Yöntem makalesi

Histon Asetiltransferaz Inhibitörlerinin Doğrulanması için tahliller

6.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61289

⸱

6 Ağustos 2020

 , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, and UF Health Cancer Center, University of Florida College of Medicine

Bu makalede

Özet

Histon asetiltransferaz inhibitörleri (HATs, ayrıca lizin asetiltransferazolarak da bilinir), CBP/p300 gibi, kanser tedavisi için potansiyel tedavi vardır. Ancak, bu inhibitörleri doğrulamak için sıkı yöntemler gereklidir. Doğrulama için üç in vitro yöntem rekombinant asetiltransferazlar ile HAT tahlilleri dahil, hücre kültüründe histon asetilasyon için immünoblot, ve ChIP-qPCR.

Özet

Lizin asetiltransferazlar (KATs) kromatin dinamiklerini ve gen ekspresyonunu düzenlemek için histones ve diğer proteinler üzerindeki lizin kalıntılarının asetilasyonını katalizler. CBP/p300 gibi KAT'lar, çeşitli kanserlerin tümörigenezindeki kritik rollerinden dolayı terapötik hedefler olarak yoğun bir araştırma altındadır. KAT'ların histon asetiltransferaz (HAT) fonksiyonunu hedefleyen yeni küçük molekül inhibitörlerinin geliştirilmesi zordur ve potansiyel inhibitörlerin özgüllüğünü ve gücünü doğrulayabilen sağlam tahliller gerektirir.

Bu makalede, yeni HAT inhibitörleri (HATi) için titiz in vitro doğrulama sağlayan üç yöntemden oluşan bir boru hattı özetlenmiştir. Bu yöntemler arasında test tüpü HAT testi, Kromatin Hiperasetilasyon İnhibisyonu (ChHAI) testi ve Kromatin İmmünen-kantitatif PCR (ChIP-qPCR) sayılabilir. HAT testinde, rekombinant HAT'ler bir test tüpü reaksiyonunda histones ile kuluçkaya yatırılır, histon kuyruklarında spesifik lizin kalıntılarının asetilasyonuna izin verilir. Bu reaksiyon bir HATi ile engellenebilir ve bölgeye özgü histon asetilasının göreceli düzeyleri immünoblotting ile ölçülebilir. HAT satoyonunda tanımlanan inhibitörlerin hücresel ortamda doğrulanmaları gerekir.

ChHAI testi, histon deasetilaz inhibitörü (HDACi) tarafından indüklenen histones'un sağlam hiperasetilasyonunun zayıflatılan yeni HATi'yi taramak için immünolotlama kullanır. Histon asetilasyonunun bazal düzeylerini immünoblotting yoluyla tespit etmek zor olabilir, çünkü bir HDACi eklenmesi yararlıdır.

HAT ve ChHAI tahlilleri histon asetilasyonundaki küresel değişiklikleri ölçer, ancak spesifik genomik bölgelerde asetilasyon hakkında bilgi vermez. Bu nedenle, ChIP-qPCR gen düzenleyici elementlerde histon asetilasyon düzeyleri üzerinde HATi etkilerini araştırmak için kullanılır. Bu histon-DNA komplekslerinin selektif immünopresidasyon ve qPCR ile saflaştırılmış DNA analizi ile gerçekleştirilir. Birlikte, bu üç tahliller özgüllük, potens ve roman HATi eylem mekanizması dikkatli doğrulama için izin verir.

Giriş

Lizin asetiltransferazlar (KATs) hem histon hem de histon olmayan proteinler11,2,3,4lizin kalıntılarının asetilasyon katalaz. Son araştırmalar KATs ve asetiltransferaz fonksiyonu katı tümör büyümesini teşvik edebilir ortaya koymaktadır4,5,6,7,8,9. Örneğin, CREB bağlayıcı protein (CBP)/p300 kanser çok sayıda sinyal yollarını düzenleyen iki paralog KATsvardır 2,3. CBP/ p300 iyi histon asetiltransferaz karakterize var (HAT) fonksiyonu ve histon katalize 3 Lizin 27 asetilasyon (H3K27ac)2,4,5,10,11, aktif arttırıcılar için önemli bir belirteç, organizatör bölgeleri ve aktif gen transkripsiyon12,13,,14. CBP/p300, mitaşlar ve diğer transkripsiyon faktörlerinin asetilasyonu ile onkogenlerin transkripsiyonaktik tarafından katı tümörlerde pro-büyüme sinyal yolları için kritik ko-aktivatörler olarak hizmetvermektedir 4,9,15,16,17,18. Tümör ilerlemesindeki rollerinden dolayı, CBP/p300 ve diğer KAT'ler onkojenik fonksiyonlarını engelleyen yeni inhibitörlerin gelişimi için araştırma altındadır4,5,6,7,8,9,18,19,,20. A-485 ve GNE-049 CBP/p3004için güçlü ve spesifik inhibitörleri geliştirmek için iki başarılı girişimleri temsil,9. Ek inhibitörleri şu anda CBP/p300 ve diğer KATs için soruşturma altındadır.

Daha önce açıklanan KAT inhibitörlerinin (KATi) kalitesi sorgulanıyor, birçok inhibitör hedef etkileri ve kötü karakterizasyonu gösteren21. Bu nedenle, yeni ilaç adaylarının titiz karakterizasyonu ve doğrulanması yüksek kaliteli kimyasal probların geliştirilmesi için gereklidir. Burada özetlenen tarama için bir boru hattı oluşturan ve titizlikle potens ve yeni KATi özgüllüğü doğrulayan üç protokolleri, HAT fonksiyonu inhibe belirli bir odak ile (HATi) KATs. CBP/p300 ve inhibitörleri örnek olarak kullanılır, ancak bu protokoller HATfonksiyonu7 olan diğer KAT'lar için uyarlanabilir.

İlk protokol, kontrollü test tüpü reaksiyonunda saflaştırılmış rekombinant p300 ve histones kullanan in vitro histone asetilea (HAT) testidir. Bu testi gerçekleştirmek kolaydır, maliyet-etkindir, bileşikleri düşük iş ortamında taramak için kullanılabilir ve radyoaktif maddeler gerektirmez. Bu protokolde, rekombinant p300 kısa bir kuluçka döneminde histon kuyruklarında lizin asetilasyonunu katalizler ve histon asetilasyon düzeyleri standart immünoblotlama prosedürleri kullanılarak ölçülür. Enzimatik reaksiyon histon asetilasyonu azaltan bileşikleri taramak için CBP/p300 inhibitörlerinin varlığında veya yokluğunda gerçekleştirilebilir. Ayrıca, HAT tsay yeni bileşikler CBP / p300 için seçici olup olmadığını doğrulamak için pcaf gibi diğer saflaştırılmış KATs karşı faaliyetlerini değerlendirerek kullanılabilir. HAT tsay, basitliği, düşük maliyeti ve bir inhibitörün gücünü/seçiciliğini belirleme yeteneği nedeniyle yeni inhibitörleri araştırmak için mükemmel bir başlangıç noktasıdır. Nitekim, bu protokol genellikle bir in vitro ekran5,,10olarak literatürde kullanılır. Ancak, HAT testinde tanımlanan inhibitörler hücre kültüründe her zaman etkili değildir, çünkü bir test tüpü reaksiyonu yaşayan bir hücre sisteminden çok daha basittir. Bu nedenle, hücre kültürü deneylerinde inhibitörleri daha fazla karakterize etmek esastır22,23.

Boru hattındaki ikinci protokol Kromatin Hiperasetilasyon İnhibisyonu (ChHAI) tetkiktir. Bu hücre bazlı test histon deasetilaz inhibitörleri kullanır (HDACi) bir HATi ile co-kuluçka önce kromatin histones hiperacetylate bir araç olarak24. Bazal histon asetilasyon hücre kültüründe düşük olabilir, zor asetilasyonu artırmak için bir HDACi eklenmesi olmadan immünoblotting yoluyla probe yapmak. ChHAI tsay amacı HDAC inhibisyonu neden histon asetilasyon artışı zayıflatmak yeni HATi belirlemektir. Bu testin avantajları düşük maliyet, göreceli performans kolaylığı ve test tüpü HAT testi daha fizyolojik alaka sağlar kültür, hücrelerin kullanımı içerir. HAT testindeki benzer şekilde, bu protokol veri toplama için standart immünoblotlama kullanır.

HAT ve ChHAI tahlilleri, küresel histon asetilasyonu inhibe etmek için yeni bileşiklerin potens hakkında veri sağlamak, ancak bu bileşiklerin belirli genomik bölgelerde modifikasyonları nasıl etkilediği hakkında fikir vermez. Bu nedenle son protokol olan Chromatin İmmünopan-nicel Polimeraz Zincir Reaksiyonu (ChIP-qPCR) genomun belirli bölgelerindeki DNA-protein etkileşimlerini araştıran bir hücre kültürü deneyidir. ChIP protokolünde, kromatin DNA-protein etkileşimlerini korumak için çapraz bağlanır. Kromatin daha sonra hücrelerden çıkarılır ve DNA-protein kompleksi ilgi proteini için selektif immünoprebata uğrar (örn. H3K27ac'a özgü bir antikor kullanılır). DNA daha sonra saflaştırılır ve qPCR kullanılarak analiz edilir. Örneğin, ChIP-qPCR yeni bir HATi'nin siklin D125gibi bireysel onkojenlerde histon asetiyonu aşağı yasedip düzenlemedığını belirlemek için kullanılabilir. ChIP-qPCR alanında kullanılan yaygın bir teknik olmakla birlikte,4,10,,26optimize etmek zor olabilir. Bu protokol, ChIP-qPCR yordamını gerçekleştirirken oluşabilecek olası tuzakları önlemek için ipuçları sağlar ve veriler üzerinde gerçekleştirilmesi gereken kalite kontrol denetimleri içerir.

Birlikte kullanıldığında, bu üç protokol leri sıkı karakterizasyonu ve roman HATi doğrulama sağlar. Ayrıca, bu yöntemler gerçekleştirmek kolay, nispeten ucuz ve küresel yanı sıra bölgesel histon asetilasyon veri sağlamak, çünkü birçok avantaj sunuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. In vitro HAT istif

  1. Arabellek hazırlığı
    NOT: Tampon tarifleri için Tablo 1'e bakınız.
    1. 5x teşbi arabellek ve 6x Sodyum Dodecyl Sülfat (SDS) hazırlayın ve -20 °C'de saklayın. Aliquot SDS 1 mL aliquots içinde.
    2. 10x SDS jel çalışan tampon ve 10x TBST hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın.
    3. 1x transfer tamponu hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
      DİkKAT: Bu protokolde kullanılan tüm kimyasallar için güvenlik veri sayfasını kontrol edin. SDS, DTT ve bromofenol mavisi toksiktir ve yutulmamalı, solunmamalı veya deriye veya gözlere maruz kalmamalıdır. Doğru işleme prosedürleri için lütfen güvenlik veri sayfasına bakın. Lütfen tehlikeli kimyasallarla başa çıkmak için kimyasal bir duman başlığı kullanın.
  2. HAT tepkisi
    NOT: Anakardik asit bilinen bir p300 inhibitörü3'tur ve HAT analizinin yeni p300 inhibitörlerini nasıl tanımlayabileceğini göstermek için örnek olarak kullanılır. 1.2.1 adım şeması için Ek Protokol (Şematik 1)bölümüne bakın.
    1. 0,2 mL PCR tüpte aşağıdaki enzimatik reaksiyonu hazırlayın: 2 μL 5x teşrif arabellek, 1 μL saflaştırılmış p300 (0,19 μg/μL), 1 μL anakardik asit (HATi) veya DMSO kontrolü 1x teşrafa ile seyreltilmiş ve 2 μL otoklavd ddH2O. Pre-incubate karışımı 10 min sıcaklıkta bu karışımı. Daha sonra reaksiyona 3 μL 100 μM Asetil-CoA ve 1 μL saflaştırılmış H3.1 (0.2 g/μL) ekleyin.
    2. Tam reaksiyon karışımını 30 °C'de pcr termal döngüde 1 saat inkübedin.
    3. 6x SDS örnek tamponuna 1:10 oranında 2-mercaptoetanol ekleyin.
    4. PCR termal döngücüden numuneleri çıkarın ve reaksiyon karışımına 2 μL 6x SDS (2-mercaptoetanol eklendi) ekleyin.
      DİkKAT: 2-mercaptoetanol toksiktir ve kimyasal bir duman kaputu içinde kullanılmalıdır. Doğru kullanım için lütfen güvenlik veri sayfasına bakın.
    5. Isı örnekleri 95 °C'de bir ısı bloğunda 5 dakika boyunca ve buz üzerinde soğutun. Numuneleri -20 veya -80 °C'de saklayın veya jel elektroforezi ve immünoblotlamayı aşağıda ayrıntılı olarak açıklanız.
  3. Jel elektroforez ve immünolot
    NOT: Jel elektroforezi ve immünoblotting için bu standart27 prosedür eğitimi 1.3.1-1.3.17 adlarının nasıl yapılacağına ilişkin ayrıntılı bilgi için bakın. Ek bilgi burada bulunabilir28,29,30,31,,32,33.
    1. Pipet 10 μL numuneler (adım 1.2.5.) bir 4-20% degrade poliakrilamid jel kuyuları içine. Pipet 5 μL protein merdiveni olarak kuyulardan birine moleküler ağırlık referansı olarak. Jel tankı kullanarak jeli 90 dk için 120 V'de çalıştırın.
    2. Jeli bir transfer tankı kullanarak 70 dk için 100 V'de polivinilidendiride (PVDF) membrana aktarın.
    3. Membranı transfer cihazından çıkarın ve plastik bir kapiçine yerleştirin. Konteynere 1x TBST (%5 süt içeren) ekleyerek membranı kesin ve oda sıcaklığında 1 saat hafifçe sallayın.
    4. 1x TBST adım 1.3.3 kaldırın. Membranı bir gecede seçilen bölgeye özgü asetil antikorları (örneğin, H3K18ac veya H3K27ac primer antikorlar 1x TBST'de %5 süt içeren 1:5.000 seyreltme) ilave edin.
    5. Birincil antikor solüsyonu çıkarın. Membranı oda sıcaklığında 1x TBST (süt yok) ile 15 dakika boyunca hafifçe sallayarak yıkayın.
    6. 1x TBST 1:20.000 ikincil antikor seyreltin (% 5 süt içeren) ve hafif sallayarak oda sıcaklığında 1 saat için membran kuluçka.
    7. İkincil antikor solüsyonu çıkarın. Membranı oda sıcaklığında 1x TBST (süt yok) ile 15 dakika boyunca hafifçe sallayarak yıkayın.
    8. Membrandan 1x TBST drenaj. HRP substrat peroksit çözeltisi ve HRP substrat luminol çözeltisini 1:1 oranında (her biri 1 mL) ve kombine çözeltinin 2 mL'sini membran yüzeyine karıştırın.
    9. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca membran ile çözelti kuluçka.
    10. Membrandan fazla kemilüminesan substratı kağıt havluya boşaltın ve membranı x-ray kaset tutucunun içine plastik şal içine yerleştirin.
    11. X-Ray film işleme adanmış karanlık bir odaya taşıyın. Filmi membranın üzerine yerleştirerek ve kaseti 30 s'ye kapatarak membranı bir x-Ray filmine maruz bırakın.
      NOT: Film ile membran arasındaki temas süresi deneysel olarak belirlenmelidir. Güçlü sinyaller kısa pozlama (saniye) ve zayıf sinyaller daha uzun pozlama gerekebilir gerekir.
    12. X-Ray filmini kasetten çıkarın ve bir x-ray film işlemcisi üzerinden çalıştırarak filmi işlayın. X-Ray filminin nasıl işlenir?
    13. Membranı plastik sargıdan çıkarın ve hafif sallayarak oda sıcaklığında 5 dk boyunca ddH2O ile yıkayın.
    14. Membranı 0,2 M NaOH ile 5 dakika oda sıcaklığında hafif çesitli titreyerek kuluçkaya yatırın.
    15. Membranı ddH2O ile 5 dk oda sıcaklığında hafif çesitli titreyerek yıkayın.
    16. Konteynere 1x TBST (%5 süt içeren) ekleyerek membranı kesin ve oda sıcaklığında 1 saat hafifçe sallayın.
    17. Bir sonraki birincil antikor seyreltmesini (örneğin, kullanılan ilk antikor H3K18ac ise H3K27ac için prob) ekleyin ve 4 °C'de bir gecede sallayın. Tüm antikor probları tamamlanana kadar 1.3.4-1.3.17 adımlarını tekrarlayın.

2. ChHAI teşp

  1. In vitro ilaç tedavileri ve asetitli histones analizi
    NOT: A-485 güçlü ve iyi karakterize p300 HATi2,4 . Bu inhibitör, hücre kültüründeki etkinliği ve özgüllüğü nedeniyle kalan tahlillerde kullanılacaktır. MS-275 (Entinostat)24 histon asetilasyon düzeylerini belirgin bir şekilde artıran ve standart immünoblotlama ile asetilasyon problarının daha kolay saptanmasını kolaylaştırmak için kullanılan bir HDACi'dir. Bkz. Ek Protokol (Şematik 2) 2.1. adımda kullanılan ilaç seyreltmelerinin şeması için.
    1. Tohum 100.000 MCF-7 hücreleri 12 iyi plaka ve hücrelerin hücre kültürü orta 1 mL içinde% 80-90 biraraya büyümeye izin verir. Aşağıdaki deneysel tasarım için kuyuları işaretleyin: iyi 1: DMSO kontrolü (referans noktası); iyi 2: A-485 (3 μM); iyi 3: A-485 (10 μM); iyi 4: MS-275 (3 μM); iyi 5: MS-275 (3 μM) + A-485 (3 μM); iyi 6: MS-275 (3 μM) + A-485 (10 μM).
      NOT: MCF-7 hücrelerinin kültüre atımı için tam DMEM ortamı kullanın ve hücrelerin %5 CO2ile 37 °C'de büyümesine izin verin. Komple DMEM tarifi için Tablo 1'e bakın.
    2. Tohumlamadan sonra 24 saat, pipet 4 mL tam DMEM media steril 15 mL konik tüp. Pipet 2 μL MS-275 (DMSO'da 6 mM) ile 4 mL orta son konsantrasyon için 3 μM MS-275.
    3. Pipet 2 μL DMSO ile 4 mL orta ayrı steril 15 mL konik tüp.
      DMSO'nun doğru şekilde işlenmesi için lütfen güvenlik veri sayfasını kontrol edin. Bazı eldiven tipleri DMSO kullanımı için derecelendirilmez.
    4. Hücre kültürünü her kuyuya orta (adım 2.1.2) halinde 3 μM MS-275 kuyularından 4-6 ve pipet 1 mL'den aspire edin. Kullanılmayan seyreltilmiş MS-275 atın.
    5. Hücre kültürünü her kuyuya seyreltilmiş DMSO'nun 1-3 ve pipet 1 mL'sinden (adım 2.1.3) aspire edin. Kullanılmayan seyreltilmiş DMSO atın.
    6. MS-275'e maruz kalan hücrelerde asetitli histones birikimine izin vermek için hücreleri kuvöze ve kuluçkaya yatırın 4 saat (kuyu lar 4-6).
      NOT: MS-275 bir HDACi ve histon hiperasetilasyon neden olur24. Bu 4 saat ön kuluçka MS-275 a-485 eklenmesinden önce hiperasetilasyon indüklemek için izin vermek için gereklidir, hangi histon asetilasyon azaltır2,4.
    7. MS-275 ile 4 saat kuluçkadan sonra, aşağıdaki seyreltmeleri ayrı steril 1,5 mL tüplerde pipetleme ile hazırlayın: 1.0 μL DMSO ila 1 mL DMEM ortam; 0,5 μL DMSO ve 0,5 μL A-485 (6 mM) ila 1 mL DMEM ortam; 0,5 μL DMSO ve 0,5 μL A-485 (20 mM) ila 1 mL DMEM ortam; 0,5 μL DMSO ve 0,5 μL MS-275 (6 mM) ila 1 mL DMEM ortam; 0,5 μL A-485 (6 mM) ve 0,5 μL MS-275 (6 mM) ila 1 mL DMEM ortam; 0,5 μL A-485 (20 mM) ve 0,5 μL MS-275 (6 mM) ila 1 mL DMEM ortam.
    8. Hücre kültürünün ortasını kuyulardan 1-6 ve pipet 1 mL seyreltme 1'den 1'e, seyreltme 2'den 1'e, seyreltme 3'ten iyi ye 3'e, seyreltme 4'ten iyiye 4, seyreltme 5'ten iyi 5'e ve seyreltme 6'dan iyi 6'ya aspire edin.
      NOT: Genel bir kural, hücresel toksisite ve çoğalma değişikliklerini önlemek için hücre kültüründe %0,1 DMSO içeriğini geçmemek ve dmso (çözücü) içeriğini deneysel gruplar arasında dengelemektir.
    9. Hücreleri 20 saat boyunca kuvöze ve kültüre geri döndürün.
    10. 20 saat sonra hücre kültürünü 1-6 kuyudan aspire edin.
    11. 1-6 kuyuya 1 mL PBS boru tutarak hücreleri yıkayın. PBS'yi aspire edin.
    12. 1-6 kuyularına 100 μL 1x pasif lisis tamponu ekleyin (tablo 1'ebakınız). Hücrelerin dondurulması-çözülmesi ve pilisi için hücre kültür plakası (pasif lisis tamponunda örneklerle) bir gecede −80 °C'de saklayın.
      DİkKAT: Tampon yapmadan önce lütfen tüm kimyasallar için güvenlik veri sayfasını kontrol edin. CDTA ciddi göz hasarı ve tahrişe neden olabilir.
    13. 10 dakika boyunca hafif sallayarak oda sıcaklığında eritme örnekleri. Örnekleri 1,5 mL'lik tüpleri ayırın ve hemen buza yerleştirin.
    14. Her numunenin protein konsantrasyonu ölçün. Protein konsantrasyonu birkaç köklü protokoller kullanılarak belirlenebilir34.
    15. Protein konsantrasyonu 1-6 (eşit hacimde) 1x pasif lisis tamponu kullanarak seyreltmek için, gerektiğinde protein konsantrasyonu dengeleyin.
    16. 6x SDS örnek tampon 1:10 oranında 2-mercaptoethanol ekleyin.
    17. 1-6 numunelere 2-mercaptoetanollü 6x SDS numune tamponu ekleyin ve 1x SDS numune tamponunun son konsantrasyonuna ekleyin.
    18. Isı örnekleri 95 °C'de bir ısı bloğunda 5 dakika boyunca ve buz üzerinde soğutun. Numuneler -20 °C veya -80 °C'de 2.1.19 adıma kadar saklanabilir.
    19. Pipet, %4-20 degrade liakrilamid jelde kuyulara 1-6 numune için 30 μg protein içeren bir hacimdir. Protokol 1'de açıklanan protokole göre immünolotlama işlemini gerçekleştirin.

3. ChIP-qPCR

NOT: Aşağıdaki protokol p300 inhibitörleri için örnek olarak açıklanmıştır.

  1. Arabellek hazırlığı
    NOT: Tampon tarifleri için Tablo 1'e bakınız. ChIP protokolünün genel adımları (örn. tampon tarifleri, yıkama süreleri ve santrifüj süreleri) aşağıdaki modifiye edilip, üreticinin ticari olarak kullanılabilen bir kitin tavsiyelerinden (bkz. Malzeme Tablosu)veliteratürden 35,36.
    1. ChIP seyreltme tamponu, çekirdek şişme tamponu, düşük tuz yıkama tamponu, yüksek tuz yıkama tamponu, LiCl yıkama tamponu ve TE tamponunu hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
    2. Hazırlamak SDS lysis tampon, 10x glisin tampon ve ChIP elüsasyon tampon. Oda sıcaklığında saklayın.
      DİkKAT: Doğru kullanım sağlamak için tampon yapmadan önce lütfen tüm kimyasallar için güvenlik veri sayfasını kontrol edin.
  2. İlaç tedavisi
    NOT: 3.2. adımda kullanılan ilaç seyreltmelerinin şeması için Ek Protokol (Şematik 3)bölümüne bakınız.
    1. İki 15 cm kültür tabaklarında TOHUM MCF-7 hücreleri ve tam DMEM orta 12 mL% 90 biraraya hücreleri büyümek. Aşağıdaki deneysel tasarım için yemekleri işaretleyin: Çanak 1: DMSO kontrolü (referans noktası); Çanak 2: A-485 (3 μm).
      NOT: MCF-7 hücrelerinin kültüre atımı için komple DMEM ortamı kullanın ve %5 CO2ile 37 °C'de büyüyün. Komple DMEM tarifi için Tablo 1'e bakın.
    2. Steril 15 mL konik boruda, pipet 12 mL DMEM media ve pipet 6 μL DMSO. İyi bir şekilde karıştırın.
    3. Ayrı bir steril 15 mL konik tüpte, 3 μM A-485'lik son konsantrasyonu elde etmek için 12 mL DMEM ortam ve 6 μL A-485 (DMSO'da 6 mM) pipet. İyi bir şekilde karıştırın.
    4. Çanak 1 ve 2'den medyayı aspire edin.
    5. DMEM'deki seyreltilmiş DMSO'nun 12 mL'sini (adım 3.2.2.) Çanak 1'e ekleyin.
    6. DMEM'deki 3 μM A-485'in 12 mL'sini (adım 3.2.3.) Çanak 2'ye ekleyin.
    7. Hücre kültürü yemeklerini 24 saat boyunca kuvöze ve kuluçkaya yatırın.
  3. Hücre fiksasyonu
    1. Pipet 330 μL (mL başına 27,5 μL) tam ortama % 37 formaldehit ve yavaşça karıştırmak için plaka girdap.
      DİkKAT: Formaldehit toksiktir. Doğru işleme prosedürleri için lütfen güvenlik veri sayfasına bakın.
    2. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka.
    3. Pipet 2 mL 10x glisin plaka ve karıştırmak için girdap.
    4. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka.
    5. Kuluçkadan sonra, buz üzerine tabakyerleştirin ve proteaz inhibitörü kokteyl bir aliquot çözültün.
    6. Adım 3.1'de hazırlanan tamponları kullanarak hem DMSO hem de A-485 numuneleri için aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
      1. Proteaz inhibitörü kokteylinin 1:1.000 seyreltilmesi ile 2 mL PBS
      2. Proteaz inhibitörü kokteylinin 1:1.000 seyreltilmesi ile 1 mL çekirdek şişme tamponu
      3. Proteaz inhibitörü kokteylinin 1:1.000 seyreltilmesi ile 0,5 mL SDS lysis tampon
    7. Hücre kültürü tabaklarından medyayı aspire edin ve hücreleri 15 mL soğuk PBS ile iki kez yıkayın.
    8. Pilette 2 mL PBS proteaz inhibitörü kokteyli (adım 3.3.6.1) ile hücre kültürü yemekleri. Hücreleri bir hücre kazıyıcı kullanarak çözeltiye kaldırın.
    9. Hücre süspansiyonuna mikrosantrifüj tüpü aktarın. Gerekirse ek PBS ile kalan hücreleri toplayın.
    10. Hücreleri peletlemek için 5 dakika boyunca 4 °C'de 800 x g'de dönme tüpleri.
    11. Proteaz inhibitörü kokteyli (adım 3.3.6.2) ile çekirdeklerin şişme tamponunun süpernatant ve pipet 1 mL'sini pelete aspire edin. Pelet işarj edin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
    12. Tüpleri 2.700 x g 4 °C'de 5 dk ve pelet çekirdekleri için santrifüj edin.
    13. SDS lysis tamponunun süpernatant ve pipet0.5 mL'ini proteaz inhibitörü kokteyli (adım 3.3.6.3) ile pelete aspire edin. Pelet işarj edin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
    14. Kromatin örneklerini -80 °C'de 3.4.1 adıma kadar saklayın veya hemen 3.4 adıma geçin.
  4. DNA sonication
    1. DMSO örneğinden (adım 3.3.14) 130 μL kromatini bir pipet (her biri 130 μL) kullanarak iki DNA sonication tüpüne aktarın.
    2. A-485 örneğinden (adım 3.3.14) 130 μL kromatini pipet (her biri 130 μL) kullanarak iki DNA sonication tüpüne aktarın.
    3. Aşağıdaki sonicator ayarlarını kullanarak DNA'yı kabaca 150-200 baz çifti parçalarına sonikle bakın: 175'lik Peak Incident Power (W), %10'luk Görev Faktörü, Patlama başına 200 Döngü ve 430's tedavi süresi.
      NOT: Sonication ayarları modelleri arasında farklılık gösterebilir ve ayarları farklı hücre hatları için uygun parça boyutu elde etmek için ayarlanması gerekebilir.
    4. Sonication sonra buz üzerinde örnekleri tutun.
    5. Sonicated kromatini 1,5 mL'lik bir tüpe pipet ve santrifüj kullanarak 10.000 x g'de 4 °C'de 10 dk için pelet enkazına aktarın.
    6. Pipet supernatant (sonicated kromatin içerir) yeni bir tüp ve enkaz atın. Sonicated kromatin -80 °C'de saklanabilir.
  5. Kromatin immünopresipite (ChIP)
    NOT: Adım 3.5'teki IP gruplarının şeması için Ek Protokol (Şematik 3)bölümüne bakın.
    1. Adım 3.4.6'dan DMSO ve A-485 örnekleri için sonicated kromatin protein içeriğini ölçün. Protein içeriği köklü protokoller kullanılarak ölçülebilir34.
      NOT: Basitlik için bu protokol protein içeriğinin eşit olduğunu varsayacak ve 100 μL sonicated kromatin kullanılacaktır. Aksi takdirde, protein içeriği eşit hacimde tüm numuneler arasında dengelenebilir gerekir.
    2. Pipet 100 μL DMSO sonicated kromatin iki 1,5 mL tüpler (100 μL her). Toplam hacmi 500 μL'ye kadar çıkarmak için her tüpe ChIP seyreltme tamponunun (1:1.000 seyreltme içeren) pipet 400 μL'si.
    3. Pipet 100 μL A-485 sonicated kromatin iki 1,5 mL tüpler (100 μL her). Pipette 400 μL ChIP seyreltme tamponu (proteaz inhibitörü kokteylinin 1:1000 seyreltilmesini içeren) her tüpe toplam hacmi 500°L'ye kadar getirin. Çözeltinin 5 μL'ini tüplerden çıkarın ve -20 °C'de A-485 Girişi olarak saklayın.
    4. Bir pipet kullanarak, DMSO ve A-485 örnekleri için ilgili tüplere immünopresipitasyon (IP) antikor (örn. spesifik olmayan IgG kontrolü veya H3K27ac spesifik antikor) ekleyin: IGG antikorlu IP #1 DMSO kromatini (5-10 μg); IP #2 H3K27ac antikorlu DMSO kromatin (5-10 μg); IP #3 IgG antikorlu A-485 kromatin (5-10 μg); IP #4 H3K27ac antikorlu A-485 kromatin (5-10 μg).
    5. Her tüpe 20 μL protein ekleyin Bir manyetik boncuk ekleyin. Boncukların tekrar askıya alındıklarının iyi bir şekilde askıya alınmasından emin olun.
    6. Numuneleri bir gecede 4 °C'de döndürün.
    7. Pelet protein Manyetik ayırıcı kullanarak manyetik boncuklar ve supernatant kaldırın. Boncukları rahatsız etmeyin.
    8. Boncukları 500 μL ile 1 mL arasında düşük tuz yıkama tamponu ile yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika döndürün. Hızlı bir dönüş yapın, manyetik ayırıcı kullanarak boncukpelet ve supernatant kaldırın.
    9. Boncukları 500 μL ile 1 mL arasında yüksek tuz yıkama tamponu ile yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika döndürün. Hızlı bir dönüş yapın, manyetik ayırıcı kullanarak boncukpelet ve supernatant kaldırın.
    10. Boncukları 500 μL ile 1 mL arasında LiCl yıkama tamponu ile yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika döndürün. Hızlı bir dönüş yapın, manyetik ayırıcı kullanarak boncukpelet ve supernatant kaldırın.
    11. Boncukları 500 μL ile 1 mL TE tamponu ile yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika döndürün. Hızlı bir dönüş yapın. Adım 3.5.14 kadar TE tampon boncuk tutun.
    12. Giriş örneklerini (adım 3.5.2 ve 3.5.3)'den) dondurucudan çıkarın ve buzda tutun.
    13. Proteinaz K'nin bir aliquot'unu erit.
    14. Manyetik ayırıcı kullanarak boncukları peletve boncuklardan TE tamponu çıkarın (adım 3.5.11).
    15. Giriş örnekleri de dahil olmak üzere her numuneye 100 μL ChIP elüsyon tamponu + 1 μL Proteinaz K ekleyin. Bir termocycler kullanarak 2 saat için 62 °C'de sallayarak inküter örnekleri.
    16. 2 saat sonra, ısı örnekleri 95 °C için 10 dakika bir termocycler kullanarak.
    17. Örnekleri oda sıcaklığına kadar soğutun.
    18. Manyetik ayırıcı kullanarak pelet manyetik boncuklar ve transfer supernatant (ilgi DNA içerir) yeni bir 1.5 mL tüp.
    19. Standart bir PCR temizleme kiti kullanarak DNA'yı arındırın.
    20. Saflaştırılmış DNA -20 °C'de saklanabilir ve standart qPCR protokollerinde şablon olarak kullanılabilir. QPCR çalıştırmak için üretici protokollerini izleyin.
  6. ChIP-qPCR veri analizi
    NOT: ChIP-qPCR sonuçlarını analiz etmek için iki yaygın yöntem IgG antikor ve% 1 Giriş yöntemi üzerinde kat zenginleştirme vardır. Her iki analiz yöntemleri için mükemmel bir şablon hızlı bir şekilde her IP antikor / faiz hedef37için kat zenginleştirme hesaplamak için ticari bir kaynak tarafından sağlanmaktadır.
    1. Kat zenginleştirme ve % Girişi hesaplamak için, analiz şablonundaki ilgili bölgeye her bir antikor (spesifik olmayan IgG, IP H3K27ac antikor ve %1 Giriş) için elde edilen qPCR verilerinden ΔCt değerlerini kopyalayıp yapıştırın ve Kat Zenginleştirme ve Verim % Girdiotomatik olarak doldurulacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

In vitro histon asetiltransferaz (HAT) tsuraj ı, p300 HAT aktivitesini histon substrata doğru inhibe eden bileşikleriçin prob için kullanılabilir. Şekil 1A, HAT tsurciçin deneysel bir şema sağlar. Anakardik asit, bilinen BIR HATi3,38, 12.5-100 μM arasında bir konsantrasyon aralığında bu titretinde kullanılmıştır. 100 μM'de, anakardik asit histon 3, Lizinler 9 ve 18'de histon asetilasyonunu katalize eder (Şekil 1B...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Lizin asetiltransferazlar (KATs) histon kuyrukları ve transkripsiyon faktörleri gen transkripsiyondüzenlemekiçin çeşitli lizin kalıntıları asetit 2,3. Son yirmi yılda yapılan çalışmalar, CBP/p300, PCAF ve GCN5 gibi KAT'ların onkojenik transkripsiyon faktörleri ile etkileşime girdiği ve çeşitli solid tümör tiplerinde tümör büyümesini artırmaya yardımcı olduğunu ortaya koymuştur4,5,9...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların çıkar çatışması ya da açıklama yapmaları gerekmez.

Teşekkürler

Bu çalışma James ve Esther King Biyomedikal Araştırma Programı (6JK03 ve 20K07) ve Bankhead-Coley Kanser Araştırma Programı (4BF02 ve 6BC03), Florida Sağlık Bakanlığı, Florida Meme Kanseri Vakfı ve UF Sağlık Kanser Merkezi hibe tarafından desteklenmiştir. Ayrıca, dr Zachary Osking ve Dr Andrea Lin yayın sürecinde destek için teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,5 ml tüpFisher Scientific05-408-129Tüm yöntemler için
10 cm'lik çanakSarstedt AG & Co.83.3902MCF-7 hücrelerinin hücre kültürü için
10 ul ucuFisher Scientific02-707-454Tüm Yöntemler için
1000 ul ucuCorning4846Tüm Yöntemler için
10X Glisin tamponuYöntem 3 için. Tarif için Tablo 1'e bakın.
10X Çalışan Arabellek. Tarif için Tablo 1'e bakın.
10X TBST. Tarif için Tablo 1'e bakın.
12 oyuklu plakaCorning3513Yöntem 2 için
15 cm çanakSarstedt AG & Co.83.3903Yöntem 3 için
15 ml konik tüpSanta Cruz Biyoteknolojisc-200249Yöntem 2 ve 3 için
, %5 süt ve %0.02 Sodyum Azid, Yöntem 1 ve 2 için. Birden fazla kullanılacak primer antikorları seyreltmek için kullanılabilir. Primer antikor dilüsyonlarının kısa süreli depolanmasına izin verir. İkincil antikor seyreltmesi için kullanmayın. DİKKAT: Sodyum Azid toksiktir.
% 5 süt. PVDF membranını bloke etmek ve antikor dilatasyonları için kullanılır. Tarif için Tablo 1'e bakın.
Yöntemler için200 ul ipucuCorning4844
SDS numune tamponu hazırlama için2-merkaptoetanolSigma-AldrichM3148
%4-20 poliakrilamid jelYöntem 1 ve 2 içinInvitrogenXP04205BOX
5X Test tamponuYöntem 1 için. Tarif için Tablo 1'e bakın.
5X Pasif lizis tamponu. Tarif için Tablo 1'e bakın.
6X Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)Yöntem 1 ve 2 için. Tarif için Tablo 1'e bakın.
A-485MedChemExpressHY-107455CBP/p300 İnhibitör. DMSO'da çözüldü.
Asetil-CBP(K1535)/p300(K1499) antikoru HücreSinyalizasyon Teknolojisi4771Yöntem 1 için
Asetil-CoASigma-AldrichA20561'de kullanım için
Asetil-Histon H3 (Lys 27) antikoru (H3K27ac)Hücre Sinyalleme TeknolojisiCST 8173immünoblotlar ve ChIP için H3K27ac için antoikorlar
Asetil-Histon H3 (Lys18) antikoru (H3K18ac)Hücre Sinyalleme Teknolojisiİmmünoblotlar için H3K18ac içinCST 9675
alfa tubulin antikoruMillipore SigmaT5168. Seyreltin 1: 20.000
Anakardik asitCayman Chemical13144Yöntem 1
için anti-fare IgG HRP bağlantılı ikincil antikorHücre Sinyalleme Teknolojisi7076Yöntem 1 ve 2 için. Yöntem 1 ve 2 için 1: 10.000
anti-tavşan IgG ikincil antikoruJackson ImmunoResearch711-035-152'yiseyreltin. 1:10.000 ila 1:20.000 arasında seyreltin
Otoradyografi filmiMIDSCIBX810Yöntem 1 ve 2 için
Oryantal Dansçı Döner PlatformStovall Life Science Incorporatedmevcut değilYöntem 1 ve 2 için
Sığır Buzağı Serumu (BCS)HyCloneSH30072.03hücre kültürü ortamı
Sığır Serumu Albümini (BSA)Sigma-AldrichA2153tampon hazırlama için
SDS numune tamponu hazırlama içinBromofenol BlueSigma-AldrichB0126
CDTASpectrum Chemical125572-95-4Tampon hazırlama için
hücre sıyırıcıMillipore SigmaCLS3010Yöntem 3 için
ChIP seyreltme tamponu. Tarif için Tablo 1'e bakın.
ChIP Elüsyon Tamponu. Tarif için Tablo 1'e bakın.
MCF-7 Hücreleriiçin Komple DMEM. Tarif için Tablo 1'e bakın.
Covaris 130 ve mikro; l microTUBECovaris520045Yöntem 3'te Covaris S220 ile kullanım için Sonikasyon tüpü
Covaris S220 Odaklanmış ultrasonicatorCovarisS220DNA sonikatörü Yöntem 3'te kullanım için
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-Aldrich41639ilaç seyreltme ve araç kontrol tedavisi için
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815 hazırlık
DMEMCorning10-013-CVhücre kültürü ortamı
Tampon hazırlama içinEDTAFisher ScientificBP120-1
Örnek transfer tankı ve transfer aparatıBio-rad1704070Yöntem 1 ve 2 için
EZ-Magna ChIP A/G Kromatin İmmünopresipitasyon KitiMillipore Sigma17-10086Yöntem 3
için FK228 ( Romidepsin)Cayman Chemical128517-07-7Yöntem 2'de kullanım için HDAC İnhibitörü
Formaldehit çözeltisiHücre fiksasyonu içinSigma-AldrichF8775
gliserolFisher ScientificBP229-1Tampon hazırlama için
glisinSigma-AldrichG7126tampon hazırlama için
HEPESSigma-Aldrich54457 tampon hazırlama
Yöntem 3yüksek tuz yıkama tamponu
IGEPAL (NP-40)Sigma-AldrichI3021hazırlama için
Immobilon Kemilüminesan HRP SubstratMillipore SigmaWBKLS0500Yöntem 1 ve 2
için KClFisher ScientificBP366-500
LiClSigma-AldrichL9650Tampon hazırlama için
LiCl yıkama tamponuYöntem 3 için. Tarif için Tablo 1'e bakın.
düşük tuz yıkama tamponu. Tarif için Tablo 1'e bakın.
Manyetik AyırıcıPromegaZ5341Yöntem 3'te kullanım için
MetanolSigma-Aldrich494437Tampon hazırlama için
Mini jel tankıInvitrogenA25977Yöntem 1 ve 2 için
MS-275 (Entinostat)Cayman Chemical209783-80-2HDAC İnhibitörü Yöntem 2'de kullanım için. DMSO'da çözüldü.
Tampon hazırlama içinNaClFisher Scientific7647-14-5
Yöntem 1 ve 2'de tampon hazırlama içinNaOHFisher ScientificS318-100
Normal Tavşan IgGBethyl LaboratuvarlarıP120-101Yöntem 3'te kullanım için tavşan antikorunu kontrol
şişme tamponuYöntem 3 için. Tarif için Tablo 1'e bakın.
PCR Temizleme KitiQiagen28104Yöntem 3'te kullanım için
Penisilin / Streptomisin 100XCorning30-002-CIhücre kültürü ortamı
Fosfat tamponlu salin (PBS)Corning21-040-CVYöntem 2 ve 3
için BORULARSigma-Aldrich80635tampon hazırlama
için süt tozuNestle Karanfil Yöntem 1 ve 2
Western blot transferi için Power Pac 200Yöntem 1 ve 2 içinBio-rad
SDS jel çalışması için Power Pac 3000Bio-radYöntem 1 ve 2 için
Önceden Boyanmış Protein MerdiveniThermo Fisher26616Yöntem 1 ve 2 için
Proteaz İnhibitörü KokteylSigma-AldrichPI8340Yöntem 3
Protein A'da kullanım için Macentik BoncuklarNew England BioLabsS1425SYöntem 3 Proteinaz K'de kullanım için
New England BioLabsP8107SYöntem 3'te kullanım için
PTC-100 Programlanabilir Termal Kontrol CihazıMJ Research Inc.Yöntem 1 içinPTC-100
PVDF Transfer MembranıMilipore SigmaIEVH00005Yöntem 1 ve 2 için
Rekombinant H3.1Yöntem 1'de kullanım içinNew England BioLabsM2503S
Rekombinant p300ENZO Yaşam BilimleriBML-SE451-0100Yöntem 1'de kullanım için
SAHA (Vorinostat)Cayman Chemical149647-78-9HDAC İnhibitörü Yöntem 2'de kullanım için
SDS lizis tamponu. Tarif için Tablo 1'e bakın.
Sodyum AzideFisher Scientific26628-22-8Yöntem 1 ve 2 için. DİKKAT: Sodyum Azid toksiktir. Doğru kullanım için SDS'ye bakın.
Tampon hazırlama içinSodyum BikarbonatFisher ScientificS233-500
Tampon hazırlama içinsodyum deoksikolatSigma-AldrichD6750
Sodyum dodesil sülfat (SDS)SDS numune tamponu hazırlama içinSigma-Aldrich71725
Standart Isı BloğuVWR Bilimsel ÜrünlerMPN: 949030Yöntem 1 ve 2 için
Masa üstü santrifüjEppendorf5417RTüm yöntemler için
TE tamponuYöntem 3 için. Tarif için Tablo 1'e bakın.
transfer tamponu. Tarif için Tablo 1'e bakın.
Trichostatin ACayman Chemical58880-19-6HDAC İnhibitörü Tampon
hazırlama içinTrisFisher ScientificBP152-5
Tampon hazırlama içinTriton X-100Sigma-AldrichT8787
Yöntem 1 ve 2'de tampon hazırlama içinTween 20Sigma-Aldrich9005-64-5
X-ışını film işlemcisiKonica Minolta Medikal & Grafik, Inc.Yöntem 1 ve 2 içinSRX-101A
Yöntem 1 ve 2 için Yöntem 1 ve 2 için içeren 1X TBSTYöntem 1 ve 2 için ile 1X TBSTTüm Thermo Fisher: Yöntem 1 içinYöntem 2 için Yöntem 2 ve 3'te kullanım için Yöntem antoikorları ve Yöntem 2 için ChIPYöntem 3 için Yöntem 2 ve 3 için SDS numune tamponu için için tampon Yöntem 3 için edin ÇekirdekYöntem 3 için Yöntem 1 ve 2 için Yöntem 2'de kullanım için

Kaynaklar

  1. Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
  2. Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveals Rapid Dynamics and Broad Scope of the CBP/p300 Acetylome. Cell. 174 (1), 231-244 (2018).
  3. Dancy, B. M., Cole, P. A. Protein lysine acetylation by p300/CBP. Chemical Reviews. 115 (6), 2419-2452 (2015).
  4. Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
  5. Yang, H., et al. Small-molecule inhibitors of acetyltransferase p300 identified by high-throughput screening are potent anticancer agents. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (5), 610-620 (2013).
  6. Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
  7. Coffey, K., et al. Characterisation of a Tip60 specific inhibitor, NU9056, in prostate cancer. Plos One. 7 (10), 45539(2012).
  8. Majaz, S., et al. Histone acetyl transferase GCN5 promotes human hepatocellular carcinoma progression by enhancing AIB1 expression. Cell & Bioscience. 6, 47(2016).
  9. Jin, L., et al. Therapeutic Targeting of the CBP/p300 Bromodomain Blocks the Growth of Castration-Resistant Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (20), 5564-5575 (2017).
  10. Raisner, R., et al. Enhancer Activity Requires CBP/P300 Bromodomain-Dependent Histone H3K27 Acetylation. Cell Reports. 24 (7), 1722-1729 (2018).
  11. Jin, Q., et al. Distinct roles of GCN5/PCAF-mediated H3K9ac and CBP/p300-mediated H3K18/27ac in nuclear receptor transactivation. The EMBO Journal. 30 (2), 249-262 (2011).
  12. Pradeepa, M. M. Causal role of histone acetylations in enhancer function. Transcription. 8 (1), 40-47 (2017).
  13. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  14. Wang, Z., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nature Genetics. 40 (7), 897-903 (2008).
  15. Ianculescu, I., Wu, D. Y., Siegmund, K. D., Stallcup, M. R. Selective roles for cAMP response element-binding protein binding protein and p300 protein as coregulators for androgen-regulated gene expression in advanced prostate cancer cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (6), 4000-4013 (2012).
  16. Zhong, J., et al. p300 acetyltransferase regulates androgen receptor degradation and PTEN-deficient prostate tumorigenesis. Cancer Research. 74 (6), 1870-1880 (2014).
  17. Fu, M., et al. p300 and p300/cAMP-response element-binding protein-associated factor acetylate the androgen receptor at sites governing hormone-dependent transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 275 (27), 20853-20860 (2000).
  18. Emami, K. H., et al. A small molecule inhibitor of beta-catenin/CREB-binding protein transcription [corrected]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12682-12687 (2004).
  19. Stimson, L., et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Molecular Cancer Therapeutics. 4 (10), 1521-1532 (2005).
  20. Modak, R., et al. Probing p300/CBP associated factor (PCAF)-dependent pathways with a small molecule inhibitor. ACS Chemical Biology. 8 (6), 1311-1323 (2013).
  21. Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nature Communications. 8 (1), 1527(2017).
  22. Liao, D. Identification and characterization of small-molecule inhibitors of lysine acetyltransferases. Methods in Molecular Biology. 1238, 539-548 (2015).
  23. Gardberg, A. S., et al. Make the right measurement: Discovery of an allosteric inhibition site for p300-HAT. Structural dynamics. 6 (5), Melville, N.Y. 054702(2019).
  24. Ceccacci, E., Minucci, S. Inhibition of histone deacetylases in cancer therapy: lessons from leukaemia. British Journal of Cancer. 114 (6), 605-611 (2016).
  25. Tashiro, E., Tsuchiya, A., Imoto, M. Functions of cyclin D1 as an oncogene and regulation of cyclin D1 expression. Cancer Science. 98 (5), 629-635 (2007).
  26. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  27. JoVE. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , Cambridge, MA. (2020).
  28. Gooderham, K. Transfer techniques in protein blotting. Methods in Molecular Biology. 1, 165-178 (1984).
  29. Westermeier, R. Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations. , Wiley. (2004).
  30. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  31. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Nonelectrophoretic bidirectional transfer of a single SDS-PAGE gel with multiple antigens to obtain 12 immunoblots. Methods in Molecular Biology. 536, 55-65 (2009).
  32. Kyhse-Andersen, J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 10 (3-4), 203-209 (1984).
  33. Tovey, E. R., Baldo, B. A. Comparison of semi-dry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 8 (9), 384-387 (1987).
  34. Greenfield, E. A. Protein Quantitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  35. Barrow, J. J., Masannat, J., Bungert, J. Neutralizing the function of a β-globin-associated cis-regulatory DNA element using an artificial zinc finger DNA-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 17948-17953 (2012).
  36. Leach, K. M., et al. Characterization of the human beta-globin downstream promoter region. Nucleic Acids Research. 31 (4), 1292-1301 (2003).
  37. ChIP-qPCR and Data Analysis. Sigma-Aldrich. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/chip-qpcr-data-analysis.html (2020).
  38. Balasubramanyam, K., Swaminathan, V., Ranganathan, A., Kundu, T. K. Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19134-19140 (2003).
  39. Using ImageJ to quantify blots. Diamantina Institute - University of Queensland. , Available from: https://di.uq.edu.au/community-and-alumni/sparq-ed-services/using-imagej-quantify-blots (2020).
  40. Kalkhoven, E., et al. Loss of CBP acetyltransferase activity by PHD finger mutations in Rubinstein-Taybi syndrome. Human Molecular Genetics. 12 (4), 441-450 (2003).
  41. Ortega, E., et al. Transcription factor dimerization activates the p300 acetyltransferase. Nature. 562 (7728), 538-544 (2018).
  42. Koutelou, E., Hirsch, C. L., Dent, S. Y. R. Multiple faces of the SAGA complex. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 374-382 (2010).
  43. Wang, Y., et al. Identification of histone deacetylase inhibitors with benzoylhydrazide scaffold that selectively inhibit class I histone deacetylases. Chemistry & Biology. 22 (2), 273-284 (2015).
  44. Hu, E., et al. Identification of novel isoform-selective inhibitors within class I histone deacetylases. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 307 (2), 720-728 (2003).
  45. Lee, B. I., et al. MS-275, a histone deacetylase inhibitor, selectively induces transforming growth factor beta type II receptor expression in human breast cancer cells. Cancer Research. 61 (3), 931-934 (2001).
  46. Leus, N. G. J., et al. HDAC1-3 inhibitor MS-275 enhances IL10 expression in RAW264.7 macrophages and reduces cigarette smoke-induced airway inflammation in mice. Scientific Reports. 7, 45047(2017).
  47. Rossi, L., et al. HDAC1 inhibition by MS-275 in mesothelial cells limits cellular invasion and promotes MMT reversal. Scientific Reports. 8 (1), 8492(2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

HAT AnaliziChHAI AnaliziChIP qPCRHiston Asetilasyonumm noblotlamaProteinaz KManyetik BoncuklarqPCR AnaliziEpigenetik D zenleme

İlgili makaleler