Drosophila Larvaları Kullanılarak Termogenetik Nöronal Ekranda Makro besin alımının nicelleştirilmesi

Summary

Burada açıklanan, farklı makro besin kalitesinde diyetlere maruz kalan Drosophila melanogaster larvaları tarafından belirli bir zaman aralığında yenen yiyecek miktarının kolorimetrik olarak ölçülmesini sağlayan bir protokoldür. Bu tahliller nöronal termogenetik ekran bağlamında gerçekleştirilir.

Abstract

Yemleme ve beslenme davranışları, hayvanların gelişimleri, sağlıkları ve zindelikleri için gerekli olan enerji ve besin kaynaklarına erişmelerini sağlar. Bu davranışların nöronal regülasyonunun araştırılması, beslenme homeostazının altında kalan fizyolojik ve moleküler mekanizmaların anlaşılması için gereklidir. Solucanlar, sinekler ve balıklar gibi genetik olarak çekilebilir hayvan modellerinin kullanılması bu tür çalışmaları büyük ölçüde kolaylaştırır. Son on yılda, meyve sineği Drosophila melanogaster, beslenme ve yemleme davranışlarının nöronal kontrolünü araştıran nörobiyologlar tarafından güçlü bir hayvan modeli olarak kullanılmıştır. Şüphesiz değerli olsa da, çoğu çalışma yetişkin sinekleri inceler. Burada, larvalar protein ve karbonhidrat içeriğinde farklı diyetlere maruz kaldıklarında beslenme davranışlarını kontrol eden nöronal substratları araştırmak için daha basit larva sinir sisteminden yararlanan bir protokol açıklıyoruz. Yöntemlerimiz, nöronal termogenetik aktivasyon ekranı bağlamında gerçekleştirilen nicel kolorimetrik seçimsiz besleme testine dayanmaktadır. Bir okuma olarak, larvalar tarafından 1 saat aralıklarla yenen yiyecek miktarı, proteinlerinde karbonhidrat (P:C) oranlarına göre farklılık gösteren üç boya etiketli diyetten birine maruz kaldığında kullanılmıştır. Bu protokolün etkinliği larva Drosophila'danörogenetik bir ekran bağlamında gösterilmiştir Farklı makro besin kalitesindeki diyetlerde yenen yiyecek miktarını düzenleyen aday nöronal popülasyonları belirleyerek. Ayrıca test edilen genotipleri fenotipik sınıflar halinde sınıflandırabildik ve gruplandırabildik. Literatürde mevcut yöntemlerin kısa bir incelemesinin yanı sıra, bu yöntemlerin avantajları ve sınırlamaları tartışılır ve ayrıca, bu protokolün diğer özel deneylere nasıl uyarlanabileceği hakkında bazı öneriler sağlanmaktadır.

Introduction

Tüm hayvanlar hayatta kalmak, büyümek ve üremek için gerekli miktarda besin elde etmek için dengeli bir diyete bağımlıdır¹. Ne ve ne kadar yiyeceğinin seçimi, tokluk seviyesi gibi hayvanın iç durumu ve gıda kalitesi2 ,³,^4,5gibi çevresel koşullarla ilgili çok sayıda etkileşim faktöründen etkilenir. Protein ve karbonhidratlar iki ana makro besin maddesidir ve hayvanların fizyolojik süreçlerini sürdürmek için dengeli alımı esastır. Bu nedenle, beslenme davranışlarını kontrol eden ve bu makro besinlerin dengeli bir şekilde alımını sürdüren sinir mekanizmalarının anlaşılması son derece önemlidir. Bunun nedeni, yaşam süresi, doğurganlık ve metabolik sağlık gibi yaşam öyküsü özelliklerinin protein alımı 6^,7 ,^8,9,10seviyelerinden doğrudan etkilenmesidir.

Memeliler de dahil olmak üzere karmaşık hayvanlarla evrimsel olarak korunmuş beslenme alışkanlıkları sergileyen daha basit daha çekişli organizmaların kullanımı bu tür çalışmalar için gereklidir. Daha da önemlisi, bu daha basit hayvan modelleri, karmaşık biyolojik soruları maliyetli, etik ve teknik olarak daha etkili bir bağlamda incelerken iyi bir fırsat sağlar. Son yıllarda, Drosophila, güçlü genetik araç seti, karmaşık ve basmakalıp davranışı ve memeliler ile periferik ve besin algılama mekanizmalarının korunmuş mimarisi ile davranışsal nörobiyologlar için verimli bir model olmuştur¹¹. Sonuçta, umut, bu hayvanda yiyecek alımının nasıl düzenlendiğini anlayarak, daha basit bir sinir sistemiyle, daha sonra insan yeme bozukluklarının altında kalan nöronal arızaları çözebilmemizdir.

Beslenme davranışları için nöronal substratların incelenmesi, nöronal aktivitelerini manipüle ederken hayvanların yiyecek alımını aynı anda ölçebilmeye derinden bağlıdır. Yutulmuş minimum miktarda yiyecek nedeniyle, sinekler tarafından yenen yiyecek miktarını ölçmek son derece zordur ve şu anda mevcut olan tüm yöntemler önemli sınırlamalar sunun. Bu nedenle, altın standart tamamlayıcı metodolojilerin bir kombinasyonunu kullanmaktır¹². Yetişkin sinekler tarihsel olarak genetik ve davranışsal bir model olarak tercih edilmiştir. Bununla birlikte, Drosophila larvaları, beslenme davranışını kodlayan nöronal substratları araştırmak için fırsatlar da sunar. Yaklaşık 12.000 nöron içeren larva merkezi sinir sistemi (CNS), yaklaşık 150.000 nöron içeren yetişkinden önemli ölçüde daha az karmaşıktır. Bu düşük karmaşıklık sadece sayısal değil, aynı zamanda işlevseldir, çünkü larva davranışları daha basit lokomotif işlevlerine ve duyusal sistemlere dayanır. Sinir sistemlerinin belirgin basitliğine rağmen, larvalar hala tam beslenme davranışları sergiler ve Drosophila larvalarında gıda yutulmasını ölçmek için bazı yöntemler^{tanımlanmıştır 5,13,14,15}. Nöronal aktivite manipülasyonları ile eşleştirerek, Drosophila larvaları gıda alımının sinirsel düzenlemesini anlamak için oldukça çekişli bir model oluşturabilir.

Burada, farklı makro besin kalitesinde diyetlere maruz kalan larvalarda gıda alımını ölçmek için ayrıntılı bir protokol verilmiştir. Makro besin dengeleme diyetleri olarak adlandırılan diyetler, protein ve karbonhidrat içeriğinde, özellikle proteinden karbonhidrata (P:C) oranlarına göre farklılık göstermiştir: Şekil 1A'da gösterildiği gibi 1:1 (protein bakımından zengin diyet), 1:4 (ara diyet) ve 1:16(proteinden fakir diyet). Kısaca, mavi bir gıda boyası ile boyanmış bu üç izokalorik sakkaroz mayası (SY) bazlı diyet kullanılarak nicel bir seçimsiz beslenme tahlili kuruldu. Maya özü ve sakkaroz protein ve karbonhidrat kaynakları olarak kullanıldığından ve her ikisi de karbonhidrat içerdiğinden, daha önce¹⁶ olarak açıklandığı gibi ve Şekil 1B'debelirtildiği gibi, bu iki bileşenin dengesi değiştirilerek P:C oranlarında değişim elde edilmiştir. Ana deneysel adımları gösteren protokole şematik bir genel bakış Şekil 2'de mevcuttur.

Bu protokol, farklı P:C oranlarındaki diyetlerde ve termogenetik nöronal ekran bağlamında larva besleme seviyelerinin düzenlenmesinde spesifik nöronal popülasyonların rolünü araştırmak amacıyla kurulmuştur. Geçici Reseptör Potansiyeli (TRP) ailesinden iyi karakterize edilmiş bir nörogenetik araç kullanıldı: Drosophila Geçici Reseptör Potansiyel kanalı (dTRPA1), bir sıcaklık ve voltaj kapılı katyon kanalıdır, ortam sıcaklıkları 25 °C^17'ninüzerine çıktığında eylem potansiyellerinin ateşlenmesine izin verir. dTRPA1 transgene'i ifade etmek için, Janelia Araştırma Kampüsü^18,19'dakiFlyLight projesi kapsamında Rubin laboratuvarında kurulan Drosophila genomundan cis-düzenleyici bölgelere dayanan Gal4 hatlarından yararlandık.

Burada açıklanan protokol bir aktivasyon ekranı bağlamında kurulmuş olsa da, deneyci tarafından diğer özel ihtiyaçlara veya ilgi alanlarına kolayca uyarlanabilir, yani sıcaklığa duyarlı nöronal susturucu ShibireTS²⁰kullanarak bir bastırma ekranı gerçekleştirmek için dTRPA1'e alternatif olarak. Bu ve diğer uyarlamalar protokol ve tartışma bölümlerinde ele alınmıştır.

Protocol

1. Sakkaroz mayası (SY) diyetlerinin hazırlanması

1. Makro besin dengeleme ve L3 yetiştirme diyetleri için tüm kuru malzemeleri (agar, maya, sakkaroz) tartın. 1 L yiyecek hazırlamak için gereken bileşenlerin her biri için gram olarak miktarlar Şekil 1B'debelirtilmiştir.
   NOT: 60 mm'lik bir Petri kabını doldurmak için yaklaşık 13 mL yiyeceğe ihtiyaç duyulduğunu göz önünde bulundurun.
2. Tüm malzemeleri steril damıtılmış suda çözün (yiyecekleri hazırlamak için gereken toplam su hacminin yaklaşık% 50'sini kullanın) ve ortamı 5-10 dakika karıştırın.
3. 50 dakika boyunca otoklav.
4. Ortamların soğumasına izin verdikten sonra, diyetlere sırasıyla% 3 ve% 0.3'lük son konsantrasyonda (v / v) nipagin ve propiyonik asit çözeltileri ekleyin. Makro besin dengeleme diyetlerine, mavi gıda boyasını% 1'lik son konsantrasyona (v / v) ekleyin. Damıtılmış su ile toplam hacimleri tamamlayın.
5. Yiyecek diyetlerini 60 mm Petri yemeklerine dikkatlice dökün, böylece dökülen yiyecek miktarı tabakların her birinde yaklaşık olarak aynıdır. Tabakları diyetlerin P:C oranlarıyla etiketle.
   NOT: Beslenme tahlil gününde makro besin dengeleme diyetlerini hazırlayın. Mümkün değilse, hazırlanan diyetleri 4 °C'de, kapalı bir kapta maksimum 3 gün boyunca saklayın. Daha uzun depolama süreleri diyeti çok kuru ve sert hale getirir ve larvalar ortama yuva yapamaz.

2. Ebeveyn çizgilerinin genetik çaprazı

NOT: Genetik haçları ayarlamak için Gal4/UAS sistemi^21'i kullanın. Bu protokolde, belirli nöronal popülasyonlarda nöronal fonksiyonu etkinleştirmek için, UAS dTRPA1 hattı^17'nin dişi bakireleri kullanılmış ve Janelia Gal4 çizgilerinden erkeklere geçmiştir (Şekil 2A). Kullanılan genetik kontrol, dTRPA1 hattı ile Rubin Gal4 koleksiyonunu oluşturmak için kullanılan vektörde Gal4 taşıyan ancak düzenleyici bir parça bulunmayan "boş GAL4" çizgisi arasındaki bir haçın soyuydu (attP2)²². Nöronal baskılamayı teşvik etmek için dTRPA1 yerine ShibireTS²⁰ kodlu bir UAS hattı kullanılabilir.

1. Bazı aktif maya macunu ile desteklenmiş L3 yetiştirme diyet plakaları ile 60 mm embriyo toplama kafesleri kurun.
2. 5-8 günlük yetişkin UAS dTRPA1 dişi bakireleri ve Janelia Gal4 erkeklerini embriyo toplama kafeslerine aktarın ve çiftleşmenin 24-48 saat boyunca, 25 °C'de, % 60 nem ve 12:12 açık-karanlık döngü ile gerçekleşmesine izin verin (Şekil 2A). 60 mm embriyo toplama kafesleri için haç başına yaklaşık 100 bakire dişi ve 30 erkek kullanın.
3. Çiftleşme döneminin sonunda, genetik haçlarda kullanılan L3 yetiştirme diyet plakalarını çıkarın ve atın. Yumurta döşemelerini ve larva evrelemelerini gerçekleştirmek için taze L3 yetiştirme diyet plakaları ile değiştirin.

3. Üçüncü instar larvaların hazırlanması (L3)

1. Çift kişilik yetişkin sinekleri taze L3 yetiştirme diyet plakalarına aktarın ve yumurtlamanın 25 °C'de 3-4 saat boyunca gerçekleşmesine izinverin (Şekil 2B). Tüm tabakların diyetin genotipi, P:C oranı ve yumurtanın yumurtlama tarihi ile etiketli olduğundan emin olun.
   NOT: Zaman kazanmak için, yumurtaların ekstra işlenmesini önleyen L3 yetiştirme diyetine doğrudan yumurta döşemeyi gerçekleştirin. Küçük ölçekli genetik taramalarda elma suyu agar plakaları kullanılarak yumurtlamanın optimizasyonu elde edilebilir.
2. Yumurtlama döneminin sonunda, plakaları kafeslerden çıkarın ve plastik kapaklarla örtün. L3 yetiştirme plakalarını desteklemek için maya özü kullanılması durumunda, yumurtlamanın sonundaki tüm artık mayaları çıkardığınızdan emin olun. Bu, larva büyümesi sırasında düzgün olmayan beslenmeyi önlemek için önemlidir.
   NOT: Çift kişilik yetişkinler taze L3 yetiştirme diyet plakalarına aktarılabilir, böylece daha fazla yumurta bırakma işlemi yapılır ve daha deneysel larvalar elde edilebilir. Ardışık yumurta bırakmaları, tüm çalışma haftası boyunca aynı yetişkinlerle yapılabilir.
3. Plaka başına yumurta sayısını tahmin edin ve larva yoğunluğunu plaka başına maksimum 200 embriyoda tutun. Bu tahmin, plakanın dörtte birinde embriyo sayısı sayılarak yapılabilir.
   NOT: Aşırı kalabalık bir plaka larva gelişimini geciktirecek ve larva besleme davranışlarını etkileyecektir.
4. L3 yetiştirme plakalarını 18 °C 'de (izin verilen sıcaklık), % 60 nem ve 12:12 açık-karanlık döngüde kuluçkaya bırakın ve larvaların 9 gün boyunca büyümesine izin verin(Şekil 2B).
5. Yumurtlamadan sonraki dokuzuncu günde (AEL), test edilecek genotiplerin her birinden (ve çoğaltmalar için) 10 L3'lük üç grup toplayın. Ayrıca, "sıfır boyalı gıda" kontrolü için 10 L3'lük grupları toplayın. Larva toplamanın, yumurta döşemesini yapmak için kullanılan günün eşdeğer zaman dönemlerinde yapıldığından emin olun (örneğin, yumurtlama 10:00-14:00 arasında gerçekleştiyse, larvaları aynı süre boyunca toplayın 9 gün AEL) ve mümkün olduğunca hafifçe, #5 veya tüy sıklet tokaları kullanılarak gerçekleştirilir. Larvaları bir sonraki adımda belirtildiği gibi doğrudan aktarın (3.6).
   NOT: "Sıfır boyalı gıda" kontrol hayvanları, beslenme testinde mavi boya olmadan yiyecek verilen larvalardır. Bu kontrol, larva özlerinin arka plan emiciliğini gidermek için zorunludur.
6. Toplanan deneysel larvaları 1 mL su içeren plastik çanak ağırlık teknelerine aktarın. Şekil 3'te verilen talimatları izleyerek L2'nin değil, L3'üntoplandığından emin olun.
   NOT: L3'ün su veya 1x Fosfat tamponlu salin (PBS) içeren plastik teknelere toplanması, larvaların beslenme testine başlamadan önce iyi nemlendirilmesini sağlamak için önemlidir. Bu, özellikle farklı genotiplerden birkaç deneysel L3 grubu aynı anda toplanıyorsa önemlidir. Her grup için toplama sırasını takip edin, böylece her grup için yiyecek yoksunluğu süresindeki farklılıklar en aza indirilsin. Bu adımda plastik teknelerin kullanımı, larvaların doğrudan su banyosuna yüzmesini sağladığı için isteğe bağlı adım 4.3'ün kullanılmasını kolaylaştırır.

4. Termogenetik aktivasyon ve seçeneksiz besleme tahlilleri

NOT: Sirkadiyen ritimlerle ilgili olası varyasyonları en aza indirmek için beslenme testlerinin günün yaklaşık aynı saatinde yapılması önerilir. Ayrıca, her zaman kontrol deneylerini çalıştırın ("boş Gal4" hattının soyu UAS dTRPA1 ve "sıfır boyalı gıda" larvalarına geçti), ilgi genotiplerine paralel olarak.

1. 30 °C'ye (izin vermeyen sıcaklık) bir inkübatör kurun ve yüksek nem seviyelerini (en az% 65) koruyun test sırasında larva dehidratasyonunu önlemek için.
2. Besleme testini başlatmadan önce, test plakalarının sıcaklığını 30 ° C'de 30 dakika ısıtarak dengelayın.
3. (İsteğe bağlı) Deneysel larvaları 37 ° C su banyosunda 2 dakika ısı şoku. Bu adımı, biraz su içeren plastik ağırlık teknelerindeki hayvanlarla gerçekleştirin.
   NOT: Bu adımın amacı, beslenme testinin başlangıcından itibaren nöronların ateşini teşvik ederek nöronal aktivasyonu yoğunlaştırmaktır.
4. Birden fazla zamanlayıcıyı 1 saat boyunca hazır tutun. Kullanılacak zamanlayıcı sayısı, test edilen deney gruplarının sayısına ve deneycinin larvaları ele almadaki beceriklilik seviyesine bağlıdır.
   NOT: Birden çok zamanlayıcının kullanımı, tahlil süresini tüm genotipler için tutarlı tutmak için kritik öneme sahiptir.
5. Suyu plastik teknelerden dikkatlice boşaltın ve nemlendirilmiş yumuşak bir fırça kullanarak L3 gruplarını teknelerden tahlil plakalarının ortasına hafifçe aktarın. Plakaların kapaklarını geri koyun ve doğru 1-h besleme seanslarını korumak için her plaka (veya plaka grubu) için bir zamanlayıcı başlatın.
6. Larvaların karanlıkta 30 °C'de 1 saat boyunca beslenmesine izin verin (Şekil 2C).
   NOT: Testlerin karanlıktaki performansı, diyetler aynı boya konsantrasyonunu içermelerine rağmen tonlarda farklılık göstereceğinden, diyetler arasındaki görsel ipuçlarındaki farklılıkları kontrol etmek için önemlidir.
7. Plakaları bir buz banyosuna aktararak besleme testini durdurun. Plakalar için sabit bir yüzey sağlamak için mümkün olduğunca buzu bastırın.
   NOT: Soğuk sıcaklıklar, yuvalama ve kazma davranışlarını engelleyerek beslenmenin sonunu teşvik edecektir. Larvaların çoğu birkaç dakika sonra yemek tabaklarını yüzeye çıkarır ve aşağıdaki adımlarda iyileşmelerini kolaylaştırır.

5. Gıda boyası ekstraksiyonu

1. Test edilen her 10 L3 grubu için yaklaşık aynı miktarlarda 0,5 mm cam boncuk (mikrotüp alt kısmını dolduracak kadar) ve 300 μL buz gibi metanol içeren 2 mL mikrotüpler hazırlayın. Mikrotüpleri soğukta tutun, tezgah soğutucusu kullanarak.
   DİkKAT: Metanol oldukça yanıcı ve toksiktir. İyi havalandırılmış bir alanda çalışmak ve nitril eldiven giymek de dahil olmak üzere bu reaktifin kullanımı için önerilen tüm güvenlik prosedürlerini izleyin.
   NOT: Metanol kullanımı larva örneklerini düzeltmek ve kıtiküldeki melanizasyon reaksiyonlarını önlemek için önemlidir.
2. #5 veya tüy sıklet-toparlama kullanarak, 10 L3'lük grupları besleme tahlil plakalarından dikkatlice kurtarın ve bir miktar su içeren test plakalarının kapaklarına aktarın. Larvaları durulayarak vücutlarındaki yiyecek kalıntılarını temizleyin ve herhangi bir yaralanmayı önlemek için larvaları nazikçe ele alın. Larva başına ortalama yiyecek alımı miktarının ölçülebilmesi için, çoğaltma başına her genotip için kurtarılan larva sayısının bir kaydını tutun.
   NOT: Yaralı larvalar, melanizlenmiş kütiküllere sahip olacakları için, kolorimetrik niceleme için uygun olmadıkları için atılmalıdır.
3. L3 gruplarını 5.1'de hazırlanan 2 mL mikrotüplere aktarın.
4. 5.1 adımında eklenen bir doku lyzer ve cam boncuk kullanarak mekanik bir lizis yöntemiyle gıda boyasını bağırsaklardan çıkarmak için larva dokularını Lyse. (bir doku lyzer mevcut değilse, homojenleştirici bir pestle kullanın). Tercihen, bu adımı 4 °C'de gerçekleştirin (Şekil 2D).
   NOT: Bu adımın süresi kullanılan ekipmana bağlı olacaktır. Geleneksel bir doku likörü kullanarak, 1 dk ekstraksiyon yeterlidir. Zaman daralması durumunda, protokol bu adımın sonunda duraklatılabilir ve daha sonra devam edilebilir. Numuneleri -20 °C'de saklayın.
5. 2 mL mikrotüpleri doğrudan yeni 1,5 mL mikrotüplere ters çevirerek özleri 1,5 mL mikrotüpleri temizlemeye aktarın. Hafifçe gerçekleştirilirse, cam boncukların çoğu 2 mL mikrotüplerin dibinde kalacaktır.
6. Özleri 4 °C'de 10 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyarak hücresel kalıntıları temizleyin.
7. 1,5 mL mikrotüpleri temizlemek için süpernatantları toplayın. Hücresel döküntüler süpernatantlarda hala görünüyorsa, 5.6 ve 5.7 adımlarını yineleyin.

6. Gıda tüketiminin kolorimetrik nicelemesi

1. Başlangıç mavisi boya çözeltisinin metanolünde seri 1:2 seyreltmeler gerçekleştirerek kalibrasyon eğrisi oluşturmak için standart çözümler hazırlayın. Boş olarak, yalnızca metanol kullanın. Standartların konsantrasyonu, hayvanların yiyecek alım seviyelerine bağlıdır.
   NOT: Burada sunulan pilot ekran durumunda, larva özleri için elde edilen boya konsantrasyonları 0,02 ila 1,93 μL/mL arasında değiştiğinden, metanoldeki 2 μL/mL mavi boya çözeltisinin 8 seri seyreltmesinin emicilerinin ölçülmesiyle elde edilen standart bir eğri kullanılmıştır. Gerekirse, deneysel örneklerin boya konsantrasyonuna bağlı olarak bu çözeltilerin konsantrasyonunun artması veya azaltılması.
2. Deneysel örneklerin 100 μL'sini (adım 5.7'de elde edilir), standartları ve boşu (adım 6.1) 96 kuyulu bir mikro plakanın kuyularına aktarın ve bir plaka okuyucu kullanarak emiciliği 600 nm olarak ölçün (Şekil 2E). Arka plan emiciliğini gidermek için, mavi boya olmadan yiyeceklerle beslenen larvalardan elde edilen özlerin emiciliğini larva özleri için "sıfır" olarak ölçün ("sıfır boyalı gıda kontrolü).
3. Standart bir eğri oluşturun ve her deneysel larva grubundan numuneler için elde edilen absorbans değerlerini gıda alımı miktarıyla (mL'deki hacim) ilişkilendirin. 5.2 adımında her grup için toplanan larva sayısını dikkate alarak larva başına ortalama gıda tüketimini bulun

Results

Drosophila larvaları, fazla karbonhidratları alma pahasına protein alımlarını düzenler²³ (Şekil 2E'dekişematik arsa). Aslında, protein alımının bu önceliklendirmesi diğer birçok hayvanda gözlenmiştir ve^{proteinin 24,25}.

Bu sağlam beslenme davranışsal tepkiden yararlanarak, makro besin dengelemesinde yer alan nöronal popülasyonları tanımlamayı amaçlayan davranış tabanlı bir e...

Discussion

Bu protokolle, farklı P:C bileşimindeki diyetlere maruz kaldığında, iki ana makro besin olan protein ve karbonhidratların alım seviyelerini düzenlemek için belirli nöronal popülasyonların termogenetik aktivasyonu altındaki larvaların yeteneğini test edebilirsiniz. Bu yöntem, farklı makro besin kalitesindeki diyetler arasında gıda alımının kontrolü ile ilişkili nöronal popülasyonları tanımlamayı amaçlayan bir larva ön taraması bağlamında test edildi. Bu çalışma ayrıca Drosophila larvalarının besin homeostazına ba...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 mL mikrotüpler	Sarstedt AG & Co.	72.690.001
10xPBS	Nytech	MB18201
2.0 mL mikrotüpler	Sarstedt AG & Co.	72.695.500
60 mm petri kabı	Greiner Bio-one, Avusturya	628161
96 kuyulu mikroplaka	Santa Cruz Biyoteknoloji	SC-204453
Agar	Pró-vida, Portekiz
Tezgah üstü soğutucu	Nalgene, ABD	Labtop Soğutucu 5115-0032
Mavi gıda boyası	Rayner, Billingshurst, Birleşik Krallık
Hücre bozulma ortamı	Scientific Industries, Inc.	888-850-6208	(0,5 mm cam boncuklar)
Çanak ağırlık tekneleri	Santa Cruz Biotechnology	SC-201606
60 mm petri kapları için embriyo toplama kafesi	Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK	FLY1212 (59-100)
Tüy ağırlığı forseps	BioQuip Products, USA	4750
Stok bakımı			için sinek yemi1 L gıda şunları içerir: 10 g Agar, 100 g Maya Özü, 50 g Sükroz, 30 mL Nipagin, 3 mL propiyonik asit
Forseps # 5	Dumont	0108-5-PS	Standart uçlar, INOX, 11cm
Kuluçka Makinesi	LMS Ltd, İngiltere	Seri 2, Model 230	Termogenetik besleme deneyi için (30? C)
Kuluçka makinesi	Percival Scientific, ABD	DR36NL	Larvaları sahnelemek için (19? C)
Janelia hatları	Janelia Araştırma Kampüsü		Tablo 2'de ayrıntılı bilgi
Makrobesin dengeleyici diyetler			Şekil 1'deki bileşim ve beslenme bilgileri
Metanol	VWR	CAS numarası: 67-56-1
Nipagin (Metil 4-hidroksibenzoat)	Sigma-Aldrich	H5501
Nitril eldivenler	VWR, ABD
Soğutmalı santrifüj	Eppendorf, Almanya	5804 R / Seri numarası: 5805CI364293
Rubin Gal4 ines	Janelia Araştırma Kampüsü		Stoklar Bloomington Drosophila Stok Merkezi'nde mevcuttur
ShibireTS UAS hattı	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	BDSC numarası: 66600	Carlos Ribeiro Group tarafından sağlanmıştır
Yumuşak fırçalar			Anestezi uygulanmış meyve sineklerini ayırmak için
Spektrofotometre plaka okuyucu	Thermo Fisher Scientific	Multiskan Go 51119300
Stereo mikroskop	Nikon	1016625
Sucrose	Sidul, Portekiz
Üçüncü instar larva (L3) yetiştirme diyeti			Şekil 1'deki kompozisyon ve beslenme bilgileri
Zamanlayıcı
Doku lyzer / boncuk çırpıcı	MP Biomedicals, ABD	FastPrep-24 6004500
TRPA1 UAS hattı	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	BDSC numarası: 26264	UAS kontrolü altında TrpA1'i eksprese eder; 25 ° C'de deneysel olarak nöronları aktive etmek için kullanılabilir mi? C
Su banyosu	Sheldon Manufacturing Inc., ABD	W20M-2 / 03068308 / 9021195
Maya özü	Pró-vida, Portekiz		%51 Protein, %15 Karbonhidrat