışan bir yazılım kafası sahne kontrolünü gösterir (Şekil 5b).
  3. Bir mikro manipülatör kullanarak, elektrot temas alanlarını CA1'in piramit hücre katmanına yerleştirin (AP: -1.94mm, ML: +1.0mm, DV: +1.1 ila 1.2mm).
    NOT: Optik fiber ve elektrot, fotostimülasyon ve kayıt için istenen diğer beyin bölgelerine konumlandırılabilir.

6. Amplifikatör ve filtre ayarları

  1. Kayıt denetleyicisi amplifikatör sistemini USB 3.0 bağlantı noktasından bir bilgisayara bağlayın. SPI kablosunu kullanarak baş sahneyi amplifikatöre bağlayın. Denetleyici yazılımını başlatın. Düzgün bağlanmamışsa, sistem bir "aygıt bulunamadı" iletisi görüntüler.
  2. Kanallardaki etkinliği görüntülemek için Çalıştır'ı tıklatın. Her dalga formu gerilim (y ekseni) ve zamana (x ekseni) olarak çizilir. İlgi alanına bağlı olarak, dalga biçimi ekranını ayarlamak için voltaj ve zaman ölçeklerini ayarlayın.
  3. Yalnızca birkaç kanal etkinse, depolama diskinde dosya boyutunu azaltmak için kullanılmayan kanalları devre dışı bırakın.
  4. Satın alma yazılımındaki bant genişliği parametrelerini düzenleyerek örnekleme hızını ve kesme frekanslarını ayarlayın. Tek birimli kayıt için üst ve alt kesme frekanslarını sırasıyla 300 Hz ve 5.000 Hz olarak ayarlayın. Amplifikatör örnekleme hızını 30 kS/s olarak değiştirin.
    NOT: Yüksek örnekleme hızı seçmek daha büyük bir dosya boyutu üretecektir.
  5. Kayıt etmeden önce, empedansı 1.000 Hz olarak ölçerek elektrot kanallarının bütünlüğünü kontrol edin. Bu, işlevi kullanıcı arayüzünde (denetleyici yazılımı) başlatarak yapılabilir. Bir çalışma kanalının empedans değeri 0,1 ila 5 MΩ arasında olmalıdır.
  6. Analog OUT bağlantı noktasına bir ses çıkışı (hoparlör) bağlıysa, optimum ani ses için kazancı ve susturucusu ayarlayın.
  7. TTL darbeli tren işaretçisini ani kayıtta görüntülemek için Digital IN işaretçisinin görüntüsünü etkinleştirin. Darbe treni zaman damgasını kaydetmek için, ana denemeden önce Digital IN kanal ekranını etkinleştirin.
    NOT: Genellikle birden fazla "Digital IN" kanalı (1 veya 2) vardır. TTL darbeciden gelen BNC kablosunun kayıt denetleyicisi yazılımında görüntülenmek üzere seçilen "DIGITAL IN" bağlantı noktasına bağlı olduğundan emin olun.
  8. Ani dalga biçiminin gerçek zamanlı görüntülenmesi için, başak kapsamı penceresini açın ve fare tıklatarak eşiği ayarlayın.
  9. Kök Ortalama Karesini (μV'de RMS) izleyerek gürültü seviyesini inceleyin. Temiz ani kayıt için, sinirsel ani artış eşiğinin en az 5x RMS olması tercih edilir.
  10. Kurulum tamamlandıktan sonra dosya çıkış biçimini seçin.
    NOT: Burada, CA1 sinirsel ani artış .rhd biçiminde kaydedildi. Diğer dosya biçimleri (.rhs ve .dat) analiz yazılımı tarafından izin verilen dosya biçimleriyle eşleşecek şekilde de seçilebilir.

7. In vivo optogenetik kayıt ve ayarlar

  1. Çeşitli ayarlanabilir darbe parametrelerini görüntüleyen darbe kontrol yazılımını (TTL) açın. Yazılımda uygun COM bağlantı noktasını seçin. Tren ve Grup ayarlarını yaparak darbe parametrelerini ayarlayın.
    NOT: Nabız durumu deneysel değişkenler ve tasarım göz önünde bulundurularak belirlenmelidir.
  2. Amplifikatör denetleyicisi yazılımında, hipokampustaki veya istenen beyin bölgesindeki sinirsel ani artışları algılamak için Çalıştır'ı tıklatın. Gerekirse, uygulanabilir ve aktif nöronları tespit etmek için elektrot derinliğini ayarlayın.
  3. Hücre dışı voltaj aktivitesi tespit edildikten sonra, 15 dakika boyunca taban çizgisi sivri uçlarını gözlemleyin ve hayvanın hayatilerini izleyin. Ayrıca, CA1 veya istenen anatomik hedef bölgedeki duyarlı nöronları tespit etmek için ışık darbesini test edin.
    NOT: Fotoelektrik objeleri kontrol edin ve ışık yoğunluğunu veya optik fiber konumunu ayarlayarak ortadan kaldırın.
  4. Işık darbesini istenen frekansta tetiklemeden önce temel aktiviteyi ~10 dakika boyunca kaydedin(Şekil 5a,b). Bu, aydınlatmalı ve aydınlatmasız ateşleme veya patlama oranlarının karşılaştırılmasına izin verecektir.
    NOT: Mevcut çalışmada, temel aktivite aydınlatma olmadan 10 dakika boyunca kaydedilmiş, ardından 50 Hz 'de aydınlatma(Film 1).

8. Analiz

  1. .rhd dosyasını Nex5 çıktı biçimine dönüştürün.
  2. İşlem dosyası adı. Tek birim raster trenleri ve dalga formlarını algılamak için çevrimdışı bir sıralayıcı yazılımında Nex5 dosyası (Şekil 5a–b).
    1. Açılan pencereden istediğiniz kanalı seçin.
      NOT: Sürekli kaydedilen ani veriler OFSS'nin ayrı bir penceresinde görüntülenebilir. Zaman ölçeği de ayarlanabilir. Bir tetrode kullanılırsa, OFSS 4 kanalı tetrode olarak sıralamak için ayarlanabilir.
    2. Eşik geçişi dalga biçimi ekstraksiyonu için voltaj seviyesini ayarlayın.
      DİkKAT: Uygun ani algılama için en az 5x RMS kullanın.
    3. Dalga formlarını algılayın, ardından vadi arama (otomatik) veya K-means (yarı otomatik) yöntemini kullanarak ani sıralama gerçekleştirin. Gerektiğinde, 3D-Principal Bileşen Analizi (PCA) alanının benzer bölgelerini kaplayan birimleri birleştirin.
    4. Sıralanmış dışarı aktarma . Daha fazla analiz için Nex5 dosyaları (Şekil 5c–d).
      NOT: Ara aralık, atış hızı ve patlama hızı için analiz sonuçları diğer analiz platformlarına aktarılabilir.

9. AAV ifadesinin floresan tespiti

  1. Kayıttan sonra, hayvanı bir izofluran odasında ötenazi.
  2. 10 mM PBS (~10 mL) ile transkardiyal perfüzyon ve ardından %4 fosfat tamponlu paraformaldehit (PB-PFA, ~10 mL) gerçekleştirin.
  3. Tüm beyni sağlam bir şekilde çıkarın ve 48 saat boyunca% 4 PB-PFA'da sabitle.
  4. Sabit beyni 4 °C'de kriyoprezervasyon için %30 sakkaroz içeren %4 PB-PFA'ya aktarın. 72 saat sonra, beyni kriyostatta bölümleyin ve jelatin kaplı bir kaydıraktan dilimler monte edin.
    NOT: Mevcut protokolde, DG, CA3 ve CA1'deki AAV etiketli terminalleri göstermek için hipokampüsün (rostral) kapalı kısmını içeren bölümler seçilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Anterograd izleme

AAV ekspresyolojisi, enjeksiyondan 21 gün sonra C57BL/6 fare vtasında muhabir proteininin (eYFP) immünofluoresans görüntülemesi ile doğrulanmıştır (Şekil 2). Hipokampustaki presynaptik VTA glutamat projeksiyonlarının başarılı anterograd etiketlemesi de DG, CA3 ve CA1 katmanlarında eYFP tespiti ile doğrulandı(Şekil 6a–d; Film 2 ve 3).

Hipokampusa VT...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Son on yılda, AAV yapılarının tasarımı önemli ölçüde ilerlemiştir. Bu nedenle, daha fazla nörona özgü promotörler, gelişmiş transfeksiyon özgüllüğü için bir dizi AAV serotipine dahil edilmiştir14. Floresan proteinler, taşıyıcılar, reseptörler ve iyon kanalları için genleri birleştirerek, AAV kütüphaneleri artık görüntüleme, nöromodülasyon ve sinaptik aktivite tespiti için mevcuttur. Ticari olarak mevcut AAV yapılarında, genetik olarak kodlanmış bir florofor ve iyon kanallarının (opsin) bir kombina...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, OOM'ye verilen CBS Bridging Grant tarafından finanse edilir. OOM, PAA ve AS çalışmayı tasarladı ve deneyleri gerçekleştirdi. AS ve PAA sonuçları analiz etti. Makaleyi OOM ve PAA hazırladı. Dr. Karl Disseroth'a (Stanford Üniversitesi) AAV'ı kullanımımıza sunduklarından dolayı teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 3 Hidrojen peroksitFisher kimyasalH312
AAV-CaMKII&alfa;-ChR2-eGYPAddgenePlazmid # 26969
BNC kablosuAmazon
BNC BölücüAmazon
Seramik Bölünmüş Çiftleşme Kılıfı & oslash için; 1,25 mm yüksükler.ThorlabsADAL1-5
MatkapDremelLR 39098
Jelatin kaplı slaytlarFisher scientificOBSLD01CS
Hamilton'un şırıngası (Neuros)WPI Inc.06H
Kafa aşaması adaptörüNeuronexusAdpt-Q4-OM32
Yüksek empedanslı silikon probNeuronexusQ1x1-tet-5mm-121-CQ4
INTAN 512ch Kayıt Kontrol CihazıINTANRHD2000
İyot çözeltisiDynarex1425
İzofluranPiramalNDC 66794-017-25
KetaminSpektrumuK1068
LED SürücüThorlabsLEDD1B
LED ışık kaynağı (470 nm)-mavi ışıkThorlabsM470F3
MikromanipülatörNarishigeM0-203
Optik fiberThorlabsCFMLC14L05
Pan başlı philips vida (M0.6 X 2mm)AmazonM0.6 X 2mm
Ön amplifikatör headstage (32 Kanal)INTANC3314
Stereotaksik çerçeveKopf1530
TTL pulserPrizmatix4031
ÜretanSigmaU2500
XylazineAlfa AesarJ61430
SoftwareCompany Version
Graphpad PrizmaGraphPad Yazılımısürüm 8
Intan Kayıt DenetleyicisiIntantechsürüm 2.07
NeuroexplorerNex Technologiessürüm 5.215
Plexon Çevrimdışı Spike SıralayıcıPlexon Incsürüm 4.5
ACSF Kompozisyon:
95 Oksijen <% 5 COsub>2 < / sub> ile güçlü oksijenli ACSF (ACSF; mM cinsinden 125 NaCl, 25 NaHCO3< / sub>, 3 KCl, 1.25 NaH2< / sub>PO4< / sub>, 1 MgCl 2< / sub>, 2 CaCl2 ve 25 Glikoz).
%

Kaynaklar

  1. Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
  2. Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neuroscience bulletin. , 1-12 (2019).
  3. Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
  4. Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
  5. Dragatsis, I., Zeitlin, S. A method for the generation of conditional gene repair mutations in mice. Nucleic acids research. 29 (3), 10(2001).
  6. Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
  7. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in cognitive sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
  8. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251(2012).
  9. Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
  10. Kohara, K., et al. Cell type-specific genetic and optogenetic tools reveal hippocampal CA2 circuits. Nature Neuroscience. 17 (2), 269(2014).
  11. Gombash, S. E. Adeno-Associated Viral Vector Delivery to the Enteric Nervous System: A Review. Postdoc Journal. 3 (8), 1-12 (2015).
  12. Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-Associated Viral Vectors in Neuroscience Research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
  13. Montardy, Q., et al. Characterization of glutamatergic VTA neural population responses to aversive and rewarding conditioning in freely-moving mice. Science Bulletin. 64 (16), 1167-1178 (2019).
  14. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  15. Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
  16. Zingg, B., et al. AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
  17. Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain. Gene therapy. 10 (17), 1528(2003).
  18. Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87(2019).
  19. Buzsaki, G., et al. Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics. Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).
  20. Benardo, L. S., Prince, D. A. Dopamine action on hippocampal pyramidal cells. Journal of Neuroscience. 2 (4), 415-423 (1982).
  21. Davidow, J. Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence. Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).
  22. Hu, H. Reward and Aversion. Annual Review of Neuroscience. 39, 297-324 (2016).
  23. Kahn, I., Shohamy, D. Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans. Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).
  24. Lisman, J. E. Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions. Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).
  25. Lisman, J. E., Grace, A. A. The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory. Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).
  26. Broussard, J. I., et al. Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus. Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).
  27. Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity. Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).
  28. Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task. Learning & Memory. 21 (2), 61-72 (2014).
  29. Ntamati, N. R., Luscher, C. VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus. eNeuro. 3 (4), (2016).
  30. Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 13697(2016).
  31. Funahashi, S. Working Memory in the Prefrontal Cortex. Brain Sciences. 7 (5), (2017).
  32. Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area. Science. 333 (6040), 353-357 (2011).
  33. McNamara, C. G., Dupret, D. Two sources of dopamine for the hippocampus. Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).
  34. McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence. Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).
  35. Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).
  36. Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
  37. Zingg, B., et al. AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
  38. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
  39. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
  40. Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. Two-photon optogenetics. Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

VTA Glutamat N ronlarHipokampal CA1 TabakasAAV Ba ml aretlemeOptogenetik Stim lasyonAnterograd zlemeY ksek Empedansl Elektrotlaroklu nite KaydFloresan G r nt lemeStereotaksik CerrahiIn Vivo Optogenetik

İlgili makaleler