Yöntem makalesi

Kolorektal Kanser Hücrelerinin Üç Boyutlu Küresel Kültürlerinde Probiyotiklerin Hücresiz Süpernatantı Kullanılarak Hücre Ölümünün Değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/61285

⸱

13 Haziran 2020

 ,  ,  ,  , 
1Microbiological Analysis Team, Group for Biometrology, Korea Research Institute of Standards and Science (KRISS), 2College of Pharmacy, Chungnam National University (CNU), 3Stem Cell Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), 4Convergent Research Center for Emerging Virus Infection, Korea Research Institute of Chemical Technology (KRICT), 5Department of Bio-Analysis Science, University of Science & Technology (UST)

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada Lactobacillus hücresiz süpernatantın (LCFS) kanser önleyici etkilerini anlamak için yöntemler sunulmaktadır. Kolorektal kanser hücre hatları 3D kültürlerde LCFS ile tedavi edildiğinde hücre ölümlerini göstermektedir. Sferoid üretme süreci iskeleye bağlı olarak optimize edilebilir ve sunulan analiz yöntemleri ilgili sinyal yollarını değerlendirmek için yararlıdır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, probiyotikkültürü olarak kabul edilen Lactobacillus fermentum hücre kültüründen süpernatantlar kullanarak çok hücreli kanser hücrelerinin üç boyutlu (3D) sferoidlerinde kanser hücresi ölümlerini değerlendirmek için bir protokol açıklanmaktadır. Lactobacillus hücresiz süpernatant (LCFS) test etmek için 3D kültürlerin kullanımı, özellikle L. fermentum bağırsak içinde kanser önleyici etkiler üretebileceğinden, 2D monolayerlerde test etmekten daha iyi bir seçenektir. L. fermentum supernatant'ın 3D kültür koşullarında çeşitli kolorektal kanser (CRC) hücrelerine karşı artan anti-proliferatif etkilere sahip olduğu belirlendi. İlginçtir ki, bu etkiler L. fermentum'un kanser hücre ölümünü teşvik etmedeki önemli yeteneğini gösteren kültür modeliyle güçlü bir şekilde ilişkiliydi. Aşağıda sunulan protokol kullanılarak çeşitli CRC'lerden (kolorektal kanser hücreleri) stabil sferoidler üretilmiştir. 3D küresel oluşturmanın bu protokolü zaman tasarrufu sağlar ve uygun maliyetlidir. Bu sistem, LCFS'nin birden fazla CRC sferoid türündeki kanser önleyici etkilerini kolayca araştırmak için geliştirilmiştir. Beklendiği gibi, deney sırasında LCFS ile tedavi edilen CRC sferoidleri hücre ölümünü güçlü bir şekilde indükledi ve qRT-PCR, batı şişkinliği ve FACS analizi ile analiz edildiği gibi spesifik apoptoz moleküler belirteçlerini ifade etti. Bu nedenle, bu yöntem hücre canlılığını keşfetmek ve anti-kanser ilaçlarının etkinliğini değerlendirmek için değerlidir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Probiyotikler, bağışıklık homeostazını geliştiren ve enerji metabolizmasını barındıran bağırsaktaki en avantajlı mikroorganizmalardır1. Lactobacillus ve Bifidobacterium probiyotikleri bağırsakta bulunan türünün en gelişmişidir2,3. Önceki araştırmalar Lactobacillus'un kolorektal kanser de dahil olmak üzere çeşitli kanserler üzerinde inhibitör ve antiproliferatif etkileri olduğunu göstermiştir4. Ayrıca, probiyotikler enflamatuar bağırsak hastalıklarını, Crohn hastalığını ve ülseratif koliti önler5,6. Bununla birlikte, probiyotiklerle yapılan çalışmaların çoğu katı yüzeylerde yetişen iki boyutlu (2D) monolayerlerde gerçekleştirildi.

Yapay kültür sistemleri, kanser hücreleri için doğal olmayan çevresel özelliklerden yoksundur. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için üç boyutlu (3D) kültür sistemleri geliştirilmiştir7,8. 3D kanser hücreleri hücre canlılığı, çoğalma, morfoloji, hücre-hücre iletişimi, ilaç duyarlılığı ve in vivo alaka düzeyi9,10gibi temel biyolojik mekanizmalar açısından iyileşmeler göstermektedir. Ayrıca, sferoidler çok hücreli kolorektal kanser türlerinden yapılır ve hücre-hücre etkileşimlerine ve hücre dışı matrise (ECM)bağlıdır 11. Önceki çalışmamız, Lactobacillus fermentum kullanılarak üretilen probiyotik hücresiz süpernatantın (CFS) kolorektal kanser (CRC) hücrelerinin 3D kültürleri üzerinde kanser önleyici etkiler gösterdiğini bildirmiştir12. CFS'nin probiyotik etkilerini 3D sferoidler üzerinde test etmek için uygun bir alternatif strateji olduğunu önerdik12.

Burada, probiyotik hücresiz süpernatantın (CFS) çeşitli 3D kolorektal kanser taklit sistemleri üzerindeki terapötik etkilerinin analizi için çok hücreli 3D kolorektal kanser türlerini barındırabilecek bir yaklaşım sunuyoruz. Bu yöntem, ilgili probiyotik ve anti-kanser etkilerinin in vitro analizi için bir araç sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bakteriyel hücre kültürleri ve Lactobacillus hücresiz süpernatant hazırlanması (LCFS)

NOT: Adım 1.2 – 1.9 anaerobik bir odada gerçekleştirilir.

  1. L-sistein içeren bir MRS agar tabağı ve et suyu hazırlayın ve otoklavlayarak sterilize edin.
  2. 37 °C'de tutulan H2 anaerobik haznedeki MRS agar plakasını 20 ppm oksijenle önceden kuluçkaya yatırın.
  3. Lactobacillus bakteri stoğunu çözün ve agar plakasını bakteri kültürü ile aşıla(Şekil 1A (i)).
  4. Tek bakteri kolonileri elde edilene kadar 37 °C'de H2 anaerobik odada ve 20 ppm oksijende bakterileri 2 - 3 gün kuluçkaya yatırın.
  5. Hungate tipi anerobik kültür tüpünü yıkayın ve kurutun. Kültür tüpünü 121 °C'de 15 dakika boyunca otoklavlayın.
  6. Daha sonra oksijeni çıkarmak için tüpü 37 °C'de H2 anaerobik haznede ve 20 ppm oksijende kuluçkaya yatırın.
  7. Tüpe 2 - 3 mL MRS suyu yerleştirin. Tüpü bir bütil kauçuk durdurucu ile kapatın ve kapağı vidaleyin.
  8. Bir döngü ile tek bir koloni elde edin ve 500 μL 1x PBS ile 1,5 mL kültür tüpüne yerleştirin. (Şekil 1A (ii)).
  9. Koloniyi 1 mL şırıng kullanarak askıya alın (Şekil 1A (iii)). Bunu, 1 mL şırınganın iğnesini tüp kapağının ortasına yerleştirerek, askıya alınmış koloniyi aspire ederek ve ardından MRS et suyu ortamına geri koyarak yapın. (Şekil 1A (iv)).
  10. MRS et suyu medyasını 2 gün boyunca bir çalkalayıcı inkübatörde kuluçkaya yatırın (37 °C,%5CO 2 , 200 rpm).
  11. OD 620'deki absorbans2,0'a ulaşana kadar bakteri üreme eğrilerini izlemek için bir spektrofotometre kullanarak optik yoğunluğu (OD) ölçün.
  12. Bakteriyel peletleri ve şartlandırılmış ortamı 15 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleme yaparak ayırın. Toplanan bakteri peletlerini 1x PBS ile yıkayın ve % 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş 4 mL RPMI 1640'ta yeniden dürtün. Ortama antibiyotik eklemeyin.
  13. Bakteriyel peletleri RPMI'de saklayın ve 100 rpm hızında% 5 CO 2 ile 37 °C'de4 saat boyunca bir çalkalayıcı inkübatörde kuluçkaya yatırın.
  14. Probiyotik süpernatantın hazırlanması için, bakteri peletini 1000 x g'dasantrifüjleme yoluyla 4 °C'de 15 dakika boyunca çıkarın. Kurtarılan süpernatantı 0,22 μm filtre kullanarak steril filtreleyin ve kullanıma kadar −80 °C'de saklayın.

2. Küresellerin üretimi

  1. Kolorektal kanser hücre hatları hazırlanıyor
    1. DLD-1, HT-29 ve WiDr hücre hatlarını %70-80 konfülansa kadar monolayer olarak büyütün ve plakayı %5 CO2 inkübatöründe 37 °C'de kuluçkaya yatırın (Büyüme ortamı: %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomin içeren RPMI).
    2. 100 mm Petri kabında yetişen hücreler için, plakayı 4 mL 1x PBS ile iki kez yıkayın. % 0.25 tripsin-EDTA'nın 1 mL'sini ekleyin ve hücreleri ayrıştırmak için Petri kabını% 5 CO 2 inkübatörde 37 ° C'de2 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. kuluçkadan sonra, mikroskop altında hücre ayrışması olup olmadığını kontrol edin ve 5 mL büyüme ortamı ile tripsin-EDTA'yı nötralize edin.
    4. Ayrışmış hücreleri 15 mL konik tüpe ve santrifüje 300 x g'da 3 dakika aktarın.
    5. Süpernatant atın ve 3 mL büyüme ortamı ile hafifçe yeniden diriltin.
    6. Hemositometre kullanarak uygulanabilir hücreleri belirlemek için tripan mavisi olan hücreleri sayın. (Şekil 1B (i))
  2. Küresel oluşum
    1. 15 mL konik tüpte, hücreleri 2,1,5'ten seyrelterek 1 - 2 x 105 hücre/mL elde edin (Şekil 1B (ii))
    2. Hücre süspansiyonuna% 0.6 metilselülozun son konsantrasyonu ekleyin ve seyreltilmiş hücreleri steril bir rezervuara aktarın.
      NOT: Her hücre hattı için ihtiyaç duyulan metilselüloz miktarı titratlanmalı ve buna göre belirlenmelidir.
    3. Ultra düşük ekli 96 kuyulu yuvarlak alt mikro plakanın her kuyusuna 200 μL hücre dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın. (Şekil 1B (iii))
    4. Plakayı 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörde 24 - 36 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
    5. 24 - 36 saat sonra, küresel oluşumu sağlamak için plakayı hafif bir mikroskop altında gözlemleyin.

3. LCFS ile 3D kolorektal kanser hücrelerinin tedavisi

  1. Adım 2 ve 3'te açıklandığı gibi küreseller oluşturun.
  2. LCFS tedavisini yapmadan önce, donmuş LCFS'yi oda sıcaklığında (RT) 10 - 20 dakika çözün.
  3. LCFS stok çözümünü bir büyüme ortamına aşıla. Büyüme ortamında seri olarak %25, %12,5 ve %6 oranında seyreltin (yani% 25 LCFS = 150 μL büyüme ortamı + 50 μL LCFS).
  4. Sferoid içeren hücre kültürü plakasını inkübatörden çıkarın ve 200 μL pipet kullanarak her kuyudan mümkün olduğunca fazla büyüme ortamını çıkarın.
  5. Hücrelere LCFS ile büyüme medyasını ekleyin ve 24 - 48 saat boyunca% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de kuluçkaya yatırın.
    NOT: Kullanılacak hacim plaka boyutuna aşağıdaki gibi bağlı olacaktır: 6 kuyulu hücre kültürü plakaları için 2 mL; 96 kuyulu hücre kültürü plakaları için 200 μL.

4. Küreseller için hücre canlılığı

  1. Opak duvarlı çok kuyulu plakalarda 8 - 10 LCFS ile tedavi edilen kolorektal kanser sferoidleri hazırlayın (hücre canlılığı tahlilleri LCFS tedavisinden sonra 48 saat yapılır).
  2. Hücre canlılığı reaktifini (bkz. Malzeme Tablosu) 4 °C'de bir gece boyunca çözün.
  3. Kullanmadan önce hücre canlılığını oda sıcaklığına aşındırın.
  4. Tahlil yapmadan önce, büyüme ortamlarının% 50'sini küresellerden çıkarın.
  5. Her kuyuya 100 μL hücre canlılığı reaktifi ekleyin.
    NOT: Kullanılacak hacim plaka boyutuna aşağıdaki gibi bağlı olacaktır: 96 kuyulu hücre kültürü plakaları için 100 μL.
  6. Hücre lizizini teşvik etmek için reaktifi 5 dakika boyunca kuvvetlice karıştırın.
  7. 37 °C'de 30 dk – 2 saat kuluçkaya yaslayın.
  8. Lüminesansı kaydet.

5. Küreseller için nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyon analizi

  1. Her durum için, 2 mL'lik bir tüpte 10 - 15 sferoid hazırlayın ve 400 x g'da 3 dakika santrifüj hazırlayın.
  2. Süpernatantı atın ve küreselleri 1 mL buz gibi 1x PBS'de iki kez yıkayın.
    NOT: Santrifüjlemeden kaçının, küresellerin yerleşmesine izin verin.
  3. 1x PBS'den mümkün olduğunca fazla emiş edin ve piyasada bulunan bir kit kullanarak RNA'yı izole edin.
  4. Üreticinin protokolüne göre piyasada bulunan bir kit kullanarak cDNA'yı 1 μg RNA'dan sentezleyin.
  5. Tüm örnekleri üç taraflı olarak çalıştırmak için bir ana karışım hazırlayın (bkz. Tablo 1 ve Tablo 2).
  6. Amplifikasyonu her qPCR plakasına şablon ana karışımının 20 μL'lik bir bölümünde iyi bir şekilde gerçekleştirin.
  7. Reaksiyonları iyice karıştırın ve gerekirse döndürün.
  8. Numuneleri cihaz üreticisinin önerilerine göre çalıştırın (Tablo 3).

6. Küresellerden batı şişkinliği

NOT: Küreselleri toplarken, 200 μL pipet kullanın ve yapılarını bozmamak için uçların ucunu kesin.

  1. Her durum için, 2 mL'lik bir tüpte 30 - 40 sferoid hazırlayın.
  2. Tüpü buza yerleştirin ve küresellerin 2 mL tüpün dibine yerleşmesine izin verin.
  3. Süpernatantı atın ve küreselleri 1 mL buz gibi 1x PBS'de iki kez yıkayın
    NOT: Santrifüjlemeden kaçının, küresellerin yerleşmesine izin verin.
  4. 1x PBS'den mümkün olduğunca fazla emiş ve bir proteaz inhibitörü kokteyli (10 küresel = 30 μL RIPA tamponu) ile RIPA tamponu ekleyin.
  5. Hücreleri yukarı ve aşağı pipetleme ile lyse ve 10 döngü boyunca buz üzerinde 30 s dinlenme ile 30 s sonication gerçekleştirin.
  6. Protein lysates'i 15000 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüj edin.
  7. Her hücre lisat için protein konsantrasyonu belirleyin.
  8. Yüklemeden önce, her hücre lisat 10 dakika boyunca 100 °C'de bir örnek tamponda kaynatın.
  9. SDS-PAGE jelinin kuyularına eşit miktarda protein yükleyin ve jeli 100 V'ta 1 - 2 saat çalıştırın.
  10. Proteini jelden PVDF membranlarına aktarın.
  11. Aktardıktan sonra, bir bloklama tamponu kullanarak membranı oda sıcaklığında 1 saat boyunca engelleyin (%5 yağsız süt + %0,05 Ara-20 ile TBS).
  12. Membranı 1:1.000 primer antikor seyreltme ile kuluçkaya yatırın (Tablo 4) 1x TBST'de% 5 BSA tampon ile bir gecede 4 °C.
  13. Membranı TBST ile üç kez yıkayın, her yıkama için 15 dk.
  14. Membranı 2 saat boyunca oda sıcaklığında blokaj tamponunda 1:2.500 ikincil antikor seyreltmesi ile kuluçkaya yatırın(bkz. Malzeme Tablosu).
  15. Membranı TBST ile üç kez yıkayın, her yıkama için 15 dk.
  16. Membranı bir chemiluminescent substrat ile HRP tespiti için hazırlayın.
  17. Chemiluminescent görüntüleri alın.

7. Sferoidlerin propidium iyodür (PI) lekesi

  1. Adım 4.1'de açıklandığı gibi 5-10 küresel hazırlayın ve küreselleri 37 °C ve% 5 CO2'debir inkübatöre yerleştirin.
  2. 1x PBS'de PI 1:100'ün 1 mg/mL stokunu seyreltin.
  3. 96 kuyu plakasının her kuyusundan ortamın% 50'sini çıkarın.
  4. Her kuyuya 100 μL PI çözeltisi ekleyin ve kuyuları 37 °C'de bir inkübatöre ve 10 - 15 dakika boyunca% 5 CO2'ye yerleştirin.
  5. PI çözümünü 1x PBS ile yıkayın.
  6. 200 μL büyüme ortamı ekleyin ve floresan mikroskop kullanarak görüntü alın. Küreselin canlılık sayısını elde etmek için Görüntü J'yi kullanarak floresan yoğunluğunu analiz edin.

8. Küresel sferoidlerin FACS analizi

  1. Daha önce açıklandığı gibi küreseller oluşturun.
  2. Her durum için, bir FACS tüpünde 30 - 40 sferoid hazırlayın ve 400 x g ve RT'de 3 dakika santrifüj hazırlayın.
  3. Süpernatantı emiş edin ve küreselleri 1x PBS'nin 3 mL'sinde yıkayın, ardından 4 °C'de 3 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjün.
  4. Süpernatantı aspire edin ve% 0.25 Trypsin-EDTA'nın 200 μL'sini ekleyin, ardından RT'de 2 -3 dakika kuluçkaya yatırın.
    NOT: Kuluçka süresi küresel boyuta ve hücre tipine bağlıdır.
  5. 1 mL FACS tamponu ekleyin ve 200 μL pipet kullanarak küreselleri hafifçe dağıtın.
  6. Ayrışmış hücreleri 400 x g ve 4 °C'de 3 dakika santrifüj edin.
    NOT: FACS arabelleği = 1x PBS + %2,5 FBS, 0,22 μm üst filtre kullanılarak filtrelenmiştir.
  7. Üstnatan atın ve 7-AAD/Annexin V reaktif (7AAD (5 μL), Annexin V (5 μL)/sample ekleyin.
  8. Hücreleri hafifçe girdaplayın ve karanlıkta RT'de 13 - 30 dakika kuluçkaya yatırın.
  9. 500 μL FACS tamponu ekleyin ve toplam hücreleri çıkarmak için konik polistiren test tüpleri kullanarak hücreleri filtreleyin.
  10. 3 dakika boyunca 400 x g ve 4 °C'de santrifüj.
  11. Her tüpe 500 μL Ek V bağlama tamponu ekleyin ve yeniden dirildi.
  12. Akış sitometresi kullanarak analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çeşitli kolorektal kanser hücre hatlarından sferoid elde etme protokolünü açıklıyoruz. Sferoid üretmek için metilselüloz ile takviye gerekiyordu. Ayrıca LCFS hazırlama yöntemini sunuyoruz ve probiyotikler ile kolorektal kanser arasındaki korelasyonu incelemek için bir model sunuyoruz. Küresel formasyon ve LCFS hazırlama protokolleri Şekil 1A,B'deşematik olarak gösterilmiştir. Şekil 2A'dagösterildiği gibi, %0,6'luk metilselüloz konsantrasyonu kan...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komşu hücreler ve hücre dışı matris (ECM) de dahil olmak üzere doku mikroçevrasyonu doku üretimi için temeldir ve hücre büyümesi ve doku gelişiminin kontrolünde çok önemlidir13. Bununla birlikte, 2D kültürlerin hücresel etkileşimlerin bozulması, hücre morfolojisindeki değişiklikler, hücre dışı ortamlar ve bölüm14yaklaşımı gibi çeşitli dezavantajları vardır. 3D hücre kültürü sistemleri in vivo etkileri daha iyi üretmek için titizlikle çalışılmıştır ve in vitro kanser testi i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların konuyla ilgili herhangi bir finansal açıklaması bulunmamaktadır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Kore Standartlar ve Bilim Araştırma Enstitüsü tarafından finanse edilen "Kimya ve Radyasyon için ölçüm standartlarının oluşturulması", KRISS-2020-GP2020-0003 hibe numarası ve "Biyomalzemeler ve Tıbbi Yakınsama için Ölçüm Standartlarının ve Teknolojisinin Geliştirilmesi", KRISS-2020-GP2020-0004 programlarının hibe numarası ile desteklenmiştir. Bu araştırma bilim ve Bİt Bakanlığı (MSIT), Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF-2019M3A9F3065868), Sağlık ve Refah Bakanlığı (MOHW), Kore Sağlık Endüstrisi Geliştirme Enstitüsü (KHIDI, HI20C0558), Ticaret, Sanayi ve Enerji Bakanlığı (MOTIE) ve Kore Sanayi Teknolojisi Değerlendirme Enstitüsü (KEIT, 20009350) tarafından da desteklendi. ORCID Kimliği (Hee Min Yoo: 0000-0002-5951-2137; Dukjin Kang: 0000-0002-5924-9674; Seil Kim: 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun Lee: 0000-0002-2495-1439; Jina Lee: 0000-0002-3661-3701). Deneylere yardım için Chang Woo Park'a teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar

%10 Mini-PROTEAN TGX Prekast Protein Jelleri, 15 kuyulu, 15 & l		Biorad456103610
Uygulamalı Biyosistem MicroAmp Optik Yapışkan FilmThermo Fisher Scientific4311971 100
10x transfer tamponunuIntronIBS-BT031A1 L
10X Tris-Glisin (W/SDS)IntronIBS-BT0141 L
Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Mikrosantrifüj Tüpü, Polipropilen, Şeffaf, Steril Olmayan, 500 Tüp/Paket, 10 Paket / KutuCorningSCT-200-C500 Tüp / Paket, 10 Paket / Kutu
BD Difco Bacto AgarBD214010500 g
BD Difco Lactobacilli MRS Et SuyuBDDF0881-17-5500 g
CellTiter-Glo 3D Hücre canlılığı deneyiPromegaG9681100μ 96 oyuklu plakalarda l/tahlil
Komple Proteaz İnhibitörü KokteylSigma-Aldrich1169749800120 tabletlik şişe
Corning Fosfat Tamponlu Salin, 1X kalsiyum ve magnezyum içermez, PH 7.4 & plusmn; 0.1Corning21-040-CV500 mL
EMD Millipore İmmobilon-P PVDF Transfer Membranlarıfisher ScientificIPVH0001026.5cm x 3.75m rulo; Gözenek Boyutu: 0.45um
Falcon 5 mL Yuvarlak Tabanlı Polistiren Test Tüpü, Hücre Süzgeci ÇıtçıtlıKapaklı Corning35223525/Paket, 500/Kutu
Fetal Sığır Serumu, sertifikalı, ABD menşeiliThermo Fisher Scientific16000044500 mL
iScript cDNA Sentez Kiti, 25 x 20 & l rxns #1708890Biorad170889025 x 20 ve mikro; L rxns
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad17251215 x 1 mL
Lactobacillus fermentumTip Kültürler için Kore KoleksiyonuKCTC 3112
L-Sistein hidroklorür monohidratSigma-AldrichC6852-25G25 g
Metil Selüloz (3500-5600mPa ve orta nokta; s, 20 ° C'de Suda% 2; C)TCIM0185500 g
MicroAmp Hızlı Optik 96 Kuyulu Reaksiyon Plakası, Barkodlu, 0.1 mLUygulamalı Biyosistemler434690620 plaka
Millex-GS Şırınga Filtre Ünitesi, 0.22 & m, karışık selüloz esterleri, 33 mm, etilen oksit sterilizeedilmiş MilliporeSLGS033SB250
PE Annexin V Apoptoz Tespit Kiti, 7-AADBiolegend640934100 testli
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122100 mL
Propidium İyodürİntrojenP1304MP100 mg
RIPA Lizis ve Ekstraksiyon TamponuThermo Fisher Scientific89901250 mL
RNeasy Mini Kit (250)Qiagen74106250
RPM-1640Gibco11875-119500 mL
Tripsin-EDTA (%0,25), fenol kırmızısıThermo Fisher Scientific25200056100 mL
Malzemelerin / Ekipmanın / Yazılımın Adı < / strong>Company< / strong>Katalog Numarası<strong>Yorumlar/Açıklama
anti - p-Iκ B & alfa; (B-9)Santa cruzesc-8404200 ve mikro; g/mL
anti-BclxL (H-5)Santa cruzesc-8392200 & mikro; g/mL
anti-PARP 1 (C2-10)Santa cruzesc-5364350 & mikro; l asit
anti-β-aktin (C4)Santa cruzesc-47778200 &mikro; g/mL
BD FACSVerseBD BiosciencesSan Diego, CA, ABD
Synergy HTX Çok Modlu Mikroplaka OkuyucuBioTS1LFA
CO2 inkübatörüThermo fisherHERAcell 150i
Konik tüp 15 mlSPL50015
Konik tüp 50 mlSPL50050
Corning Costar Ultra Düşük Bağlantı Parçası Çok KuyuluPlaka Sigma-AldrichCLS7007
Corning Costar Ultra Düşük Ataşman Çok KuyuluPlaka Sigma-AldrichCLS3471
Costar 50 mL Reaktif Rezervuarları, 5/Torba, SterilCostar4870
Kontes Hücre Sayma Odası SlaytlarıThermofisherC10228
Kontes II FL Otomatik Hücre Sayacıinvitrojen
EnSpire Çok Modlu OkuyucuPerkin ElmerEnspire 2300
Eppendorf Research Plus Çok Kanallı Pipet, 8 kanallıEppendorf3122000051
FlowJo yazılımıTreeStarAshland, VEYA, ABD
Keçi Anti-Fare IgG (H+L)Jackson immünolojik araştırma115-035-0621.5 mL
Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L)Jackson immünoresearch111-035-1442.0 mL
GraphPad Prism 5 GraphPadSoftwareInc., San Diego, CA, ABD
ImageJNIH
ImageQuant LAS 4000 miniFujifilmTokyo, Japonya
İnkübe edilmiş çalkalayıcıLaboratuvar arkadaşıSIF-6000R
Çoklu Ölçer Ver. 3.0,FujifilmTokyo, Japonya
Optik yoğunluk (OD)LAMBDA UV/VIS SpektrofotometreleriPerkin ElmerWaltham, MA, ABD
Faz kontrast mikroskobuOlympusTokyo, Japonya
SPL mikrosantrifüj tüpü 1.5 mLSPL60015
SPL Çok Kanallı Rezervuarlar, 12-Chs, PS, SterilSPL21012
StepOnePlus Gerçek Zamanlı PCR sistemiThermo Fisher ScientificWaltham, MA, ABD
Vibra-Cell Ultrasonik Sıvı İşlemcilerSONICS-vibra cellVC 505500 Watt ultrasonik işlemci
Vinil Anaerobik OdaCOY LAB ÜRÜNLERI
, kapsar AMQAF1000

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bron, P. A., Van Baarlen, P., Kleerebezem, M. Emerging molecular insights into the interaction between probiotics and the host intestinal mucosa. Nature Reviews Microbiology. 10 (1), 66-78 (2012).
  2. Ruiz, L., Delgado, S., Ruas-Madiedo, P., Sánchez, B., Margolles, A. Bifidobacteria and their molecular communication with the immune system. Frontiers in Microbiology. 8, 1-9 (2017).
  3. Sanders, M. E., Merenstein, D. J., Reid, G., Gibson, G. R., Rastall, R. A. Probiotics and prebiotics in intestinal health and disease: from biology to the clinic. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (10), 605-616 (2019).
  4. Pandey, K. R., Naik, S. R., Vakil, B. V. Probiotics, prebiotics and synbiotics- a review. Journal of Food Science and Technology. 52 (12), 7577-7587 (2015).
  5. Harish, K., Varghese, T. Probiotics in humans-evidence based review. Calicut Medical Journal. 4 (4), 3(2006).
  6. Routy, B., et al. The gut microbiota influences anticancer immunosurveillance and general health. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (6), 382-396 (2018).
  7. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. Most of the cell-based data-harvesting efforts that drive the integration of cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  8. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  9. Jong, B. K. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
  10. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103(2016).
  11. Anton, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: A breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Sciences. 16 (3), 5517-5527 (2015).
  12. Lee, J. E., et al. Characterization of the Anti-Cancer Activity of the Probiotic Bacterium Lactobacillus fermentum Using 2D vs. 3D Culture in Colorectal Cancer Cells. Biomolecules. 9 (10), 557(2019).
  13. Koledova, Z. 3D cell culture: An introduction. Methods in Molecular Biology. 1612, (2017).
  14. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  15. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 1-14 (2018).
  16. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  17. Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8, 2886(2018).
  18. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  19. Thirumala, S., Gimble, J., Devireddy, R. Methylcellulose Based Thermally Reversible Hydrogel System for Tissue Engineering Applications. Cells. 2 (3), 460-475 (2013).
  20. Chandrashekran, A., et al. Methylcellulose as a scaffold in the culture of liver-organoids for the potential of treating acute liver failure. Cell and Gene Therapy Insights. 4 (11), 1087-1103 (2018).
  21. Lee, W., Park, J. 3D patterned stem cell differentiation using thermo-responsive methylcellulose hydrogel molds. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  22. Fan, H., Demirci, U., Chen, P. Emerging organoid models: Leaping forward in cancer research. Journal of Hematology and Oncology. 12 (1), 1-10 (2019).
  23. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  24. Liou, C. S., et al. A Metabolic Pathway for Activation of Dietary Glucosinolates by a Human Gut Symbiont. Cell. 180 (4), 717-728 (2020).
  25. Sherwin, E., Bordenstein, S. R., Quinn, J. L., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Microbiota and the social brain. Science. 366 (6465), 2016(2019).
  26. Honda, K., Littman, D. R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).
  27. Bárcena, C., et al. Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progeroid mice. Nature Medicine. 25 (8), 1234-1242 (2019).
  28. Michalovich, D., et al. Obesity and disease severity magnify disturbed microbiome-immune interactions in asthma patients. Nature Communications. 10, 5711(2019).
  29. Ansaldo, E., et al. Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis. Science. 364 (6446), 1179-1184 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kolorektal Kanser SferoidleriLactobacillus S pernatant3B H cre K lt rH cre l m AnaliziAk SitometrisiWestern BlottingqRT PCRMetilsel loz UygulamasUltra D k TutunmaApoptozis Markerlar

İlgili makaleler