Yöntem makalesi

Beyin Yapılarını Hedeflemek ve Kemogenetik Nöromodülasyonu Değerlendirmek için Odaklanmış Ultrason Kaynaklı Kan-Beyin Bariyeri Açılması

4.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61352

⸱

22 Aralık 2020

 , 
1Department of Bioengineering, Rice University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, odaklanmış ultrason kan beyin bariyeri (BBB) açılması, ortaya çıkan gen ekspresyonunun değerlendirilmesi ve histolojik testlerle kemogenetik reseptörlerin nöromodülasyon aktivitesinin ölçülmesi yoluyla gen iletimi için gerekli adımları tanımlar.

Özet

Akustik Hedefli Kemogenetik (ATAC), spesifik nöral devrelerin noninvaziv kontrolüne izin verir. ATAC, odaklanmış ultrason (FUS) ile indüklenen kan-beyin bariyeri açılışı (FUS-BBBO), adeno-ilişkili viral (AAV) vektörlerle gen iletimi ve tasarlanmış, kemogenetik, protein reseptörleri ve bunların akraba ligandları ile hücresel sinyallemenin aktivasyonunun bir kombinasyonu yoluyla bu kontrolü sağlar. ATAC ile tek bir noninvaziv ultrason uygulaması kullanarak hem büyük hem de küçük beyin bölgelerini milimetre hassasiyetinde transdüksiyon yapmak mümkündür. Bu transdüksiyon daha sonra bir ilaç kullanarak serbestçe hareket eden hayvanlarda uzun süreli, invaziv olmayan, cihazsız bir nöromodülasyona izin verebilir. FUS-BBBO, AAV'ler ve kemogenetik birden fazla hayvanda kullanıldığından, ATAC diğer hayvan türlerinde kullanım için de ölçeklenebilir olmalıdır. Bu makale, daha önce yayınlanmış bir protokolü genişletmekte ve karmaşık bir MRG uyumlu FUS cihazına ihtiyaç duymadan, MRG kılavuzluğunda küçük beyin bölgelerine FUS-BBBO ile gen iletiminin nasıl optimize edileceğini özetlemektedir. Protokol ayrıca, herhangi bir laboratuvar tarafından 3D olarak basılabilen ve farklı türler veya özel ekipman için kolayca değiştirilebilen fare hedefleme ve kısıtlama bileşenlerinin tasarımını da açıklar. Tekrarlanabilirliğe yardımcı olmak için protokol, ATAC geliştirmede mikro kabarcıkların, AAV'lerin ve damar delinmesinin nasıl kullanıldığını ayrıntılı olarak açıklar. Son olarak, ATAC kullanan çalışmaların ön araştırmalarına rehberlik etmesi için örnek bir veri gösterilmiştir.

Giriş

Optogenetik 1,2 ve kemogenetik 3,4,5 gibi devreye özgü nöromodülasyon teknolojilerinin kullanımı, nöronal devre bozuklukları olarak psikiyatrik durumları anlamamızı sağlamıştır. Nöronal devrelerin incelenmesi zordur ve beyin bozukluklarının tedavisinde kontrol edilmesi daha da zordur, çünkü tipik olarak belirli hücre tipleri, beyin bölgeleri, moleküler sinyal yolları ve aktivasyon zamanlaması ile tanımlanırlar. Hem araştırma hem de klinik uygulamalar için ideal olarak, bu tür bir kontrol noninvaziv olarak uygulanacaktır, ancak hem kesin hem de noninvaziv nöromodülasyon elde etmek zordur. Örneğin, nöroaktif ilaçlar beyne noninvaziv olarak ulaşabilirken, beyin boyunca hareket ederek uzamsal özgüllükten yoksundurlar. Öte yandan, elektriksel derin beyin stimülasyonu belirli beyin bölgelerini kontrol edebilir, ancak belirli hücre tiplerini kontrol etmekte zorlanır ve ameliyat ve cihaz yerleştirme gerektirir6.

Akustik Hedefli Kemogenetik7 (ATAC), uzamsal, hücre tipi ve zamansal özgüllük ile nöromodülasyon sağlar. Üç tekniği birleştirir: uzamsal hedefleme için odaklanmış ultrason kaynaklı kan-beyin bariyeri açma (FUS-BBBO), hücre tipine özgü promotörlerin kontrolü altında genleri noninvaziv olarak iletmek için adeno ilişkili viral vektörlerin (AAV'ler) kullanımı ve transfekte edilmiş nöral devreleri ilaç uygulaması yoluyla seçici olarak modüle etmek için tasarlanmış kemogenetik reseptörler. FUS, ultrasonun insan beyni de dahil olmak üzere dokuların derinliklerine milimetre uzamsal hassasiyetle odaklanma yeteneğinden yararlanan FDA onaylı bir teknolojidir. Yüksek güçte FUS, esansiyel tremor8 için FDA onaylı bir tedavi de dahil olmak üzere noninvaziv hedefli ablasyon için kullanılır. FUS-BBBO, düşük yoğunluklu ultrasonu, ultrason odağında kan damarlarında salınan sistemik olarak uygulanan mikro kabarcıklarla birleştirir ve BBB9'un lokalize, geçici (6-24 saat) ve geri dönüşümlü açılmasına neden olur. Bu açıklık, kemirgenlerde10 ve insan olmayan primatlarda 15 önemli doku hasarı olmadan proteinlerin 9,10, küçük moleküllerin 11 ve viral vektörlerin7,12,13,14 beyne iletilmesine izin verir. FUS-BBBO16,17 için klinik çalışmalar devam etmekte olup, bu tekniğin olası terapötik uygulamalarını göstermektedir.

AAV kullanılarak viral gen iletimi, CNS bozuklukları için klinik kullanıma doğru hızla ilerlemektedir ve son FDA ve AB düzenleyici onayları önemli kilometre taşları olarak kabul edilmektedir. Son olarak, yalnızca Tasarımcı İlaçlar Tarafından Aktive Edilen Tasarımcı Reseptörleri (DREADD'ler) gibi kemogenetik reseptörler18, sinirbilimciler tarafından transgenik veya transfekte edilmiş hayvanlarda nöronal uyarılma üzerinde farmakolojik kontrol sağlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır19,20. DREADD'ler, endojen ligandlardan ziyade sentetik kemogenetik moleküllere yanıt vermek üzere genetik olarak tasarlanmış G proteinine bağlı reseptörlerdir (GPCR'ler), öyle ki bu ligandların sistemik uygulaması, DREADD eksprese eden nöronların uyarılabilirliğini arttırır veya azaltır. Bu üç teknoloji ATAC'ta birleştirildiğinde, seçilen nöral devrelerin uzamsal, hücre tipi ve zamansal hassasiyetle noninvaziv modülasyonu için kullanılabilirler.

Burada, basit 3D baskılı hedefleme ekipmanı kullanarak farelerde FUS-BBBO ile beyin bölgelerinin doğru hedeflenmesi için metodolojiyi dahil ederek FUS-BBBO11 için daha önce yayınlanmış bir protokolü genişletiyor ve güncelliyoruz. Ayrıca, FUS-BBBO'nun ATAC'a bir uygulamasını da gösteriyoruz. Kemogenetik reseptörleri taşıyan AAV'lerin verilmesi ve gen ekspresyonunun ve nöromodülasyonun histoloji ile değerlendirilmesi için gerekli adımları gösteriyoruz. Bu teknik, özellikle gen ekspresyonu veya nöromodülasyon için büyük veya çoklu beyin bölgelerini hedeflemek için geçerlidir. Örneğin, bir korteksin geniş bir alanı FUS-BBBO ile kolayca transdüksiyon yapılabilir ve kemogenetik kullanılarak modüle edilebilir. Bununla birlikte, alternatif bir teknik olan intrakraniyal enjeksiyonlarla gen iletimi, çok sayıda invaziv enjeksiyon ve kraniotomi gerektirecektir. FUS-BBBO ve uygulaması ATAC, beyin bölgelerinin daha büyük ve invaziv olarak hedeflenmesinin daha zor olduğu farklı boyutlardaki hayvanlara ölçeklendirilebilir.

Protokol

Tüm deneyler, verilerin orijinal olarak J.O.S. tarafından elde edildiği Kaliforniya Teknoloji Enstitüsü'nün Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan bir protokol kapsamında gerçekleştirildi.

1. Hayvan koşum takımı ve görüntü rehberlik donanımının tasarımı ve 3D baskısı

  1. Bileşenlerin 3D baskısı için https://www.szablowskilab.org/downloads adresindeki Szablowski laboratuvarı web sitesindeki dosyaları kullanın.
  2. Baskı malzemesinin MRG'de düşük duyarlılığa sahip olduğundan ancak MRG tarafından görülebilen bir desteğe sahip olduğundan emin olun. Malzemeler ve reaktifler bölümünde kullanılan malzemelerin ayrıntılarına bakın.
  3. Malzemeyi tekrar tekrar test ederek ve güçlendirilmesi gereken aşınma yerlerini gözlemleyerek birden fazla kullanımla malzeme bozulmasını hesaba katın. Yazdırılan duvarların en az 2 mm kalınlığında olduğundan emin olun.
  4. Hedefleme hassasiyetini artırmak için yüksek hassasiyetli 3D yazıcılar kullanın.
  5. Bileşenleri uzunlukları boyunca destekleyerek ve herhangi bir bükülme gözlemlenirse 3D baskılı duvarların kalınlığını artırarak plastik 3D baskılı bileşenlerin sapmasını önlemek için yerçekimi ve diğer kuvvetlere karşı koyun.
  6. Anterior/posterior, medial/lateral, dorsal/ventral ve ayrıca sapma, eğim ve eğim dahil olmak üzere birden fazla eksende hassasiyeti hesaba katın.
  7. FUS-BBBO gerçekleştirerek ve hedeflenen konumdan sapmayı kaydederek hedeflemenin doğruluğunu test edin.
  8. Motorlu stereotaksik sistemler kullanılıyorsa, FUS-BBBO hedefleme prosedürünü videoya kaydederek dinamik hareketin malzeme esnekliği üzerindeki etkilerini değerlendirin ve 3D baskılı malzeme duvarlarını kalınlaştırarak sapmaları düzeltin.

2. Ultrason sistemi açıklaması

  1. Sekiz elemanlı dairesel dizi dönüştürücülü bir ultrason sistemi kullanın (çap = 25 mm, doğal odak noktası = 20 mm; açıklık (F) = 0.8)) ve traşlı fare kafasına jel uygulayarak gövdeyi gazdan arındırılmış ultrason jeli ile kafaya bağlayın.
    NOT: Önceki bir çalışmada7 kullanılan bir dönüştürücünün merkez frekansı 1.5 MHz, darbe süresi 10 ms ve darbe tekrarlama frekansı 120 sn üzerinde 1 Hz idi. Basınçlar fiber optik hidrofon kullanılarak kalibre edildi ve 0.36-0.45 MPa arasında tutuldu. 1.5 MHz ve parietal kemik için kafatası21 boyunca% 18 akustik zayıflama olduğunu varsayalım. Güvenli bir BBB açılması ve AAV teslimatı için uygun koşullar aralığı başka bir yerde ayrıntılı olarakaçıklanmıştır 7,14,22.

3. Hayvan hazırlama

  1. Tıbbi sınıf hava ile% 2'de izofluran inhalasyonu kullanarak bir fareyi uyuşturun. Yanıt eksikliğini doğrulamak için anestezi derinliğini bir tutam dokunuşla kontrol edin. Ardından, merhem tüpünün çapraz kontaminasyonunu önlemek için tek kullanımlık steril bir q-ucu kullanarak kornea kurumasını önlemek için oftalmik merhem uygulayın.
    NOT: FUS-BBBO'nun tipik prosedürü 30 dakika ile 2 saat arasında değişebilir ve anestezi boyunca sürdürülmelidir.
  2. Fare uyuşturulduktan sonra, temiz bir kateteri heparinize salin (10 U / ml) ile yıkayın.
    NOT: 25-35 g'lık bir fare için uygun bir kateterde 30 G'lık bir iğne ve PE10 hortumu bulunur.
  3. Daha sonra fare kuyruğunu% 70 etanol pedi ile dezenfekte edin. Kuyruk ven kateterini lateral bir kuyruk damarına yerleştirin ve bir doku yapıştırıcısı ile sabitleyin. Yerleşimini doğrulamak için kuyruk damarından katetere geri kan akışını gözlemleyin.
  4. Fare kafasını tıraş edin ve ardından insonasyon sırasında ultrasonik jel altında hava kabarcıklarının sıkışma olasılığını azaltmak için doku yapıştırıcısı kuruduktan sonra epilasyon kremi kullanın.
  5. Fareyi 3D baskılı bir MRI taşıyıcısına yerleştirin, ön dişleri bir ısırma çubuğuna monte edin ve bir nosekonun içine yerleştirin (Şekil 1a).
  6. Körelmiş kulak çubuklarına temas eden bölgeye deri altından 10 μL'ye kadar lidokain enjekte edin. Ardından, körelmiş çubukları kafatasına sabitleyin ve nefes almayı engellediği için nefes borusuna baskı uygulamamaya dikkat ederek güvenli miktarda basınç uygulayın. Hayvanın 1/s hızında serbestçe nefes aldığını doğrulamak için solunumu 30 saniye gözlemleyin.
  7. Hedefleme kılavuzunu kulak çubuklarına bağlayın, adım 3.6'da (Şekil 1b) olduğu gibi solunumu kontrol edin ve prosedür boyunca her dakika görsel olarak solunumu izlemeye devam edin. Solunum hızının 1/s'nin üzerine çıkması anestezi kaybının göstergelerinden biridir. Fareler MRI tarayıcısında değilken veya solunum hızı 1 / s'nin üzerine çıktığında her 5 dakikada bir ayak parmağı sıkışma tepkisini izlemeye devam edin.
  8. MRI taşıyıcısını bir MRI tutucusuna ve ardından bir mıknatısın deliğine aktarın.
    NOT: Donanımın tasarımı, 7T MRI içindeki 72 mm'lik bir bobin için optimize edilmiştir.
  9. Fareyi tarayıcıda lokalize etmek için bir MRI dizisi edinin.
  10. Cihaz üreticisinin özel talimatlarına göre aşağıdaki parametreleri kullanarak beynin tamamını elde etmek için 3D hızlı düşük açılı çekim (FLASH) dizisini seçin. Yankı süresi: 3,9 ms, Tekrarlama süresi: 15 ms, Uyarma darbe açısı: 15°, Matris boyutu: 130 x 130 x 114, Çözünürlük: voksel başına 350 x 200 x 200 μm, Ortalamalar: 1, Edinme süresi: 3 dakika 42 sn
  11. Dosyaları MRI sisteminden FUS sistemini kontrol eden bir bilgisayara aktarın.
  12. Görüntünün Şekil 1c'deki gibi görünmesi gereken MRI kılavuzluğunda hedefleme gerçekleştirmek için yazılımda görüntüleme dizisini açın.

4. MRI kılavuzluğunda hedefleme

NOT: Özel olarak tasarlanmış hedefleme kılavuzlarının kullanılmasıyla, ultrason dönüştürücüsünün bir MRI içine yerleştirilmesi veya bregma ve lambda hatlarında stereotax'ı sıfırlayarak hedefleme yapmak için cildi kesmek gerekli değildir. Hedefleme işlemini gerçekleştirmek için aşağıdaki adımları izleyin.

  1. Taşıyıcıyı stereotaksik bir aletin içine yerleştirin. Çift taraflı bantlı metal bir blok kullanarak ve taşıyıcıyı stereotaksik aletin iki destek direğine bastırarak yerine sabitleyin.
  2. Veri yöneticisinde dosyaları seçerek, menü seçeneklerini getirmek için sağ tıklayarak ve 'Hemen aktar'ı seçerek MRI görüntülerini çalışan bir FUS rehberlik yazılımı olan bir bilgisayara aktarın.
  3. FUS kılavuz yazılımını açın ve 'Diziyi aç'a tıklayarak ve görüntüleme dizisinin tüm dosyalarını yükleyerek görüntüyü yükleyin.
  4. Sağ tıklayıp 'Yeniden Biçimlendir' düğmesine basarak görüntüyü üç eksene yeniden biçimlendirin.
  5. Sağ tıklayarak dönüştürücüyü dairesel hedefleme kılavuzuna (Şekil 1c) konumlandırın.
  6. Sagital görünümde, su banyosunun ve dönüştürücü muhafazasının kalınlığını hesaba katmak için sanal bir dönüştürücünün dikey konumunu ayarlayın (bu durumda – 8.2 mm yukarı, Şekil 1d).
  7. Yörünge planlayıcısında hedeflenecek alan(lar)ı işaretleyin ve koordinatları bir elektronik tabloya not edin (bu durumda – Şekil 1d'deki gibi orta beyin).
  8. İstenilen hedefleme derinliğini çevirin (elektronik yörüngedeki z değeri (Şekil 2) ve bir elektronik tablodaki koordinatları not edin.
  9. 'Yörünge gönder' ve 'Yürüt' tuşlarına basarak noktaların her birini hedefleyin (Şekil 2).
    NOT: Bu, motorların içine bir fare taşıyıcısı yerleştirildiğinde yapılır. Bununla birlikte, aynı hedefleme stereotaksik bir cihazda yüksek doğrulukla elde edilebilir.
  10. Bir MRG'nin koordinatlarını stereotaksik çerçeve ile ilişkilendirmek için, özel olarak monte edilmiş dönüştürücüyü bir hedefleme kılavuzunun üzerine yerleştirin ve üç hedefleme cıvatasının her biri (Şekil 3, eleman A) hem transdüser tutucusundan (Şekil 3, eleman B) hem de hedefleme kılavuzundan (Şekil 3, eleman C) geçene kadar çevirin. Cıvataların gerilim altında olmadığından veya eğilmediğinden emin olun.
  11. Dönüştürücüyü, bir MRI'da bir hedefleme kılavuzunun merkezinin göründüğü yere gelene kadar ön/arka yönde 10.56 mm ileri çevirin.
  12. Sanal dönüştürücünün bir merkezinden (Şekil 3a, eleman A) hedeflenen bölgeye (Şekil 3a, eleman B) olan mesafeyi belirleyin ve stereotaksik çerçeve kullanarak dönüştürücüyü bu koordinatlara taşıyın.
  13. Enjeksiyon çözeltisinin hazırlanmasına devam edin.

5. Enjeksiyon çözeltisi hazırlama

NOT: Mikro kabarcık çözeltileri basınca karşı çok hassastır. Sonuç olarak, ince iğnelerle kuvvetli karıştırma veya hızlı enjeksiyon, mikro kabarcıkları çökertebilir ve BBB açılmasının etkinliğini azaltabilir. Ek olarak, mikro kabarcıklar sudan daha hafiftir ve örneğin otomatik bir enjektörde bir tüpün, kateterin veya şırınganın (Şekil 4) tepesine kadar yüzebilir. Her enjeksiyondan hemen önce mikro kabarcık solüsyonunun yeniden süspanse edilmesi şiddetle tavsiye edilir.

  1. Bir şırınga kullanarak 0.8 mL salini 1.5 mL'lik tüpe çekin.
  2. Bir şırınga kullanarak, aynı 1.5 mL'lik tüpe 0.1 mL MRI kontrast maddesi ekleyin ve karıştırın.
  3. Aktive edilmemiş microbubble23,24 çözeltisini oda sıcaklığına getirin.
  4. İnsonasyondan hemen önce, bir mikro kabarcık aktivasyon cihazında 45 saniye boyunca mikro kabarcıkları etkinleştirin.
  5. Yavaşça (~ 3 saniyeden fazla) 1 mL tüberkülin şırıngası ve 21 G iğne kullanarak bir sıvının orta derinliğinden 0,1 mL mikro kabarcık çekin.
  6. Adım 5.3'te hazırlanan kontrast madde ve salin çözeltisine 0.08 mL mikro kabarcık ekleyin. 15 saniye boyunca elinizle hafifçe vurarak karıştırın.
  7. AAV'lerin nihai konsantrasyonu vücut ağırlığının gramı başına 0.5-2 x10 10 viral partikül (VP/g) iken, kemogenetik reseptörler taşıyan ATAC – AAV'ler veya aynı promotör altında GFP taşıyan AAV'ler gibi negatif bir kontrol durumunda, teslimat için kargoyu (bu durumda AAV9) 30 G iğne yoluyla kuyruk ven kateterine enjekte edin.
  8. Yüzmeyi önlemek için mikro kabarcıkları tekrar 15 saniye boyunca elle karıştırın (Şekil 4).
  9. Hemen ardından, 200 μL mikro kabarcık solüsyonunu iğne takılı olmayan bir şırıngadan aspire edin. İğne eksikliği, mikro kabarcıklar üzerindeki kesme kuvvetlerini azaltacaktır.
  10. Şırıngayı ters çevirin ve pistonu yukarı ve aşağı bastırarak karıştırın.
  11. 30 G'lik iğneyi takın ve hala ters çevrilmişken, iğnenin ucunda damlacıklar görünene kadar mikro kabarcıkları yavaşça dışarı itin.

6. İnsonasyon prosedürü

  1. İnsonasyon için parametreleri ayarlayın: 10 ms darbe süresi, 120 tekrar, her sn ve kafatasında 0.30-0.45 MPa basınç.
  2. Hedefleme kılavuzunu çıkarın ve kabarcık oluşturmadığından emin olarak fare kafasına gazı alınmış ultrason jeli uygulayın.
  3. Dönüştürücüyü indirin ve doğrudan kulak çubuğu tutucusuna düz bir şekilde yerleştirin ve koordinatları stereotaksik aletlere çevirin (Şekil 5).
  4. AAV çözeltisini (0.5-2 x 1010 VP / g) enjekte edin.
  5. Mikro kabarcıkları ve MRI kontrast madde solüsyonunu 15 saniye boyunca karıştırın ve 30 g fare başına 80 μL enjekte edin.
  6. Hemen 'Gönder' ve 'Yürüt' tuşlarına basarak 120 saniye boyunca ultrason uygulayın.
  7. Birden fazla site hedefleniyorsa, dönüştürücüyü o siteye taşıyın ve 4.7-4.9 arasındaki adımlarda yer alan e-tablodaki sayılara göre derinlik hedeflemesini ayarlayın. Ardından, sonlanan her bölge için 6.5-6.6 arasındaki adımları tekrarlayın.

7. BBB açıklığının MRG değerlendirmesi

NOT: BBB açıklığının MRG değerlendirmesi başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanmıştır11. BBB açıklığının yeri, T1 ağırlıklı bir Gd kontrast maddesi enjeksiyonu alan farelerde daha parlak alanlar olarak görselleştirilebilir.

  1. Ultrason uygulamasından sonra, adım 3.10'daki gibi bir MRI dizisi kaydedin.
  2. Fareyi MRI tarayıcısından çıkarın ve anesteziden iyileşmeyi sağlamak için bir kurtarma kafesine yerleştirin. Fareleri günlük olarak sıkıntı, kilo kaybı veya diğer insancıl uç noktalar için izleyin. Beklenmeyen advers olayların meydana gelmesi durumunda herhangi bir tedaviye devam etmek için veteriner personeline ve kurumsal IACUC yönergelerine danışın.

8. Kemogenetik ligand ile DREADD stimülasyonu

  1. Kemogenetik bir reseptör seçin. DREADD'ler için, Gq bağlı yollar19 aracılığıyla nöronal aktivasyon için hM3Dq reseptörünü, Gi / o bağlı yollar20 yoluyla nöronal aktivitenin inhibisyonu için hM4Di reseptörünü veya Salvinorin-B ligandı25 kullanılarak Gs bağlantılı yollar yoluyla nöronların aktivasyonu için KORD reseptörünü seçin.
  2. Klozapin-n-oksit (CNO) steril salin içinde 1 mg / mL konsantrasyonda çözün. Alıntılanan CNO'yu -20 °C'de saklayın.
  3. CNO 19 veya başka bir kemogenetik ligand26,27,28'i intraperitoneal yoldan 0.3 –10 mg / kg arasındaki konsantrasyonda uygulayın.
  4. CNO'nun davranış üzerindeki etkileri kaydedilecekse, DREADD'lerin maksimum aktivasyonunu elde etmek için ilaç uygulamasından sonra 15-45 dakika içinde davranışsal aktiviteyi kaydetmeye başlayın19.
  5. Nöronal aktivasyonun analizi isteniyorsa, enjeksiyondan 60-120 dakika sonra histolojik değerlendirme için fareler kullanın.
  6. Kardiyak perfüzyon yoluyla ötenaziye geçilmelidir (bkz. bölüm 9).

9. Gen ekspresyonunun ve kemogenetik aktivasyonun histolojik değerlendirmesi

NOT: Deneysel son noktaya (örneğin, davranışsal çalışmanın sonu, gen ekspresyonu için gereken süre) ulaşıldıktan sonra, gen ekspresyonunun yerini ve varlığını doğrulamak çok önemlidir.

  1. Kemogenetik bir ligand ile aktivasyondan sonra, dokuları korumak için kardiyak perfüzyon gerçekleştirin.
    1. Fareyi Ketamin (100 mg/kg) /Ksilazin (10 mg/kg) karışımı ile steril salin içinde IP enjeksiyonu ile uyuşturun. Anesteziyi bir ayak parmağı tutamıyla onaylayın ve solunum hızının yaklaşık 1 / s'ye düşürüldüğünden emin olun. Ötenazi onaylanana kadar ısıtma yastığı aracılığıyla termal destek sağlayın.
    2. % 10 nötr tamponlu formalin (NBF) ve PBS'yi mL başına 10 birim heparin ile hazırlayın.
      NOT: Çözeltiler 4 °C'de olmalıdır.
    3. Her tamponu ayrı 50 mL'lik tüplere dökün ve bağlayın ve PBS/heparin solüsyonu ile 25 G'lik bir kelebek katetere bağlı bir peristaltik pompayı doldurun.
    4. Uzuvları bantla emici mavi bir pede tutturun ve hayvanın ped üzerinde sırtüstü pozisyonda yerleştirildiğinden emin olun. Toplanması gerektiğinde periferik organların çapraz kontaminasyonunu önlemek için kürkü dezenfekte edin.
    5. Diyaframı açığa çıkaran enine bir kesi ile periton boşluğunu açın.
    6. Göğüs kafesini ön / arka eksen boyunca iki kesik cerrahi makasla açın.
    7. Kalbi ortaya çıkarın ve iğneyi sol bir odaya yerleştirin (sırtüstü olarak bakıldığında kalbin sağ tarafı) ve adım 9.1.3'te kelebek katetere yerleştirin.
    8. Kan çıkışına izin vermek için sağ ventrikülde küçük bir kesi yapın.
    9. Kanı PBS / heparin ile yıkamaya başlamak için peristaltik pompayı açın.
      NOT: Bu adım yeterince yapılmazsa, formalin ile fiksasyon sırasında kan pıhtılaşacak ve uygun perfüzyonu önleyecektir.
    10. Tüm kan temizlendikten ve sağ ventrikülden temiz PBS çıkmaya başladıktan sonra, peristaltik bir pompanın girişini bir NBF çözeltisine çevirin ve fare başına 25 mL perfüzyona başlayın.
    11. Beyni çıkarın, en az 4 mL NBF'ye yerleştirin ve 24 saat boyunca düzeltin.
  2. 50 μm kesit kalınlığı kullanarak bir vibratom üzerinde koronal kesitler kullanarak beyni bölümlere ayırın.
  3. Her bölümü, bölümleri beyin boyunca depolayan 24 oyuklu bir plakanın kuyusuna yerleştirin.
  4. Floresan proteinlere kaynaşmış kemogenetik reseptörlerin ekspresyonunu değerlendirin (örneğin, mCherry veya mSitrin), konumu doğrulamak için ekspresyon gösteren bölümleri tanımlamak için bir floresan mikroskop altında. İfadenin soluk olması muhtemeldir.
  5. Aşağıdaki protokolü kullanarak florofora karşı immün boyama gerçekleştirin:
    1. İkincil bir antikor konakçısının% 10 serumunu içeren 0.5 mL çözeltiye 3 bölüm yerleştirin ve 30 dakika inkübe edin.
    2. Bölümleri, başlangıç noktası olarak 1:500 kullanarak 1:250 – 1:1,000 seyreltmede bir birincil antikor çözeltisine aktarın.
    3. Birincil antikorlu bölümleri, bir parafin filmi ile kapatılmış bir mikroplaka içinde gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    4. Bölümleri PBS ile 3 kez 5 dakika boyunca yıkayın.
    5. % 10 serumda ikincil antikor çözeltisinin oyuğu başına 0.5 mL ekleyin.
    6. Oda sıcaklığında 4 saat inkübe edin.
    7. Bölümleri PBS ile 3 kez 5 dakika boyunca yıkayın.
    8. Nükleer leke (örn. DAPI) içeren sulu bir montaj ortamına sahip kızaklara monte edin.
  6. Tüm bir bölümün karo taramasını gerçekleştirerek konfokal mikroskop kullanarak lokalizasyonu ve yayılımı değerlendirin.
  7. Hedeflenen beyin bölgelerindeki floresan piksel yoğunluğunu ölçerek ekspresyon yoğunluğunu değerlendirin ve intrakraniyal olarak enjekte edilen bir kontrolle karşılaştırın.
  8. Alternatif olarak, DAPI pozitif hücrelere veya hücreye özgü belirteçlere kıyasla kemogenetik reseptörlere karşı boyanmış hücreleri sayarak pozitif nöronların yüzdesini değerlendirin.
  9. 50 μm'lik kesitte hematoksilen boyama yaparak ve hücre kaybı, hücre kalıntıları birikimi ve diğer ağır hasar belirtileri için görüntüleme yaparak doku hasarını değerlendirin.
  10. Hücre hedeflemenin özgüllüğünü değerlendirmek için, kemogenetik reseptör ve hücreye özgü bir belirteç için aşağıda tarif edildiği gibi çift immün boyama gerçekleştirin. Ardından, adım 9.8'deki gibi hücre pozitif sayımları gerçekleştirin.
    1. İkincil bir antikor konakçısının% 10 serumunu içeren bir çözeltinin 0.5 mL'sine 3 bölüm yerleştirin ve 30 dakika inkübe edin.
    2. Bölümleri, başlangıç noktası olarak 1:500 kullanarak, 1:250 – 1:1,000 seyreltmede bir kemogenetik reseptörün floresan belirtecine karşı bir primer antikor çözeltisine aktarın. Hücreye özgü bir ilgilenilen işaretleyiciye (örneğin, CamkIIa) karşı hedeflenen farklı bir konakçı türden ikinci bir birincil antikor ekleyin.
    3. Birincil antikorlu bölümleri, parafin film ile kapatılmış bir mikroplaka içinde gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    4. Bölümleri PBS ile 3 kez 5 dakika boyunca yıkayın.
    5. Her iki ikincil antikorun konakçı türlerinin% 10 serumunda ikincil antikor çözeltisinin oyuğu başına 0.5 mL ekleyin.
      NOT: Her antikorun ayrı bir floroforu olmalı ve adım 9.10.2'deki primer antikorlara karşı reaktif olmalıdır.
    6. Oda sıcaklığında 4 saat inkübe edin.
    7. Bölümleri PBS ile 3 kez 5 dakika boyunca yıkayın.
    8. Kızaklara monte edin ve nükleer leke içeren sulu bir montaj ortamıyla sabitleyin.

10. c-Fos için immün boyama ile nöronal aktivasyonu değerlendirin

  1. Bu protokolün 9.5 maddesinde olduğu gibi, bir c-Fos birincil antikoru ve nükleer boyadan farklı bir floresan etikete sahip ikincil bir antikor kullanarak c-Fos boyaması gerçekleştirin.
  2. Kemogenetik bir reseptör tarafından hedeflenen alanda hem c-Fos hem de nükleer leke için pozitif olan hücrelerin yüzdesini sayın.
  3. Kemogenetik reseptörleri eksprese eden ve kemogenetik ligand veya araç kontrolü ile tedavi edilen fare grubunda ve kemogenetik ligand veya araç kontrolü ile tedavi edilen vahşi tip fare grubunda c-Fos pozitif çekirdeklerin yüzdesini analiz edin.

Sonuçlar

ATAC protokolünü gerçekleştirmenin ilk adımı, FUS-BBBO'nun istenen beyin bölgelerine hedeflenmesidir. Örneğin, tarif edilen protokolü takiben, hipokampus FUS-BBBO ile hedeflendi ve farelere kontrast madde ve AAV9 taşıyan DREADD'ler enjekte edildi, ardından fare beyninin görüntülerini alan bir FLASH 3D MRI dizisi izledi. Hipokampal bölgede (Şekil 6) ve beynin diğer bölgelerinde (Şekil 7) bir T1 sinyal artışı sağlandı. Birkaç hafta sonra, DREADD'ler hedef beyin bölgesinde eksprese edildi. Birçok DREADD, bir floresan raportöre (örneğin mCherry) kaynaştırılırken, formaldehit ile perfüzyon ve fiksasyon işleminin bu proteinlerin floresansını büyük ölçüde azalttığı bulunmuştur. mCherry veya DREADD'a karşı immün boyama, önceki deneyimlere dayanarak ekspresyonun daha güvenilir bir şekilde tespit edilmesini sağlamıştır (Şekil 8). Önceki deneylerde, farelerin ~% 85'i FUS-BBBO7'yi takiben ekspresyon gösterdi. DREADD'lerin yeterli düzeyde ekspresyonu için basit bir test, işlevselliklerini hücresel düzeyde test etmektir. Örneğin, CNO19, deskloroklozapin28 veya diğerleri29 gibi bir kemogenetik ligand veya salin kontrolü sağlayarak ve kardiyak perfüzyon ve fiksasyondan önce 2 saat bekleyerek yapılabilir. Beyin bölümleri daha sonra nöronların aktivitesinin arttığını gösteren c-Fos proteini30 ve DREADD için birlikte immün boyandı. DREADD'lerle hedeflenen beyin bölgesi, kemogenetik ligand alan grupta salin7 alan gruba kıyasla veya FUS-BBBO'ya maruz kalmayan kontralateral bir bölgeye kıyasla önemli ölçüde daha fazla sayıda nöronal çekirdek gösteriyorsa, deney başarılı kabul edildi. Dikkat çekici bir şekilde, bu ligandların bazılarının, DREADD'lerin ekspresyonu olmadan spesifik olmayan nöronları aktive etme potansiyeli vardır. Örneğin, CNO'nun farelerde düşük seviyelerde klozapin metabolize edildiği gösterilmiştir, bu da BBB'yi geçer ve yüksek potens27 ile DREADD'leri aktive eder. Bununla birlikte, belirli olmayan konumlara bağlandığı da gösterilmiştir. Her deneyde olduğu gibi, kemogenetik çalışmalarda tüm uygun kontrollerin dahil edilmesi çok önemlidir31. Olası bir kontrol, kemogenetik ligandın, ilacın tek başına istenen davranışsal veya histolojik tahlil üzerindeki etkilerini dışlamak için prosedürler olmaksızın vahşi tip farelere uygulanmasıdır. Başka bir kontrol, dört grubun dahil edilmesi olabilir: DREADD + ligand, DREADD + araç, EGFP + ligand, EGFP + araç, hem FUS-BBBO ile gen iletiminin hem de kemogenetik ligandın olası etkilerini açıklayacak.

figure-results-1
Şekil 1: ATAC'ta FUS'un MRI kılavuzluğunda hedeflenmesi süreci. (a) Kulak çubukları, bir burun konisi ve bir MRI tarayıcısının içine sığabilecek bir platform ile fare yerleşimi. (b) MRG'de görülebilen 3D baskılı bir kılavuz (mavi) kulak çubuğu çerçevesinin uçlarına takıldı ve daha sonra dört geçmeli cıvata (yarı saydam mavi) içeren bir yüzey MRI bobini tutucusu ile yerine sabitlendi. (c) 3D baskılı kılavuzun sagital MRG'de (sol panel) görünümü, kılavuzun alt kısmıyla hizalanmış bir dönüştürücünün sanal temsilinin alt kısmı (sarı yarım daire). Sağ panel, koronal görünümden MRG'de 3D baskılı kılavuzun görünümünü gösterir. Parlak daire, güçlü bir MRI kontrastına sahip bir polijet destek malzemesinden yapılmıştır. Haç plastikle oluşturuldu. Sarı bir daire, stereotaksik bir çerçeve içindeki kılavuzla eşmerkezli olarak hizalanmış dönüştürücü konumunu temsil eder. (d) Beyin yapılarını hedeflemek için, sanal bir dönüştürücü, bir ultrason konisinin / yuvasının kalınlığına uyması için farelerin üzerinde z yönünde hareket ettirildi. Bu durumda, su banyosunun kalınlığı nedeniyle, doğru hedefleme için dönüştürücü kılavuzun 8,2 mm yukarısına hareket ettirildi. Beyin yapıları MRG görüntüleme verileri kullanılarak seçildi ve MRG koordinatları daha sonra yazıldı ve stereotaksik makineye girildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Kullanılan yazılımın arayüzü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: MRG koordinat alanını stereotaksik aletle eşleştirme işlemi. (a) Bir dönüştürücü tutucu içindeki üç delik, MRI kılavuzundaki üç delikle hizalandı ve tüm düzeneğe esnemeye neden olmadan üç konik hedefleme cıvatası yerleştirildi. (b) İdeal olarak, üç cıvata da deliklerin ortasına oturacaktır. (c) Hizalamada herhangi bir belirsizlik varsa, üç cıvatanın tümü yerine oturmaz, örneğin, 1°'lik küçük, muhtemelen algılanamayan sapma durumunda, zıt cıvatalar MRI kılavuzuna sıkışırken yalnızca bir cıvata sığar. Alternatif olarak, cıvatalar zorlandığı için tüm tertibatta gözle görülür bir esneme olabilir. (d) Cıvata bağlantısının büyütülmüş görünümü. En iyi doğruluk için cıvatalar eşmerkezli olarak yerleştirilmelidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Şırınga içindeki mikro kabarcıkların hızlı yeniden dağılımı. (a) Şırınga karıştırıldıktan 5 saniye sonra fotoğraflandı. (b) Bir dakika sonra, 1 mL tüberkülin şırıngasının tepesine yakın bir yerde yoğunlaşan kabarcıkların bir kısmını gösteren açıkça görülebilen bir tabaka vardı. Bu örnek, özellikle, bir mikro kabarcık çözeltisi kullanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Bir dönüştürücünün merkezini bir MRI kılavuzunun merkezine yerleştirme işlemi. (a) Bu belgede gösterilen modellerde, kırmızı taşıyıcı, Şekil 10.56b'de gösterilen konumdan burada gösterilen konuma 3 mm ileri hareket edecek şekilde tasarlanmıştır. (b) Mavi MRI kılavuzu sonikasyondan önce çıkarıldı ve ultrason geçişini sağlamak için fare ile dönüştürücü (turuncu) arasına bir ultrason jeli uygulandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: BBB açıklığının MRG görselleştirmesi. (a) BBB açıklığının eksenel görünümü. Ok ucu ile gösterilen daha parlak alan, bir MRI T1 kontrast maddesinin ekstravazasyonunu gösterir. (b) Dorsal hipokampusun ve hipokampusun üzerindeki korteksin FUS-BBBO (ok uçları) ile hedeflenen koronal görünümü. (c) FUS-BBBO (ok uçları) ile hedeflenen merkezi hipokampusun koronal görünümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Bu yazıda açıklanan üç cıvatalı hedefleme sistemi kullanılarak 4 beyin bölgesinin hedeflenmesi örneği. Ok uçlu alanlar, bir MRG kontrast maddesinin difüzyonu ile BBB açılmış bölgeleri gösterdi. Dört bölge, aşağıdan yukarıya doğru her BBB açıklığı arasında ~ 150 s olacak şekilde art arda hedeflendi. Görüntü, son BBB açılışından sonraki 2 dakika içinde çekildi. Ölçek çubuğu 2 mm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8: DREADD ifadesinin algılanması.  (a) DREADD'lere bağlı florofor için immün boyama, bu durumda mCherry bazı çalışmalarda güvenilir bir tespit yöntemiydi. (b) (a)'daki ile aynı koşulları kullanarak hipokampusu hedefleyen DREADD'lerin bulunduğu başka bir temsili bölümde, mCherry'nin floresansı kendi başına güçlü bir arka plan ve nispeten zayıf sinyal üretti. (c) Negatif kontrol olarak, sistemik AAV enjeksiyonu alan, ancak FUS-BBBO uygulanmayan bir fare kullanıldı. mCherry immün boyama ile anlamlı bir ekspresyon bulunamaz. Ölçek çubukları 500 mm'dir. (a, c'deki veriler7'den izinlerle uyarlanmıştır, Telif Hakkı 2020 Nature-Springer). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

ATAC, doğru MRI kılavuzluğunda hedefleme, FUS-BBBO ve gen ekspresyonunun histolojik değerlendirmesi dahil olmak üzere belirli nöral devrelerin başarılı nöromodülasyonu için çeşitli tekniklerin başarılı bir şekilde uygulanmasını gerektirir. Görüntüleme kılavuzluğunda FUS-BBBO ile küçük beyin yapılarının hedeflenmesini basitleştirmek için 3D yazdırılabilir bileşenler geliştirildi.

MRG kılavuzluğunda odaklanmış ultrason (MRIgFUS) uygulaması bir takım zorluklar ortaya çıkarmaktadır. İlk olarak, tipik MRI bobini, ultrason donanımını değil, yalnızca bir numuneyi barındıracak şekilde tasarlanmış sınırlı alana sahiptir. MRI'ların daha büyük delikleri, sinyal bir bobinin32 doldurma faktörü ile ilgili olduğundan, ekipman maliyetini artırır ve görüntü kalitesini düşürür. Sonuç olarak, MRG'de bir hayvan görüntüsünün üstüne yerleştirilen herhangi bir FUS donanımı, görüntüleme kalitesinden ödün verecektir. İkincisi, MRI uyumlu cihazlar tasarlamak zor ve pahalıdır. MR uyumlu malzemelerin diyamanyetik olması, radyofrekans ışınlaması sırasında girdap akımı oluşturma eğiliminin düşük olması ve yüksek manyetik alanlarda düşük manyetik duyarlılığa sahip olması gerekir. Herhangi bir iletken malzemede, girdap akımlarının oluşması veya manyetik duyarlılığı da görüntüleme kalitesini olumsuz yönde etkileyecektir. Son olarak, mevcut MRI uyumlu malzemeler, stereotaksik çerçeveler gibi hassas hedefleme makinelerinin üretiminde tipik olarak kullanılan metallerden daha düşük Young modülüne ve dayanıklılığına sahiptir. Konumsal ayarlamalar için kullanılan motorların MRG uyumlu olması ve boyutlarından dolayı MRG deliğinin dışına yerleştirilmesi gerekir. Bu motorlar, MRI uyumlu malzemeler kullanılarak bir MRI deliği içindeki dönüştürücüye belirli bir mesafede bağlanmalıdır. Plastik çarpıtma sorunları, sağlam boyutlu bileşenleri uygulamak için deliğin içinde yeterli alan olmaması ve tüm beyin boyunca hedefleme pozisyonlarını değiştirmek için yetersiz alan, önceki çalışmalarda hedefleme doğruluğunu etkilemiştir.

Bu sorunları çözmek için MRG ve FUS-BBBO uygulamasında görüntülemenin tarayıcı dışında yapılmasına karar verildi. MRI rehberliğine izin vermek için fareler, fare beyin yapılarını hem MRG'de hem de stereotax koordinat alanında lokalize etmek için kullanılabilecek MRI ile görünür bir hedefleme kılavuzuna sahip 3D baskılı bir kısıtlamanın içine yerleştirildi. Hem fare kafatası hem de hedefleme kılavuzu kulak çubuğu tutucularına sıkıca tutturulduğundan (Şekil 1a,b), MRI görüntüsündeki uzamsal koordinatları ilişkilendirmek ve stereotaksik aletleri sıfırlamak için bir hedefleme kılavuzu kullanılabilir. Kısıtlamanın hareketli parçaları yoktur ve bir dönüştürücü içermez, bu da onu hem sağlam hem de bir MRI'nın içine sığacak kadar küçük hale getirmemize izin verdi ve dönüştürücünün elektroniğinden sinyal parazitini ortadan kaldırdı. Bazı materyaller için 3D baskılı destek MRG'de görülebildiği için hedefleme kılavuzunun içindeki boşluk oyulmuştur (Şekil 1c). Stereotax kalibrasyonunu sağlamak için düzenekte delikler açıldı (Şekil 3). Ultrason dönüştürücüsü, bir stereotaksın bir elektrot tutucusuna bağlandı ve hedefleme, bölüm 4'te açıklandığı gibi gerçekleştirildi (Şekil 1d). Dönüştürücü, düz düzlemden herhangi bir sapmayı önleyecek şekilde, kulak çubuklarının muhafazası ile uzunluğu boyunca desteklenmelidir. Dorso-ventral yönde hedefleme, dairesel bir dizide faz kaymaları kullanılarak elde edilebilir.

Pratik hedefleme hassasiyeti, ultrason odaklama ve kafatası zayıflaması ile belirlenir. FUS-BBBO prosedürü sıçanlarda 11 ayrıntılı olarak tanımlanmıştır ve bir dizi başka model organizmada23,33,34 ve insanlarda 16,17 uygulanmıştır. Ultrason odak boyutu arasındaki ilişki, frekansla ters orantılıdır, burada daha yüksek frekanslar daha hassas teslimatla sonuçlanabilir. Bununla birlikte, kafatasının zayıflaması, kafatasının ısınmasına ve kortikal alanlarda hasara yol açabilecek35 frekanslarıyla artar. Kesin hedefleme stratejisi beyin bölgesine bağlı olacaktır. Beyin dokusu içinde tam genişlikte yarım maksimum basıncın sığdığı bölgeler, striatum, orta beyin ve hipokampus gibi birçok beyin yapısında öngörülebilir ve güvenli BBB açılmasına izin verir. Beynin tabanına yakın bölgeler farelerde özel bir zorluk teşkil eder. Fare beyni, dorso-ventral yönde yaklaşık 8-10 mm'dir, bu da piyasada bulunan birçok dönüştürücünün tam genişlikte yarı maksimum boyutuyla karşılaştırılabilir. Sonuç olarak, kafatasının dibini hedeflemek, kulak kanallarında, ağızda veya nefes borusunda bulunan kemiklerden ve havadan ultrason yansımasına yol açabilir ve bu da öngörülemeyen yüksek ve düşük basınç modellerine yol açabilir36. Bu basınçların bazıları, kanamaya ve doku hasarına neden olduğu gösterilen bir atalet kavitasyon eşiğini geçebilir37. Kafatasının tabanına yakın bölgeleri hedeflemek için, kesişimsel genetik38'in gen ekspresyonunu FUS ışını ile hedeflenenden daha küçük bir alanla sınırlamak için kullanıldığı kesişimsel ATAC7'nin kullanılması tercih edilebilir. Yayınlanmış kesişimsel ATAC örneğinde, dopaminerjik hücrelerde bir gen düzenleme enzimini (Cre38) eksprese eden transgenik bir hayvan, dopaminerjik hücrelerin bulunduğu bölgenin alt bölümünde ultrason ile hedeflenmiştir. Son olarak, kortikal bölgeler FUS ile hedeflenebilir, ancak ultrasonun kırınımı ve yansıması meydana gelebilir ve bu da eşit olmayan basınç profillerine yol açabilir. Bu protokol, kullanılan türlere büyük ölçüde bağımlı olacağından kortikal bölgelerin hedeflenmesini kapsamaz; bununla birlikte, hipokampus 7'nin üzerindeki korteksin bir miktar hedeflendiği gözlemlenmiştir (örneğin, Şekil 7), en azından farelerde bunun mümkün olduğunu göstermektedir.

Kemogenetik aktivatör seçimi ve dozlama, spesifik deneysel ihtiyaçlara bağlı olacaktır. Yazarların çalışmalarından biri de dahil olmak üzere bir dizi çalışma7, önemli bir spesifik olmayan yanıtgöstermedi 39,40, daha yüksek dozlar (ör., 10 mg / kg) en azından bazı durumlarda41 yan etkilere neden olabilir. Bununla birlikte, tüm davranışsal deneylerde olduğu gibi, CNO ve metabolitlerinin42 potansiyel hedef dışı aktivitesi nedeniyle uygun kontroller31 gereklidir. Bu tür kontroller, DREADD'leri eksprese eden hayvanlara CNO ve salin kontrollerinin uygulanmasını ve CNO'nun vahşi tip hayvanlara uygulanmasını veya bazı özel durumlarda, sırasıyla kemogenetik reseptörleri eksprese eden ve eksprese etmeyen beynin ipsi ve kontralateral bölgelerinin karşılaştırılmasını içerebilir. Ek olarak, son araştırmalar, geliştirilmiş özgüllüğe sahip bir dizi yeni DREADD agonistiortaya çıkardı 28,29,43. Diğer kemogenetik reseptörler 5,25,44 de ATAC prosedürü ile birlikte kullanılabilir.

Gen ekspresyonunun histolojik değerlendirmesi, her hayvan için ölüm sonrası gereklidir. Hayvanların küçük bir kısmı, FUS-BBBO7'yi takiben zayıf gen ekspresyonu gösterir. Ek olarak, yanlış hedefleme mümkün olduğundan, gen ekspresyonunun uzamsal doğruluğunu ve özgüllüğünü göstermek gerekir. Bazı AAV'ler retrograd veya anterograd izleme yeteneği45 gösterebilir ve doğru ultrason hedeflemesine rağmen ultrason ile hedeflenen bölgeden uzakta transfeksiyona neden olabilir. Eksprese edilen kemogenetik reseptör bir floroforla kaynaşmışsa veya birlikte eksprese ediyorsa, doku kesitlerinde floroforun görüntülenmesi, ekspresyonun lokalizasyonunu ve yoğunluğunu değerlendirmek için yeterli olabilir. Bununla birlikte, birçok floresan proteini doku fiksasyon işlemi tarafından hasar görür ve DREADD'lerle sıklıkla kullanılan mCherry proteini için immün boyama, önceki çalışmalarda daha iyi sinyal vermiştir7. Son olarak, beynin belirli bölgelerindeki nöronların yoğunluğu nedeniyle (örneğin, hipokampustaki granüler hücre tabakası), hücre sayımlarını gerçekleştirmek için füzyonların aksine, IRES altında eksprese edilen nükleer lokalize floroforların kullanılması faydalı olabilir, çünkü çekirdekler DAPI veya TO-PRO-3 gibi nükleer lekelerle kolayca bölümlere ayrılabilir ve karşı boyanabilir. Nöromodülasyonu c-Fos boyama ile değerlendirmek için, herhangi bir floresan sinyali yerine nükleer karşı boyama yapmak ve c-Fos pozitif çekirdeklerini saymak zorunludur. Bazı durumlarda, hücresel kalıntılar floresan gösterebilir ve pozitif hücrelerin ölçümlerini karıştırabilir.

FUS-BBBO ile ilaç ve gen iletiminin sınırlamaları, invaziv intrakraniyal enjeksiyonlarla verilenden daha düşük çözünürlüğü ve daha büyük miktarlarda enjekte edilen ilaçlara veya viral vektörlere olan ihtiyacı içerir. Ek olarak, beyne doğrudan enjeksiyon, enjekte edilen bir bölgeye özel bir iletimle sonuçlanırken, FUS-BBBO, periferik dokulara olası bir iletimle sonuçlanan intravenöz bir yol kullanır. Nöromodülasyon için kemogenetik kullanımının sınırlamaları, nöromodülasyonun yoğunluğunda hızlı değişiklikler gerektiren bazı davranışsal protokoller için yetersiz olabilecek yavaş bir zaman ölçeğini içerir.

Açıklamalar

Çıkar çatışması yok.

Teşekkürler

Bu araştırma Beyin ve Davranış Vakfı, NARSAD Genç Araştırmacı Ödülü ile desteklenmiştir. Birkaç 3D baskılı bileşen orijinal olarak Fabien Rabusseau (Image Guided Therapy, Fransa) tarafından tasarlanmıştır. Yazar, makalenin hazırlanmasında teknik yardım için John Heath (Caltech) ve Margaret Swift'e (Caltech) teşekkür eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
21 gauge iğneler (BD)Fisher Scientific14826C
25 gauge kelebek kateterHarvard Bioscience725966
30 gauge iğneler (BD)Fisher Scientific14826F
Emici mavi pedOfis Deposu902406
Anti-c-Fos antikoruSanta Cruz BiyoteknolojiSC-253-G
Anti-mCherry antikoruThermofisherPA534974
Bruker Biospec 70/30BrukerözelRF bobinlerini içerir
Klozapin-n-oksitTocris4936
Özel tasarlanmış 3D baskılı fare koşumları ve MRIgFUS hedefleme bileşenleriImageGuidedTherapy, Szablowski laboratuvarıszablowskilab.org/downloads'ten
özel indirmeÖzel MRIgFUS makinesiImageGuidedTherapyN/A
Definity mikro kabarcıklarLantheusDE4
Gazdan arındırılmış susonik/ultrason jeliFisher Scientific5067714
Epilasyon crè meNairn/a
Sekiz elemanlı dairesel dizi dönüştürücüImasonic Inc.özel
Etanol Pedleri / Alkollü Bezler (% 70) (BD) OfisDeposu599893
HeparinSigma-AldrichH3149-25KU
İzofluranPatterson Veteriner07-893-1389
KetaminPatterson Veteriner07-890-8598
Nötr tamponlu formalin (% 10)Sigma-AldrichHT501128-4L
Fiber optik hidrofonHassas Akustik
PE10 boruFisher ScientificNC1513314
Peristaltik pompa
Fosfat tamponlu salin (PBS)Sigma-Aldrich524650-1EA
Prohance kontrast maddeBracco0270-1111-04
Tuzlu Fisher BilimselNC9054335
İkincil antikor, Eşek anti keçiThermoFisherA-11055
İkincil antikor, Eşek anti tavşanThermoFisher84546
Cerrahi makas (düz)Fisher Scientific17467480
ThermoGuide YazılımıImageGuidedTherapy
Doku yapıştırıcısı (Gluture)Fisher ScientificNC9855218
Tüberkülin Şırınga (1 mL) (BD)Fisher Scientific14823434
VeroClear 3D yazdırılabilir malzemeStratasysRGD810
Vialmix mikro kabarcık aktivasyon cihazıLantheusVMIX
Titreşimli mikrotomSıkıştırmaVF-300
KsilazinSigma-AldrichX1251-1G
,

Kaynaklar

  1. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  2. Zhang, F., Wang, L. -P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells. Nature Methods. 3, 785-792 (2006).
  3. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 5163-5168 (2007).
  4. Lerchner, W., et al. Reversible silencing of neuronal excitability in behaving mice by a genetically targeted, ivermectin-gated Cl- channel. Neuron. 54, 35-49 (2007).
  5. Magnus, C. J., et al. Chemical and genetic engineering of selective ion channel-ligand interactions. Science. 333, 1292-1296 (2011).
  6. Deeb, W., et al. Proceedings of the fourth annual deep brain stimulation think tank: a review of emerging issues and technologies. Frontiers in Integrative Neuroscience. 10, 38(2016).
  7. Szablowski, J. O., Lee-Gosselin, A., Lue, B., Malounda, D., Shapiro, M. G. Acoustically targeted chemogenetics for the non-invasive control of neural circuits. Nature Biomedical Engineering. 2, 475-484 (2018).
  8. Elias, W. J., et al. A pilot study of focused ultrasound thalamotomy for essential tremor. New England Journal of Medicine. 369, 640-648 (2013).
  9. Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4, 519-526 (2013).
  10. Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Noninvasive localized delivery of Herceptin to the mouse brain by MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 103, 11719-11723 (2006).
  11. Samiotaki, G., Acosta, C., Wang, S., Konofagou, E. E. Enhanced delivery and bioactivity of the neurturin neurotrophic factor through focused ultrasound-mediated blood-brain barrier opening in vivo. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 611-622 (2015).
  12. O'Reilly, M. A., Waspe, A. C., Chopra, R., Hynynen, K. MRI-guided disruption of the blood-brain barrier using transcranial focused ultrasound in a rat model. Journal of Visualized Experiments. (61), e3555(2012).
  13. Thévenot, E., et al. Targeted delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the brain, using magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound. Human gene Therapy. 23, 1144-1155 (2012).
  14. Hsu, P. -H., et al. Noninvasive and targeted gene delivery into the brain using microbubble-facilitated focused ultrasound. PloS One. 8, 58682(2013).
  15. Wang, S., Olumolade, O. O., Sun, T., Samiotaki, G., Konofagou, E. E. Noninvasive, neuron-specific gene therapy can be facilitated by focused ultrasound and recombinant adeno-associated virus. Gene Therapy. 22, 104(2015).
  16. Downs, M. E., et al. Long-Term Safety of Repeated Blood-Brain Barrier Opening via Focused Ultrasound with Microbubbles in Non-Human Primates Performing a Cognitive Task. PLoS One. 10, 0125911(2015).
  17. Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9, 2336(2018).
  18. Carpentier, A., et al. Clinical trial of blood-brain barrier disruption by pulsed ultrasound. Science Translational Medicine. 8, 343(2016).
  19. Sternson, S. M., Roth, B. L. Chemogenetic Tools to Interrogate Brain Functions. Annual Reviews Neurosciences. 37, 387-407 (2014).
  20. Alexander, G. M., et al. Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors. Neuron. 63, 27-39 (2009).
  21. Zhu, H., et al. Chemogenetic inactivation of ventral hippocampal glutamatergic neurons disrupts consolidation of contextual fear memory. Neuropsychopharmacology. 39, 1880-1892 (2014).
  22. Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Noninvasive, transcranial and localized opening of the blood-brain barrier using focused ultrasound in mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 33, 95-104 (2007).
  23. Thévenot, E., et al. Targeted delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the brain, using magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound. Human Gene Therapy. 23, 1144-1155 (2012).
  24. Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
  25. Yang, F. -Y., Fu, W. -M., Chen, W. -S., Yeh, W. -L., Lin, W. -L. Quantitative evaluation of the use of microbubbles with transcranial focused ultrasound on blood-brain-barrier disruption. Ultrasonics Sonochemistry. 15, 636-643 (2008).
  26. Vardy, E., et al. A New DREADD Facilitates the Multiplexed Chemogenetic Interrogation of Behavior. Neuron. 86, 936-946 (2015).
  27. Thompson, K. J., et al. DREADD Agonist 21 Is an Effective Agonist for Muscarinic-Based DREADDs in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology and Translational Sciences. 1, 61-72 (2018).
  28. Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357, 503-507 (2017).
  29. Nagai, Y., et al. Deschloroclozapine: a potent and selective chemogenetic actuator enables rapid neuronal and behavioral modulations in mice and monkeys. bioRxiv. , 854513(2019).
  30. Thompson, K. J., et al. DREADD Agonist 21 Is an Effective Agonist for Muscarinic-Based DREADDs in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology and Translational Science. 1, 61-72 (2018).
  31. Bullitt, E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. Journal of Comparative Neurology. 296, 517-530 (1990).
  32. Mahler, S. V., Aston-Jones, G. CNO Evil? Considerations for the use of DREADDs in behavioral neuroscience. Neuropsychopharmacology. 43, 934(2018).
  33. Gruber, B., Froeling, M., Leiner, T., Klomp, D. W. J. RF coils: A practical guide for nonphysicists. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 48, 590-604 (2018).
  34. Treat, L. H., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Transcranial MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening in rats. IEEE. 2, 998-1000 (2004).
  35. Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Feasibility of transcranial, localized drug-delivery in the brain of Alzheimer's-model mice using focused ultrasound. IEEE. 2, 988-991 (2005).
  36. Cobbold, R. S. Foundations of Biomedical ultrasound. , Oxford university press. (2006).
  37. Younan, Y., et al. Influence of the pressure field distribution in transcranial ultrasonic neurostimulation. Medical Physics. 40, 082902(2013).
  38. McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity. Physics in Medicine and Biology. 51, 793-807 (2006).
  39. Branda, C. S., Dymecki, S. M. Talking about a Revolution: The Impact of Site-Specific Recombinases on Genetic Analyses in Mice. Developmental Cell. 6, 7-28 (2004).
  40. Jendryka, M., et al. Pharmacokinetic and pharmacodynamic actions of clozapine-N-oxide, clozapine, and compound 21 in DREADD-based chemogenetics in mice. Scientific Reports. 9, 4522(2019).
  41. Manvich, D. F., et al. The DREADD agonist clozapine N-oxide (CNO) is reverse-metabolized to clozapine and produces clozapine-like interoceptive stimulus effects in rats and mice. Scientific Reports. 8, 3840(2018).
  42. Martinez, V. K., et al. Off-Target Effects of Clozapine-N-Oxide on the Chemosensory Reflex Are Masked by High Stress Levels. Frontiers in Physiology. 10, 521(2019).
  43. Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357, 503-507 (2017).
  44. Bonaventura, J., et al. High-potency ligands for DREADD imaging and activation in rodents and monkeys. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).
  45. Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89, 683-694 (2016).
  46. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of Transduction Efficiency, Tropism and Axonal Transport of AAV Serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the Mouse Brain. PLoS One. 8, 76310(2013).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Akustik Hedefli KemogenetikAdeno-İlişkili Viral VektörlerMikrobaloncuk AktivasyonuMRG Rehberliğinde Hedefleme3B Yazıcıyla Üretilmiş BileşenlerKuyruk Venine EnjeksiyonT1 Sinyal Artışı
Beyin Yapılarını Hedeflemek ve Kemogenetik Nöromodülasyonu Değerlendirmek için Odaklanmış Ultrason Kaynaklı Kan-Beyin Bariyeri Açılması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.