Nöromüsküler Analizler için Sıçan Vokal Kıvrımının Hazırlanması

Sıçan larinksi, gelişim, yaşlanma, hastalık ve farmakolojik ajanlara yapısal ve fonksiyonel nöromüsküler laringeal adaptasyonları araştırmak için iyi kurulmuş bir modeldir1,2,3,4,5. Histolojik yöntemlerin tutarlılığı, kas hazırlama ve analizinde birden fazla incelik olduğu gibi gırtlağı kıkırdaklar içinde kapsüllenen kasların gırtlağı boyutu, şekli ve topografyası ile ilgili zorluklar olduğu için bu iş kolu için kritik öneme sahiptir1,6,7,8,9,10,11 . Sıçan içsel gırtlağım kaslarının küçük boyutu nedeniyle, tutarlı ve doğru sonuçlar elde etmek için sistematik gömme, dondurma ve kriyoseksiyon kritik öneme sahiptir. Örneğin, sıçan ses kıvrımını koronal düzlemde bölümlerken, içsel gırtlağı kaslarının dördünün nöromüsküler kavşakları (NMJs) doku derinliğinin 1,8 mm'den daha az içinde ^bulunur11. Bu nedenle, kriyoseksiyon sırasında gırtlaj kas anatomisinin hassas bir şekilde izlenmesi, ilgi alanlarını doğru bir şekilde tanımlamak ve dokunun aşırı bölümünü önlemek için zorunludur. Hedef kasın aşırı gözden belirlenmesi, NMJs11'in sayısının ve topografyasının yanlış tanımlanmasına neden olabilir veya hedef kas dönüm noktası oryantasyon karışıklığı nedeniyle atılırsa örnek boyutunda genel azalmalara neden ^olabilir12. Laringeal kasların ve ilgili adaptasyonlarının incelenmesi için yeni modeller geliştirildiği için, sonuçların kesin, güvenilir ve çalışmalar arasında tekrarlanabilir olmasını sağlamak için standart çalışma prosedürleri gereklidir.

Bu makalenin amacı, sıçan vokal kıvrımının optimal boyuna ve kesitsel analiz için hazırlanmasını detaylandırmaktır. Kriyoseksiyon sırasında hedef kas yer işaretlerini belirlemek için laboratuvarımızda düzenli olarak kullanılan ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır. Benzer yöntemler birkaç laboratuvarda kullanılsa da, acemi araştırmacılar tarafından uygulandığında güvenilir ve doğru replikasyon sağlamak için burada literatüre göre daha fazla ayrıntı sağlanmaktadır. Bu öğreticinin amacı, laboratuvarlar ve araştırmalar arasında tutarlılığı artırmak için sıçan vokal kıvrımının immünohistokimyasal (IHC) değerlendirilmesi için standart bir metodoloji sağlamaktır.

Bu çalışma New York Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'ne uygun olarak gerçek gerçekleştirildi.

1. Sıçan larinksi diseksiyon

1. Kurumsal olarak onaylanmış protokole göre sıçanı ötenazi edin. Doku örneklerinde kürk kirlenmesini önlemek için ventral boynu mandibuladan manubriuma tıraş edin ve alkolle sürün.
2. 10x büyütmeli bir diseksiyon dürbün altında, nefes borusu açığa çıkına kadar neşterle orta hat boyun kesisi oluşturarak tüm larinksi kesinleştirin.
3. Dış dıştrinsik gırtlaj kaslarını orta çizgide ayırarak, karaçamı, önps ve diseksiyon makası veya neşter kullanarak ortaya çıkarır.
4. Trakea kaudalini üçüncü trakeal halkaya kesin ve diseksiyon makası kullanarak tüm larinksi çıkarmak için hyoid kemiğine bir kesi rostral yapın.
5. Dışsal gırtlak dokularını (yemek borusu, tiroid bezi ve dıştrinsik gırtlak kasları) büyütme altında mikrodiseksiyon araçları (cımbız, pim ve mikros makas) kullanarak gırtlaktan çıkarın.
6. Mikroscisörlerle, arka krikoarytenoid kasları arasındaki orta çizgiyi bir dönüm noktası olarak kullanarak gırtlağı arytenoidler arasında dorsally olarak ikiye ayırın. Ses kıvrımlarını ortaya çıkarmak için larinksin yanal duvarlarını sabitleyin ve daha sonra mikroscisörlerle ses kıvrımlarının ön komiseri arasındaki tiroid kıkırdayının orta çizgisi boyunca ventral olarak ikiye ayırın (Şekil 1).
   NOT: Bu adım isteğe bağlı olabilir; larinksi bütün tutmak için atlanabilir. Laringlerin bizeksiyonu, aynı larinksin sağ ve sol taraflarını ayrı ayrı kullanarak birden fazla immünostainasyon tekniğine izin verir.
7. Her bir hemi-gırtlağı fosfat tamponlu çözeltide (PBS) ~10 s durulayın ve donma sırasında buz kristali oluşumunu azaltmak için bir görev silecek ile hassas bir şekilde kurulayın.

2. Largeal dokuyu düzeltin ve/veya flaş dondurun

NOT: Fiksasyon tüm immün sistemi baskılama protokolleri için ideal olmayabilir. Genellikle laringeal dokular diseksiyondan hemen sonra flaş donmuş tazedir. Fiksasyon yapmadan laringeal dokuyu flaş dondurmak için adım 2.1'i atlayın.

1. Hemi-larynges sabitlemek için dokuları PBS'de% 4 formaldehit ile dolu santrifüj tüpüne 70 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda oda sıcaklığında 1 saat yerleştirin. Dokuları temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve PBS'de 20 dakika boyunca 3x durulayın. Daha sonra temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C'de% 20 sakkaroz /% 5 gliserol çözeltisine (~ 18 saat veya doku batana kadar) batırın.
   DİkKAT: Formaldehit tehlikelidir ve uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla birlikte duman kaputunda kullanılmalıdır.
2. Tüm hemi-larynges'i düzgün bir konuma, optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği ile dolu bir kriyo kalıbına yerleştirin. Hemilarynx için, ses kıvrımının medial yüzeyine sahip dokuyu kriyodoldun altına ve vokal kıvrımının boyuna yönüne kriyomold açıklığının alt kenarına paralel olarak yerleştirin. Tüm larynges için, arka krikoarytenoidler kriyooldun altına ve kriyomold açıklığının alt kenarına paralel olarak vokal kıvrımının boyuna yönüne bakan dokuyu yerleştirin.
   NOT: OCT bileşiği içindeki tutarlı gırtlaj yönelimi, sıçan vokal kıvrımının kriyoseksiyonu için kritik öneme sahiptir. Hemilarynx gömülüp dondurulduktan sonra, yönünü değiştirmek için çözülmelidir, böylece birden fazla çözülme-donma döngüsünden doku hasarı riskleri ortaya getirilmelidir.
3. Sıvı nitrojenle çevrili çelik bir beherde soğutulmuş izopentan (2-metilbütan) kullanarak flaş donduran dokular.
   NOT: Beherin yanlarında ve dibinde beyaz çökeltiler oluşmaya başladığında izopentan doku dondurma için en uygun sıcaklığa ^ulaşır13. Izopentan, sıvı nitrojenden daha yüksek bir termal iletkenliğe sahip olduğu için kullanılır, bu da hızlı donma sırasında doku bloğunun çatlamasını önlemeye yardımcı olur. OTC'deki donma dokusunun daha ayrıntılı bir açıklaması için Kumar ve ^ark.13'e bakın.
4. Her kalıbı önceden etiketlenmiş folyoya sarın ve dehidrasyonu önlemek için ayrı bir dondurucu torbasına yerleştirin ve -80 °C dondurucuda saklanmak üzere transfer edilene kadar hemen kuru buzda saklayın.

3. Kesit düzleminde kriyoseksiyon hemilarynx

1. Kriyostattaki oda sıcaklığını, üretici kılavuzu tarafından kas dokusu kesiti için önerilen sıcaklık aralığının (15−25 °C) ortasındaki -20 °C'ye ayarlayın.
2. Kriyostat kesit kalınlığını 10 μm kalınlığında bölümlere ayarlayın.
   NOT: Kas lifi kesit analizi için, 10 μm kalınlığındaki bölümler, fiber tipleme analizi için etiketli kas liflerinin tam boyama ve sağlam görüntüleme yoğunluğuna izin vermek için en uygun bölümlerdir14,15,16. Bazı protokoller nöromüsküler hedeflere bağlı olarak farklı kesit kalınlığı gerektirebilir.
3. Dokuları kriyostat odasına aktarın, kriyostat numune diskine (chuck) düzgün bir OCT bileşiği katmanı ekleyin ve gömülü doku bloğunu örnek diskteki OCT bileşiğin üzerine yerleştirin. Tirarytenoid (TA) kas lifi analizi için vokal kıvrımının kesitlerini elde etmek için, numuneyi aynaya yapıştırın, böylece ventral tiroid kıkırdağı kriyostat bıçağına ve arytenoid kıkırdak örnek diske bakacaktır.
   NOT: OCT bileşiği dondurulduğunda beyaz ve opak hale geldiğinden, bu yer işaretlerinin bu aşamada görünmediğini belirtmek önemlidir. Bu görünürlük eksikliği, flaş dondurma aşamasında hemilarynx'in yönünü not etmenin kritik öneme sahip olmasının nedenidir.
4. Tiroid kıkırdantının ventral kısmı görünene kadar numune kafasını 100 μm ilerleterek OCT bileşiği kırpın.
5. Daha sonra tiroid kıkırdılmasının başlangıcından lamina propria, medial TA kasları ve lateral TA kası açığa çıkarana kadar 30 μm kesitleri kırpın ve izleyin.
   NOT: Gırtlağı simgesel yapılar izlenmeli ve kesit açısının eğik olmadığından emin olmak için tiroid kıkırdajının başlangıcından itibaren her 100 μm'de bir not edilmelidir. Şekil 2 , kesit düzlemdeki iki laringeal yer işareti kümesini 10x büyütmede temsil eder.
6. Hedef TA kasına ulaşıldıktan sonra, 10 μm'de pozitif yüklü slaytlarda bölümler toplayın.
7. Lekelendirilmeye hazır olana kadar nemi korumak için bölümleri PBS'de 4 °C'de saklayın.
   NOT: Sabit doku IHC hedefine bağlı olarak PBS'de bir haftaya kadar saklanabilirken, düzeltilmemiş doku derhal işlenmelidir.

4. Boyuna düzlemde kriyoseksiyon hemilarynx

1. Kriyostat odası tekrar -20 ° C'ye ayarlanmışken, kesit kalınlığını 30 μm'ye değiştirin.
   NOT: NMJ analizi için, sinir terminali veya motor plakasının parçalanması olmadan gırtlaj kasları içindeki birkaç tam NMJ'yi yakalamak için 30−60 μm arasında bir doku kalınlığı ^{kullanılabilir11,12,17}.
2. TA kasının NMJ analizi için boyuna vokal katlama bölümleri elde etmek için, numuneleri aynaya yapıştırın, böylece epiglottis kriyostat bıçağına ve trakeal lümen numune diskine doğru aşağı doğru yönelir.
3. Tiroid kıkırdağı görünene kadar numune kafasını 100 μm ilerleterek OCT bileşiği kırpın.
4. Tiroidin başlangıcından TA kasının lamina propria ve medial ve lateral bölünmelerine kadar 30 μm'lik bölümleri kırpın ve izleyin.
   NOT: Boyuna düzlemdeki beş laringeal yer işareti seti, doku derinliğinin hedef TA kasına doğru ilerlemesini izlemek için önerilir. Şekil 3 , 10x büyütmede boyuna düzlemdeki laringeal işaretleri temsil eder.
5. Hedef TA kasına ulaşıldıktan sonra, 30 μm'de pozitif yüklü slaytlarda bölümler toplayın.
6. Lekelendirilmeye hazır olana kadar nemi korumak için bölümleri PBS'de 4 °C'de saklayın.

Temsili sonuçlar, vokal egzersizinin laringeal nöromüsküler sistem üzerindeki etkilerinin devam eden bir araştırmasının bir parçasıydı. 29 erkek Fischer 344/kahverengi Norveç sıçanı (12 9 aylık, 17 24 aylık) CO2 inhalasyonu ve ardından bilateral torakotomi ile tartıldı ve ötenaziye tabi tökezlendi.

Prosedürler, lateral ve medial TA kaslarının NMJ'leri ve lif boyutunu etiketlemek için belirtilen protokolü izledi. Gırtlağı simgesel yapıları arasındaki mesafe, kriyoseksiyon sırasında ilerlemeyi belirlemek için gırtlağı kasları ve çevresindeki kıkırdaklar kullanılarak hem boyuna hem de kesitsel düzlemlerde izlendi (Tablo 1). İzleme, tiroid kıkırdajının her iki yönlü düzlemde ilk görünümünde başladı. Şekil 2, medial TA kası ve lamina propriası öncesinde ortaya çıkan tiroid ile zamansal sırada kesit kriyoseksiyon sırasında gırtlak yer işaretlerinin görünümünü göstermektedir (Şekil 2c,d). Şekil 3, medial TA kası (Şekil 3c,d) ve lamina propria'dan önce ortaya çıkan alar kas (Şekil 3a,b) ile zamansal sırada boyuna kriyoseksiyon sırasında gırtlak yer işaretlerinin görünümünü göstermektedir (Şekil 3e,f).

Her iki yönlü düzlemde, simge yapılar arasındaki mesafeler bireysel hayvanlar için büyük ölçüde değişti.

Ağırlık ve laringeal dönüm noktası görünümlerinde genç sıçanlar için zayıf ila orta korelasyonlar ve yaşlı sıçanlar için zayıf korelasyonlar vardı (Tablo 2 ve Tablo 3). Her düzlemdeki yer işaretleri arasındaki mesafeler, her iki yaş grubu için de orta derecede güçlü bir şekilde ilişkiliydi, ancak iki diseksiyon düzlemi arasında zayıf bir şekilde ilişkiliydi. Bu nedenle, dönüm noktası görünümündeki değişkenlik, laringeal boyuttaki ağırlık veya bireysel varyasyonlarla hesaba katılamadı.

Şekil 1: Arytenoid kıkırdaklar (ArC) arasında dorsally ikiye bölünmüş bir sıçan larinks.
Hemi-larinksin sağ tarafı, Tablo 1'deki beş uzunlamasına simgesel yapıya karşılık gelen uzunlamasına düzlemdeki (LZ1-LZ5) simgesel yapılarla açıklamalandırılmıştır. Hemi-larinksin sol tarafı, sırasıyla yan ta kasının başlangıcına ve vokal kıvrımının tam kesitine karşılık gelen kesit düzleminde (CZ1 ve CZ2) yer işaretleri ile açıklamalı. VF = vokal kıvrımı, CrC = cricoid kıkırdak, AlC = alar kıkırdak ve T1 = ilk trakeal halka. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Laminin kas liflerini ana hatlarıyla belirlemesini takiben brightfield (sağda) ve floresan 488 kanalında (solda) 10x büyütmede iki kesit görüntülenmiştir.
Bölümler (yukarıdan aşağıya) kriyoseksiyon sırasındaki ilerlemeyi, medial TA kasından önce görünen tiroid (a,b) ve vokal kıvrımının lamina propriası (c,d) ile zamansal sırada gösterir. THC = tiroid kıkırdağı, LTA = lateral tiroarytenoid ve MTA = medial tiroarytenoid. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Nöromüsküler kavşaklar için immün yetinmeyi takiben brightfield (sağda) ve floresan 488 kanalında (solda) 10x büyütmede üç uzunlamasına bölüm görüntülenmiştir.
Bölümler (yukarıdan aşağıya) kriyoseksiyon sırasındaki ilerlemeyi, alar kas (a,b) medial TA kasından (c,d) önce ve vokal kıvrımının lamina propriasına (e,f) kadar zamansal sırada gösterir. ALC = alar kıkırdak, ThC = tiroid kıkırdağı, ArC = arytenoid kıkırdak, LTA = lateral tiroarytenoid, MTA = medial tiroarytenoid ve SCA = üstün krikoarytenoid. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Kriyoseksiyon sırasında tiroid kıkırdavunun ilk görünümünden her gırtlağım simgesine kadar μm'deki mesafeler (n = 29).

Tablo 2: Genç erkek sıçanlar için kesitsel (CSA) ve boyuna düzlemlerdeki ağırlık ve laringeal işaretlerin derinliği arasındaki Pearson korelasyonunun sonuçları. LTA = lateral tirarytenoid, MTA = medial tiroarytenoid, SCA = üstün krikoarytenoid ve LP = lamina propria.

Tablo 3: Yaşlı erkek sıçanlar için kesitsel (CSA) ve boyuna düzlemlerdeki ağırlık ve laringeal yer işaretlerinin derinliği arasındaki Pearson korelasyonunun sonuçları. LTA = lateral tirarytenoid, MTA = medial tiroarytenoid, SCA = üstün krikoarytenoid ve LP = lamina propria.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.