Protokol, hücresel canlılığı verimli bir şekilde belirlemek için hızlı, yüksek verimli, güvenilir, ucuz ve tarafsız bir testi tanımlar. Bu tahlil özellikle hücrelerin mitokondrisi hasar gördüğünde yararlıdır, bu da diğer tahlilleri bozar. Hoechst 33342 ve propidium iyodür - Tsay iki nükleer boya ile boyanmış hücrelerin otomatik sayma kullanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mitokan Sitotoksisitesinin Doğru Tayini için Otomatik Diferansiyel Nükleer Boyama Denemesi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Mitokondrinin onkojenik dönüşüme katkısı geniş ilgi ve aktif bir çalışma konusudur. Kanser metabolizması alanı daha karmaşık hale geldikçe, mitokondri hasar (sözde mitokanlar) inflict çeşitli bileşikler kullanarak mitokondri hedefleme hedefi oldukça popüler hale gelmektedir. Ne yazık ki, tetrazolyum tuzları veya resazurin dayalı olanlar gibi birçok mevcut sitotoksisite tahlilleri performansları için fonksiyonel mitokondriyal enzimler gerektirir. Mitokondriyi hedef alan bileşiklerin verdiği hasar genellikle bu tahlillerin doğruluğunu tehlikeye attırıyor. Burada, biri hücre permeant (Hoechst 33342) diğeri (propidium iyodür) olmayan iki floresan boyaile diferansiyel boyama ya da reisial boyama dayalı değiştirilmiş bir protokol açıklıyoruz. Boyama farkı yaşayan ve ölü hücrelerin ayrımcılığa uğramasını sağlar. Tahlil, otomatik mikroskopi ve görüntü analizine açıktır, bu da iş bilgililiği artırır ve önyargıyı azaltır. Bu aynı zamanda 96-iyi plakalar kullanarak yüksek iş yapma moda kullanılacak töz sağlar, uyuşturucu keşif çabaları için uygun bir seçenek yapma, özellikle söz konusu ilaçlar ın mitotoksisite bazı düzeyde var. Daha da önemlisi, Hoechst/PI boyama tahtına göre elde edilen sonuçlar, hem trypan mavisi dışlama sonuçlarıyla hem de tahkikat diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında biyolojik kopyalar arasında artan tutarlılık göstermektedir.
Giriş
Etkili kanser tedavilerini belirlemek için ilk adım, tedavinin etkisini incelemek için kullanılabilecek sağlam, tarafsız sitotoksisite tetkik seçimidir. Düşük iş elde deneyleri için ortak bir seçim canlı hücrelerden trypan mavi boya dışlanmasıdır. Hücre sağkalım ölçmek için nispeten tarafsız bir yöntem sağlar, çünkü bu yöntem tercih edilir. trypan mavi pasif olan membranlar tehlikeye hücrelere yayılır, ancak etkili sağlıklı hücrelere girmesini engellenir1. Canlı hücrelerin ve toplam hücrelerin bölümü tedavinin etkinliğini gösteren yüzde canlılığı temsil eder. Trypan mavi sataştının en önemli dezavantajı, yüksek iş elde yöntemleri için uygun olm....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Sitotoksisite Tsay: Kurulum
- Uygun ortamda istenilen konsantrasyonlarda (serumsuz veya 1, 2,5 veya %5 FBS RPMI-1640) ilgi bileşiklerinin çözümlerini hazırlayın.
- Tek bir bileşiğin sitotoksisitesini ölçmek için (örn. etkili dozları belirlemek için), bileşikleri 2x son konsantrasyonda hazırlayın.
- Bileşik kombinasyonların sitotoksisitesini ölçmek için, bileşikleri 4x son konsantrasyonda hazırlayın.
- Aynı miktarda çözücüile uygun ortama karıştırılarak yalnızca çözücü kontrollerini hazırlayın. Örneğin, DMSO ve metanolde çözünmüş bileşikleri test ediyorsanız, her çözücü için yalnızca çözücü kontrolü yapın.
- 15 mL....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Söz konusu protokol, temsili akut miyeloid lösemi hücre hattı olarak alınan OCI-AML2 hücreleri kullanılarak geliştirilmiştir. AML kemik iliğinde farklılaşmamış ve fonksiyonel olmayan hematopoetik hücrelerin anormal çoğalması ile karakterizedir26. AML hedefli tedavideki son gelişmelere rağmen, bakım standardı birkaç on yıl boyunca değişmeden kalmıştır ve indüksiyon tedavisi (genellikle antrasikline üç gün oluşur, örneğin, daunorubicin, idarubicin, veya antranedione mitoksantah, ve sitarabine 7 gün).......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Hoechst/PI sitotoksisite tahkizi protokolü sağlam olmasına ve nispeten az uygulamalı zaman gerektirmesine rağmen, doğru sonuçları sağlamak için çok önemli olan birkaç deneysel ayrıntı vardır. İlk olarak, DMSO konsantrasyonunun %0,5'in (v/v) altında kaldığından emin olmak önemlidir. Genellikle DMSO bile düşük dozlarda maruz önemli ölçüde morfolojisi ve hücrelerin eki değiştirebilir ve önemli ölçüde hücre döngüsü ilerlemesini geciktirmek kabul edilir39,40.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
NVK, Kanser Araştırma bir CPRIT bilim adamı, teşekkür Kanser Önleme ve Araştırma Enstitüsü Texas (CPRIT) onların cömert destek için, CPRIT hibe RR150044. Bu çalışma aynı zamanda Welch Vakfı Araştırma Hibe C-1930 tarafından desteklendi ve Ulusal Sağlık Enstitüleri R35 GM129294 tarafından NVK verildi. Fon layıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, makalenin yayımlama kararı veya hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2-Deoksi-D-glikoz / 2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
| 3-bromo-piruvat | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
| 96 Kuyucuklu plakalar | Greiner Bio-One | 655090 | Siyah veya şeffaf düz tabanlı 96 oyuklu plakalar |
| Alamar mavisi HS hücre canlılık reaktifi (100mL) | Thermo Fisher | A50101 | |
| Kontes II otomatik hücre sayacı | Thermo Fisher | ||
| Cytation 5 Hücreli Görüntüleme Çok Modlu Okuyucu | BioTek | ||
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM çözelti; nihai konsantrasyon 1: 1.000 < br / > |
| HyClone fetal sığır serumu | GE Sağlık | # 25-514 | |
| m-klorofenilhidrazon / CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
| PBS tabletleri | Thermo Fisher | BP2944100 | 1 tablet + 200 mL steril su = 1x PBS çözeltisi |
| Penisilin-Streptomisin-Glutamin (100X) | Gibco | 10378016 | |
| Pierce LDH test kiti | Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
| Propidyum İyodür | Thermo Fisher | 50-596-072 | Kuru toz; PBS'de 1 mg / mL stok; son konsantrasyon 5 ve mikro; g / mL (lösemi hücreleri), 1 & mikro; g/mL (normal PBMC'ler) |
| Rotenone | Ark Pharm | AK115691 | |
| RPMI-1640 Orta L-glutamin ve sodyum bikarbonatlı, sıvı, steril filtreli, hücre kültürüne uygun | Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
| Tiazolil mavi tetrazolyum bromür | ACROS Organics | AC158990010 | |
| Tripan mavisi leke (%0,4) | Gibco | 15250-061 | |
| Hücre hatları< / güçlü > | |||
| K562 | ATCC | CCL-243 | CML hücre hattı |
| MOLM-13 | ATCC | AML hücre hattı | |
| MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | TÜM hücre hattı |
| OCI-AML2 | ATCC | AML hücre hattı |
Kaynaklar
- Ramirez, C. N., Antczak, C., Djaballah, H. Cell viability assessment: toward content-rich platforms. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (3), 223-233 (2010).
- Melzer, S., et al. Trypan blue as an affordable marker for automated live-dead cell ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
