Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Zaman Atlamalı Mikroskopi Kullanılarak Escherichia Coli'de Biyolojik Gürültünün Sürekli Ölçümü

3.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61290

⸱

27 Nisan 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Technion - Israel Institute of Technology

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, sentetik gen devrelerinin stokastik davranışının analizi ve nicelleştirilmesi için tek bir Escherichia coli hücresinin canlı görüntülenmesini sağlayan bir mikroskopi yöntemi sunun.

Özet

Burada geliştirilen protokol, Escherichia coli bölümünün ve floresan seviyelerinin birkaç saat boyunca bilgisayar takibini sağlamak için bir araç sunmaktadır. Süreç, sadece doğru plazmidi barındıran Escherichia coli'nin belirli koşullarda gelişebileceğini varsayarak, minimum medyada hayatta kalan kolonileri tarayarak başlar. Birçok DNA parçasının montajını gerektiren büyük genetik devreler oluşturma süreci zor olduğundan, devre bileşenleri genellikle birkaç antibiyotik kullanılmasını gerektiren farklı kopya numaralarında birden fazla plazmid arasında dağıtılır. Plazmiddeki mutasyonlar antibiyotik direnci genlerinin transkripsiyonunu yok edebilir ve nekroza yol açan hücredeki kaynak yönetimi ile kesişebilir. Seçilen koloni cam tabanlı bir Petri kabına ayarlanır ve hem parlak alanda hem de floresan etki alanlarında mikroskopi takibi için birkaç odak düzlemi seçilir. Protokol, düzenlenemeyen ilk koşullar altında görüntü odağını 12 saatten fazla tutar ve birkaç zorluk yaratır. Örneğin, ölü hücreler birkaç saatlik görüntülemeden sonra lenslerin odak alanında birikmeye başlar, bu da toksinlerin birikmesine ve sinyalin bulanıklaşmasına ve çürümesine neden olur. Besinlerin tükenmesi yeni metabolik süreçleri tanıtır ve devrenin istenen yanıtını engeller. Deneyin sıcaklığı indükleyicilerin ve antibiyotiklerin etkisini düşürür ve bu da sinyalin güvenilirliğine daha fazla zarar verebilir. Minimum ortam jeli küçülür ve kurur ve sonuç olarak optik odak zamanla değişir. Bu yöntemi geliştirdik Escherichia coliDiğer mikro organizmalar için benzer yöntemler geliştiren önceki çalışmalara benzer. Buna ek olarak, bu yöntem değişmemiş ve değiştirilmiş hücrelerdeki toplam stokastik gürültüyü ölçmek için bir algoritma sunar ve sonuçların benzer bir değişim katsayısı (CV) ile gösterildiği gibi akış analizörü tahminleri ile tutarlı olduğunu bulur.

Giriş

Sentetik biyoloji, son on yılda ortaya çıkan ve mühendislik tasarım ilkelerini rasyonel biyolojik tasarım 1 , 2,3, temel bilimi anlamak için canlı hücrelerde çok sinyalli entegrasyon ve işlemeyi sağlamak amacıyla 4,5, tanısal, terapötik ve biyoteknolojik uygulamalar6,7,8,9,10'a çevirmeyi amaçlayan multidisipliner bir alandır. Sentetik gen devrelerinin giriş-çıkış tepkisini ölçme yeteneğimiz, otomatik zaman atlamalı mikroskopi11kullanılarak akış analizörü ve canlı hücre görüntüleme de dahil olmak üzere tek hücreli teknolojideki son gelişmelerle devrime uğradı. Bir akış analizörü genellikle bu devrelerin tepkisini sabit durumda ölçmek için kullanılır1,12ve ters mikroskopi, sentetik gen devrelerinin dinamik tepkisini tek bir hücre düzeyinde ölçmek için kullanılır3. Örneğin, sentetik biyolojideki ilk çalışmalardan biri, gecikmeli negatif geri bildirim döngüleri kullanılarak canlı hücrelerde genetik osilatör ağlarının inşasını içeriyordu3. Daha sonra, canlı hücrelerin dinamik ortamında metabolik kontrolü anlamak için genetik osilatör devreleri uygulandı4. Otomatik zaman atlamalı mikroskopi, bu tür devreleri karakterize etmek için bir yöntemdir. Konak hücrelerin, Escherichia coli, mikro koloniler oluştururken senkronize olduğunu, tam anne-kız ilişkilerini izlemeden sinyal ölçümüne ve gürültünün hesaplanmasına izin verdiğini vardır.

Gürültü, biyolojik sistemlerin genellikle birden fazla kaynaktan kaynaklanan temel, doğal bir yönüdür. Örneğin, proteinlerin difüzyonu gibi ayrık rastgele taşıyıcıların taşınmasından kaynaklanan sinyalleri içeren biyokimyasal reaksiyonları düşünün13. Bu sinyaller rastgele dalgalanmalarla yayılır14. Diğer gürültü kaynakları kaynak kullanılabilirliği, hücre bölünmesi ve sıcaklık, nem ve basınç gibi çevresel koşullardaki farklılıklardır. Sentetik gen devrelerinde yayılan biyolojik sinyaller genellikle gürültü oranına (SNR) çok düşük bir sinyale sahiptir ve bu da bu tür devrelerin performansını bozmaktadır. Bu nedenle, genetik devre tasarımı genetik mühendisliğinin en zorlu yönlerinden biri olmaya devam etmektedir15. Örneğin, yalnızca ortalama gen ekspresyonunun hesapladığı çoğu yaklaşımın aksine (tüm hücre popülasyonu üzerinden ölçülür), sentetik gen ağları aracılığıyla öngörülebilir davranışı tasarlamak için ölçülen sinyalin varyansı dikkate alınır12. Bu nedenle, protein ifadesindeki değişkenlik veya gürültü seviyeleri, analog ve dijital gen devrelerinin tasarımında ve performansında baskın bir rol oynar1,16,17.

Escherichia coli3,7,18dahil olmak üzere hücreden hücreye değişkenliği ölçmek için birçok yaklaşım geliştirilmiştir. Bu yöntemler genellikle gen aktivasyonunu ve metabolik yolları incelemek için kullanılır, ancak özellikle bunun temel bir zorluk olduğu canlı hücrelerdeki genetik devreler için belirli gürültü kaynaklarını ölçmek ve dağıtmak gibi stokastik gürültü dinamiklerinin incelenmesine daha az odaklanarak19,20,21. Hem devrenin kendisine miras kalan (içsel) hem de konak hücrelerden (dışsal) türetilen çeşitli faktörler genetik devrelerin sürekli performansını bozabilir. Bu yazıda, içsel ve dışsal gürültü kaynakları da dahil olmak üzere Escherichia coli hücrelerindeki toplam gürültüyü ölçmeyi amaçlayan bir protokol geliştirdik6,22. Toplam gürültüyü ölçerek ve daha sonra SNR23'ü değerlendirerek gen devrelerinin tasarımı geliştirilebilir. Bu yöntem, birkaç floresanproteiniizleyerek bağımsız gürültü kaynaklarını ayrı ayrı ölçmek için değiştirilebilir 6,20. Burada açıklanan protokol için çevre koşullarını iyi kontrol altında tutuyor ve dış faktörlerin etkisi olmadan hücrelerin aktivitesini sürekli ölçüyoruz. Floresan proteinlerden gelen sinyali zaman içinde tek hücrelerde ölçtük ve aynı anda bir agarose substratı altında görüntüleyeceğiz. Elde edilen görüntüler laboratuvarın özel MATLAB'ı kullanılarak analiz edilir.

İdeal olarak, bir hücre içindeki floresan proteinlerin gerçek zamanlı aktivitesinin sürekli ölçümü, hücrelerin büyümesi ve bölünmesi yoluyla doğru veriler üretecektir. Ancak, bu tür verileri elde etmek zordur. Bunun nedeni, foto-ağartma7olarak bilinen floresan proteinlerin, heyecanlanma sürecinde radyasyona maruz kaldıklarında bozulmasıdır. Ayrıca, Escherichia coli hücreleri de fototoksiteye yol açabilecek heyecan için hassastır7. Her iki sorun da elde edilebilen fotoğraf karelerinin miktarını ve satın almalar arasındaki süreyi sınırlar. Görüntüleme sırasında hücreleri büyütmek için kullanılan substrat ve orta tipler (örneğin, lysogeny et suyu) da kritik bir role sahiptir. Floresan olmayan arka planı en aza indiren ve hücre bölünme süresini uzatan minimum ortam kullanmanızı öneririz.

Ayrıca, numunenin aşağıdaki gereksinimler göz önünde bulundurularak hazırlanması gerekir (1) Düşük hücre bölünme oranı, bölme döngüsünü yakından görüntülemek ve fototoksiklik ve fotobleaching olasılığını azaltmak için daha az sıklık pozlama sağlar. Edinme süresini öngörülen mitoz süresinin yaklaşık yarısına ayarladık (2) Deneyin başındaki düşük hücre yoğunluğu, bölünmenin daha iyi homojenliğini ve izlenebilirliğini sağlar. Hücre yoğunluğu, bu protokolün başarısı için önemli bir parametre olan ve her laboratuvar için belirlenmesi gereken Escherichia coli hücrelerinin seyreltme oranından etkilenir. Oranı belirlemek için, kullanılan her yeni Escherichia coli suşu veya ortamı büyüme hızı grafikleri ile donatılmalıdır(Tamamlayıcı Şekil 1). Hücreler yaklaşık600nm = 0.1 başlangıç yoğunluğundan kısa bir inkübasyondan sonra ek titreme olmadan büyüyebiliyorsa uygun bir oran elde edilmiştir. Bu aşamadaki hücreler sadece ortam sıcaklığına göre bölünür (3) Hücre hareketinin kısıtlanması: hücre hareketi güçlü bir şekilde substrat (agarose pad) sıkılığına bağlıdır. Substrat sıkılığı toplam agarose miktarına ve jel katılaşma süresine bağlıdır. Escherichia coli mitoz geçireceğinden, jeller oda sıcaklığında bir gecede katılaşmaya bırakılamaz. Substrat stabilitesini etkileyen diğer faktörler arasında numunedeki su miktarı ve nem sayar. Ek konular Temsilci Sonuçları 'nda ayrıntılı olarak ele alınmıştır. Bu protokol birçok ayrıntı sağlar ve yavaş yavaş bir adımdan diğerine geçer. Protokol, görüntüleme deneyleri için uzun kararlılık sunar ve temel bir görüntü işleme aracı sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Medya ve kültür hazırlığı

  1. 1.000x Karbenisilin (50 mg/mL) veya ilgili antibiyotik stok çözeltisi hazırlayın.
    1. . 0,5 g karbenisilin ağırlığında. 10 mL steril H2O ekleyin.
    2. Karbenisilin stoğunu 0,22 μm şırınna filtresi ile sterilize edin. Antibiyotik çözeltisini aliquot ve -20 ° C'de saklayın.
  2. Lysogeny et suyu (LB) plakaları hazırlamak için, 5 g tripto, 5 g NaCl, 2,5 g maya özü ve 7,5 g Bacto agar'ı 0,5 L steril H2O ile karıştırın.
    1. Erimiş jel karışımını 50 °C'lik bir su banyosuna kısmen batırın. 1.000 μL karbenisilin (50 mg/mL) ekleyin.
    2. Petri yemeklerini steril bir ortamda hazırlayın. Tabakları buzdolabında saklamadan önce ayarlamak için bırakın.
  3. M9 minimal ortam için aşağıdakilerin ayrı stok çözümlerini hazırlayın: 5x M9 tuzları (56,4 g/L), 2 M glikoz ve% 2 biyotin içermeyen casamino asitleri. Çözümleri 121 °C'de 20 dakika boyunca otoklavlayın.
  4. 5 Petri plakası hazırlamak için, 1125 mg düşük eriyen agar ve 400 mg agar'ı 89,2 mL minimum ortamla (1x M9) karıştırın. 250 mL Erlenmeyer şişeye %2 casamino asitlerinin 10 mL'sini (%2 [vol/vol]) ekleyin.
    NOT: Ortamı şişenin iç dudaklarına döktüklerinden emin olun.
  5. Çözeltiyi 3 ila 4 saniyelik kısa aralıklarla mikrodalgaya koyun. Çözüm net olana kadar tekrarlayın.
    NOT: Kaynama noktasına ulaşmamaya dikkat edin.
  6. Difüzyonla daha fazla karıştırmak için 250 mL Erlenmeyer şişesini sıcak bir su banyosuna (60 °C) yerleştirin ve sıcaklığı yaklaşık 45-50 ° C'ye düşene kadar soğumaya bırakın.
  7. Plaka döken bankta alevi yak.
  8. Tüm çözümleri aşağıdaki sırayla hızla ekleyin:
    %50 gliserol 800 μL (%0,4 [vol/vol])
    100 μL tiamin (B1)
    1100 μL Glikoz (2M)
    100 μL Karbenisilin (50 mg/mL).
  9. Agar boyunca tüm bileşenlerin eşit dağılımını sağlamak için Erlenmeyer şişesini döndürün.
  10. Alevin yanında her seferinde bir tabak açın ve dökülmeye başlayın.
    1. Plakaları ilk katılaşmaya kadar birkaç dakika tezgahta bırakın.
    2. Su yoğuşmasının jel üzerine damlamasını önlemek için plakaları ters çevirin.
    3. Tabakları oda sıcaklığında yaklaşık 2 saat katılaşmak üzere bırakın.
    4. Plakalar katılaştıktan ve kuruduktan sonra, yaklaşık 3 ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.

2. Bakteri suşları ve plazmidler yapımı

NOT: Genetik devre bir bölüm içerir; bir PtetO promotörü tarafından yönlendirilen ve constitutive ifade ile sonuçlanan bir Yeşil Floresan Protein (GFP). Bu çalışmadaki tüm plazmidler temel moleküler klonlama teknikleri kullanılarak inşa edildi ve standart bir ısı şoku protokolü 24 kullanılarak Escherichia coli 10β'yedönüştürüldü. Son yapı, test için Escherichia coli MG1655 vahşi tip suşuna dönüştürüldü.

  1. Standart ısı şoku protokolü24ile istenen plazmidi Escherichia coli MG1655 hücrelerine dönüştürün.
  2. Dönüştürülmüş hücreleri 37°C'de bir LB agar plakasında bir gecede büyütün.
    NOT: Petri yemeklerini mikroskopi kullanımı için 2,2 adımdan 3 güne kadar saklamak mümkündür.
  3. Tek bir koloniyi cam bir tüpte ilgili antibiyotiklerle desteklenmiş 5 mL LB suyuna aşıla.
  4. Sıvı bulanık olana kadar 2 saat boyunca inkübatörde 250 rpm sallama hızı ile 37 °C'de hücreleri büyütün.
  5. Aşağıdaki gibi 1 mL seyreltme çözeltisi hazırlayın:
    892 μL minimum ortam (1x M9)
    %50 gliserol 8 μL (%0,4 [vol/vol])
    %2 Casamino asitlerinin 100 μL'si (%0,2 [wt/vol])
    1 μL tiamin (B1)
    11 μL Glikoz (2 M)
    1 μL ilgili antibiyotik
    1. Karıştırın ve aşağı çevirin.
  6. 1000 μL seyreltme çözeltisine (adım 2.5) 30 μL Escherichia coli büyümesi ekleyerek hücre kültürünü (1:30) adım 2.4'ten 2 mL tüpe seyreltin.
  7. Tüpü 37 °C'de sallama (250 rpm) ile 1 saat kuluçkaya yaslanın.
  8. Adım 1.10'da hazırlanan M9 plakalarda 40 μL - 60 μL büyüyün. Plakayı gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    NOT: Kaplama için Optik Yoğunluk (OD600nm)0,1 civarında olmalıdır.
  9. Tezgaha en fazla üç 35 mm cam alt plaka yerleştirin.
    NOT: Plakanın camının kullanılan mikroskop lensleri için doğru kalınlıkta olduğundan emin olun.
  10. Jel plakalarda tohumlama için kültürü hazırlayın, adım 2.9 mikroskop ölçümlerinde hazırlanan plakadan koloniler için 2.3 ila 2.6 adımlarını tekrarlayın.
  11. Üç mikroskop plakası yapmak için aşağıdaki çözümü hazırlayın.
    1. Su banyoyu önceden 60 °C'ye ısıtın.
    2. 112,5 mg düşük eritme agar ve 40 mg agar'ı 8,92 mL minimum ortamla (1x M9) karıştırın ve 25 mL Erlenmeyer şişesinde% 2 casamino asitlerinin (% 0,2 [vol/vol]) 1 mL'sini ekleyin.
      NOT: Ortamı şişenin iç dudaklarına döktüklerinden emin olun.
  12. Çözeltiyi 2 ila 3 saniyelik kısa aralıklarla mikrodalgaya koyun. Çözüm net olana kadar tekrarlayın.
    NOT: Kaynama noktasına ulaşmamaya dikkat edin.
  13. 25 mL Erlenmeyer şişesini difüzyonla daha fazla karıştırmak için sıcak su banyosuna (60 °C) yerleştirin ve sıcaklığı yaklaşık 45-50 ° C'ye düşene kadar bankta soğumaya bırakın.

3. Agarose pedlerinin hazırlanması

  1. % 70 etanol ile temiz tezgah. Temizlenmiş bankta bant ger. Bandın pürüzsüz ve düz olduğundan emin olun.
  2. İki kapak hazırlayın: biri bantta ve ikincisi yakınlarda. Bir kapak hazırlayın.
  3. Şişeyi (adım 2.14'te hazırlanan) su banyosundan çıkarın, şişenin dışını temizleyin ve sıcaklığı yaklaşık 45-50 ° C'ye düşene kadar soğumaya bırakın.
  4. Jel çözümünü yapmak için, tüm çözümleri aşağıdaki sırayla hızlı bir şekilde karıştırın:
    %50 gliserol 80 μL (%0,4 [vol/vol])
    %2 casamino asitlerinin 1 mL'si (%0,2 [wt/vol])
    10 μL tiamin (B1)
    110 μL glikoz (2 M)
    10 μL ilgili antibiyotik.
  5. Jelin 1,5 mL'lik kısmını kapak kapağına dökün ve ikinci parça ile "sandviç" yaparak örtün.
  6. Erlenmeyer'i sıcak su banyosuna geri verin. Sandviçi kapakla örtün ve zamanlayıcıyı 20 dakika ayarlayın.
  7. Aynı zamanda, tüpü 37 °C'de 1 saat boyunca 2.11 adımından sallanarak kuluçkaya yatırın (250 rpm)
  8. 20 dakika sonra sandviçi çevirin (adım 3.5), örtün ve 1 saat dinlenmeye bırakın.
    NOT: Daha iyi sonuçlar için "sandviçi" adım 3.8 süresince 4 °C'de dinlenmeye bırakın.
  9. Tohum Escherichia coli kültürü adım 3.7 örnek pipetleme ile 35 mm çanak.
    NOT: Ayrı küçük damlalar olarak 6 μL hücre pipetleme en iyi sonuçları verir.
  10. Damlaların en az 15 dakika ve 30 dakikaya kadar kurumasını bekleyin.
  11. Kapak kapağını kaydırarak sandviçin katılaşmış jelini adım 3.8'den itibaren ortaya çıkarın.
  12. Sandviçi biyopsi zımbası veya ucu ile küçük bireysel pedler halinde kesin.
  13. Numuneye hafifçe yaslayın (adım 3.9). Yemeği bankta 20 dakika bekletin.

4. Numunenin mikroskopi görüntüleme için hazırlanması

  1. Matarayı su banyosundan adım 3.6'dan çıkarın. Şişenin dışını temizleyin ve oda sıcaklığına (25 °C) soğumaya bırakın.
    NOT: Zamanlayıcı bitmeden yaklaşık 3 dakika önce 4.1.
  2. Jelin 3 mL'lik kısmını dairesel bir hareketle plaka çevresine sürekli olarak dökün. Birkaç dakika katılaşmaya bırakın.
  3. Plakaları bantla kapatın ve 25 G iğne ile birkaç delik delin. Jel üzerine su yoğuşmasını önlemek için tüm bulaşıkları çevirin.
  4. Hücre mitozini önlerken tam katılaşmaya izin vermek için tüm bulaşıkları 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
    NOT: Art arda ölçümler için numuneleri en fazla bir gün olmak üzere 4 °C'de bırakın.
  5. Üretici başına mikroskobu başlatın yönergeleri.
  6. En düşük amplifikasyon lensini kullanarak ilk odağı bulun ve otomatik odak sistemini (AFS) devreye sokun.
  7. Gerekirse yağ kullanın, lensi yağ ile boğun ve plakayı bir platform denetleyicisiyle (manuel olarak değil) hareket ettirerek dikkatlice yayın ve AFS tekrar devreye sokabilir.
  8. Z adım kesitleri için varsayılan öneriyi izleyerek Z yönünde göreli kesit kullanın.
    NOT: Her 5 dakikada bir parlak alan görüntüleri ve 20 dakikada bir floresan görüntüler çektik. Bazen odağın ilk 30 dakika boyunca ayarlanması gerekir. Mikroskop inkübatör kutusunu ve yağı önceden ısıtmak, numuneyi soğutmak ise ilk odak kaybını azaltmaya yardımcı olma eğilimindedir.

5. Veri analizi

NOT: Mikroskopi verilerini işlemek için MATLAB'da bilgisayar tabanlı bir yazılım tasarladık. Bu yazılım, parlak alan tiff görüntülerinden ve segmentlerinden hücre sınırlarının tanımlanmasını kolaylaştırır ve hücreleri alana göre sıralar. Bu görüntü analizinin çıktısı, hücre yoğunluğu seviyelerini türetmek ve mikroskop çözünürlük sınırları nedeniyle hücre halesi gibi floresan etki alanındaki yapıtları iptal etmek için floresan tiff görüntülerinde maske olarak kullanılabilir. Geliştirilen yazılım benzer çalışmalardan esinlenmiştir7,25,26,27,28,29,30 ve laboratuvar için özel zarif bir çözüm sağlar.

  1. İlk olarak, main_code.maşağıdaki parametreleri tanımlayın.
    1. Edinme görüntülerinin klasörünü tanımlayın.
    2. Görüntü süresi süresini tanımlayın - parlak alan kanalı zaman adımı dakika olarak.
    3. GFP sıklığını tanımlayın - GFP görüntülerinin alım oranı.
    4. Mikroskop çözünürlüğünü tanımlayın (yani, kaç pikselin 1 μm'ye eşit olduğu).
    5. Histogram kutusu aralığını tanımla - hücre alanı aralığı.
      NOT: Verilerin hücre alanına göre sınıflandırılması işlemi, akış sitometrisi veri analizinde gating ilkelerine benzer. Kapılar, bu ilgi popülasyonlarını izole etmek ve ölçmek için genellikle ileri dağınık ve yan dağınık ortak özelliklere sahip hücre popülasyonlarının etrafına yerleştirilir. Mikroskopi, birkaç hücre grubuna geçit, araştırma ve ölçme sağlar.
    6. Konilüs çekirdeğini tanımla (3,3) - bu parametre hücre sınırlarını genel eşik(count_cells.m)ile algılar.
      NOT: Bu kurulum yalnızca laboratuvar veya mikroskobu değiştirirken gereklidir. Yazılım, giriş parlak alan kanalının c1 dizini, floresan kanalı c2 olarak etiketlenmesini gerektirir.
  2. Diğer tüm komut dosyalarını otomatik olarak çalıştıracak main_code.m çalıştırın (count_cells.m, cell_growth_rate.m).
    1. Program parlak alan görüntülerini otomatik olarak segmentlere ayırır (bkz. Ek Şekil 2-4).
    2. Hücre başına yoğunluk düzeyi ayıklamak için segmentasyon görüntüsünü floresan görüntü (GFP) ile birleştirin.
    3. Hücrelerin miktarının grafiğini zamana göre hesaplayın ve üstel büyümeye göre sığdırın.
    4. Her hücre alanı aralığı için ortalama ve standart sapmayı (STD) hesaplayın.
    5. Her hücre alanı aralığı için sinyali gürültü oranına (SNR) hesaplayın.
    6. Hücre miktarının yoğunluğa göre dağılımını çizin ve sığdırın.
    7. Varyans (CV) katsayısını hesaplayın ve akış çözümleyicisi verileriyle karşılaştırın.
      NOT: Yazılım, "klasörünüz/Segmentli" yeni bir klasördeki conv_kernel ayarlamak için son segmentasyon görüntülerini çıktı olarak verecektir. Yazılım, yeni bir klasördeki grafikleri çıktı olarak verecektir "klasörünüz/Grafikleriniz.
  3. Deneyler arasında karşılaştırma yapmak için compare_experiments.mkullanın.
    1. Kaydedilen grafikler için dizinler ve \CompareResult dizininin adresini tanımlayın.
    2. Dosyayı çalıştırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yazılım, beyaz ve siyah olmayan parlak alan adı görüntülerini analiz eder. Escherichia coli, beyaz olmayan bir arka plan üzerinde siyah dikdörtgen şekillere benzeyecek ve dinamik parlaklık aralığı merkezinde bir artış göstermelidir (Şekil 1). Floresan görüntülerde hücreler küçük bir haleye sahip olabilir, ancak dikdörtgen şekillere sahip bireysel hücreler hala çözülebilir. Bir mitoz olayı ilk olarak 30 dakika sonra tespit edilmelidir. Mikroskop odağı zaman içinde sabit kalmalıdır ve...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, Escherichia coli canlı hücrelerinin bilgisayar izlemesini sağlayan, bir saat boyunca bölünme ve floresan seviyelerini takip eden bir protokol geliştirdik. Bu protokol, CV ve SNR'yi gerçek zamanlı olarak ölçerek Escherichia coli'deki genetik devrelerin stokastik dinamiklerini ölçmemizi sağlar. Bu protokolde şekil 10'dagösterildiği gibi iki farklı devrenin stokastik davranışlarını karşılaştırdık. Düşük kopya numaralarına sahip plazmidlerin stokastik etkilere daha yatkın oldu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Matlab koduna yardımcı olduğu için Bay Gil Gelbert'e (Elektrik Mühendisliği Fakültesi, Technion) teşekkür ederiz. Dr. Ximing Li'ye (Technion Biyo-Tıp Mühendisliği Fakültesi) bu makalenin kanıtlanmasına yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Bu araştırma, Neubauer Aile Vakfı ve İsrail Bilim Bakanlığı tarafından kısmen desteklendi, grant 2027345.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Mikroskop merceğine karşılık gelen35mm cam tabakmattekP35G-0.170-14-C
Agaroz Lonza5004LB hazırlama
AHL Sigma-AldrichK3007indükleyici
Bacto tripton BD - Becton, Dickinson ve Şirketi 211705LB hazırlama
CarbInvitrogen10177-012antibiyotik
CarbFormediumCAR0025antibiyotik
Casamino asitler BD - Becton, Dickinson ve Şirketi 223050minimal medya çözümü
eclipse Tinikonters mikroskop
GlukozSigma-AldrichG5767minimal medya çözümü
GlyserolBio-Lab000712050100minimal medya substratı
Immersol 518Fzeiss4449600000000daldırma yağı
M9 tuz çözeltisi Sigma-AldrichM6030minimal medya çözümü
NaClBio-Lab214010LB hazırlama
Noble agarSigma-AldrichA5431minimal medya substratı
parafilm bantBemisPM-996metinde bant olarak anılır
Seaplaque GTG AgaroseLonza50111minimal medya substratı
taymine B1Sigma-AldrichT0376 MİNİMUM MEDYA ÇÖZÜMÜ
Maya ÖzüBD - Becton, Dickinson and Company 212750LB hazırlık
kalınlığı.

Kaynaklar

  1. Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. Synthetic analog computation in living cells. Nature. 497, 619-623 (2013).
  2. Yang, X. S. Y., L, A. B. Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. Harwood, C., Jensen, G. , (2016).
  3. Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging. Biomedcentral Research Notes. , (2011).
  4. Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. ChemPhysChem. , (2006).
  5. Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).
  6. Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system. Nucleic Acids Research. , (2019).
  7. Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nature Protocols. , (2012).
  8. Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).
  9. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. , (2002).
  10. Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. Synchronized DNA cycling across a bacterial population. Nature Genetics. , (2017).
  11. Arriaga, E. A. Determining biological noise via single cell analysis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).
  12. Nielsen, A. A. K., et al. Genetic circuit design automation. Science. , (2016).
  13. Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
  14. Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. Noise propagations in gene networks. Science. , (2005).
  15. Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. , (2014).
  16. Aoki, S. K., et al. A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation. Nature. , (2019).
  17. Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).
  18. de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
  19. Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Reviews Genetics. , (2019).
  20. Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades. Biophysical Journal. , (2002).
  21. Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Intrinsic noise in gene regulatory networks. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).
  22. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. , (2005).
  23. Van Der Ziel, A. Noise in Measurements. , Wiley & Sons Inc. (1976).
  24. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).
  25. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. , (2006).
  26. Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular Microbiology. , (2016).
  27. Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. , (2016).
  28. Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology. , Wiley Online Library. (2016).
  29. Balomenos, A. D., et al. Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology. Biomedcentral System Biology. , (2017).
  30. Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data. PLoS One. , (2019).
  31. Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. , (2006).
  32. Beal, J. Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).
  33. Marr, D., Hildreth, E. Theory of edge detection. Proceedings of the Royal Society - Biology Science. 207, 187-217 (1980).
  34. Otsu, N. Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).
  35. Soille, P. Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).
  36. Bradley, D., Roth, G. Adaptive Thresholding using the Integral Image. Journal of Graphics Tools. , (2007).
  37. Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. , (1994).
  38. Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).
  39. Millo, R., Phillips, R. What is the maturation time for fluorescent proteins. Cell Biology by Numbers. , (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Genetik DevrelerFloresan Raporlay cKonfokal MikroskopiSinyal g r lt OranMinimal BesiyeriKoloni TaramaAgaroz Jel
Zaman Atlamalı Mikroskopi Kullanılarak Escherichia Coli'de Biyolojik Gürültünün Sürekli Ölçümü
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.