Yöntem makalesi

Tek Hücreli Türler Arası Bakteri Etkileşimlerinin Kinetik Görselleştirilmesi

DOI:

10.3791/61376

⸱

5 Ağustos 2020

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Carver College of Medicine, University of Iowa

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu canlı-bakteriyel hücre görüntüleme protokolü zaman içinde tek hücre düzeyinde birden fazla bakteri türü arasındaki etkileşimlerin görselleştirilmesiiçin izin verir. Hızlandırılmış görüntüleme, tek tek kültür veya ortak kültürdeki her bakteri türünün gözlemlenmesine olanak sağlar ve bireysel hücre hareketliliği ve canlılığı da dahil olmak üzere çok türler arası bakteri topluluklarındaki türler arası etkileşimleri sorgular.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polimikrobiyal topluluklar doğada her yerde bulunurlar, ancak etkileşimlerini tek hücre düzeyinde incelemek zordur. Böylece iki bakteriyel patojen arasındaki türler arası etkileşimi gözlemlemek için mikroskopi tabanlı bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntemin motile Gram-negatif patojen, Pseudomonas aeruginosa ve non-motile Gram-pozitif patojen, Staphylococcus aureus arasındaki etkileşimleri sorgulamak için kullanımı burada gösterilmiştir. Bu protokol, her türün bir kapak kayması ve bir agarose pedi arasında, hücreleri tek bir düzlemde koruyan ve hem uzay hem de zaman daki bakteri davranışlarının görselleştirilmesine olanak sağlayan bir eş-aşıdan oluşur.

Ayrıca, burada gösterilen zaman atlamalı mikroskopi, monokültürde bakteri türlerinin hareketliliğindeki değişiklikler ve diğer türlerle birlikte kültür de dahil olmak üzere iki veya daha fazla bakteri türü arasında gerçekleşen erken etkileşimleri görselleştirmek için idealdir. Mikroskopi kurulumundaki sınırlı numune alanının doğası nedeniyle, hücre popülasyonları çok yüksek olduğunda bakteri türleri arasındaki etkileşimlerin incelenmesi için bu protokol daha az uygulanabilir. Bununla birlikte, protokolün canlı ve ölü bakteri hücrelerinin görüntülenmesinde boyama, floresan muhabirler aracılığıyla gen veya protein ekspresyonunun sayısallaştırılması ve hem tek tür hem de çok tür deneylerinde bakteri hücresi hareketinin izlenmesi gibi birçok farklı uygulama bulunmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polimikrobiyal topluluklar doğada yaygındır, çevre çeşitli kapsayan1,2,3 ve insan nişler4,5. İnsan hastalığında en kötü üne sahip polimikrobiyal enfeksiyonların bazıları diş biyofilmleriiçerir 6, kronik yaralar7,8, ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı olan bireylerde solunum yolu enfeksiyonları9, ventilatör ilişkili pnömoni10, ve genetik hastalık kistik fibrozis (CF)11,12. Bu enfeksiyonlar genellikle çeşitli mikrobiyal türlerden oluşur; Ancak, Gram-pozitif bakteri Staphylococcus aureus ve Gram-negatif bakteri Pseudomonas aeruginosa arasındaki etkileşimleri yeni bir odak ortaya çıkmıştır. Bu organizmalarla birlikte enfekte olmuş ve in vitro analizleri içeren çalışmalar, hastalığın ilerlemesi, mikrobiyal sağkalım, virülans, metabolizma ve antibiyotik duyarlılığı üzerinde derin ve beklenmeyen etkilere sahip olabilecek rekabetçi ve işbirliğine dayalı etkileşimleri ortaya koymaktadır (Hotterbeekx ve ark. 201713 ve Limoli ve Hoffman 20193tarafından ayrıntılı olarak incelenmiştir).

Enfeksiyon sırasında türler arası etkileşimlere olan ilginin artması, polimikrobiyal topluluk davranışlarını incelemek için çeşitli yöntemler ortaya koymuştur. Tipik olarak, bu çalışmalar monokültür ve coculture arasındaki henotik farklılıkları araştırmak için plaka veya et suyu bazlı tahliller yararlanmış. Örneğin, katı yüzeylerde P. aeruginosa ve S. aureus koculturing büyüme inhibisyonu veya koloni fenotip, pigment veya polisakkarit üretimi14,,15,16değişiklikler görselleştirme için izin verdi. Karışık türler biyofilmler, biyotik veya abiyotik yüzeylerde, yanı sıra sıvı kültüründe bakteri türlerinin koculturing de büyüme değişiklikleri ölçümü sağlamıştır, metabolizma, antibiyotik tolerans, rekabet ve canlılık, gen ve protein ekspresyonuna ek olarak17,18. Bu toplu kültür deneyleri P. aeruginosa ve S. aureus'un toplum ölçeğinde birbirlerini nasıl etkileyebileceklerine dair içgörüler ortaya çıkarmış olsa da, tek hücre düzeyinde gerçekleşen etkileşimler hakkında önemli soruları cevaplayamamaktadırlar. Burada sunulan yöntem, zaman içinde bir topluluk içinde tek hücrelerin hareket, hücre canlılığı ve gen ekspresyonundaki değişikliklere odaklanarak türler arası etkileşimleri inceleme yaklaşımlarına katkıda bulunur.

Tek hücreli etkileşimler, hücrelerin toplu topluluğunda gerçekleşen etkileşimlerden büyük ölçüde farklı olabilir. Tek hücreli analiz yoluyla, bir topluluk içindeki heterojenlik, hücrelerin mekansal yerleşiminin toplum dinamiklerini nasıl etkilediğini veya bir grubun bireysel üyeleri içinde gen ve protein ekspresyon düzeylerinin nasıl değiştiğini incelemek için ölçülebilir. İzleme hücreleri, tek hücrelerin birden fazla nesil boyunca zaman içinde nasıl hareket edip nasıl hareket ettigini de içgörü sağlayabilir. Hücre hareketini ve gen ekspresyonundaki değişiklikleri eş zamanlı olarak izleyerek gen dalgalanmaları ile buna karşılık gelen fenotipler arasında korelasyonlar yapılabilir. Tek hücredüzeyinde tek tek bakteri türlerinin incelenmesi için önceki protokoller tanımlanmıştır. Bu çalışmalar tek bir düzlemde zaman içinde canlı görüntüleme hücrelerinin yararlanmak, ve hücre bölünmesi ve antibiyotik duyarlılık gibi fenotipler gözlemlemek için yararlı olmuştur19,20. Ek canlı görüntüleme mikroskopisi büyüme, hareketlilik, yüzey kolonizasyonu ve tek bakteri türlerinin biyofilmoluşumunuizlemek için kullanılmıştır 21,22,23. Ancak, bu çalışmalar monokültürde bakterilerin fizyolojisini anlamak için anlayışlı olmakla birlikte, coculture zaman içinde birden fazla bakteri türünün tek hücreli davranışgözlem için deneyler sınırlıdır.

Burada, tek türgörüntüleme için kullanılan önceki protokoller P. aeruginosa ve S. aureusarasındaki etkileşimleri incelemek için uyarlanmıştır. Bu organizmalar hücre morfolojilerine göre faz kontrastı altında ayırt edilebilirler(P. aeruginosa basilli, S. aureus ise kokidir). Bu yöntemin geliştirilmesi son zamanlarda S. aureus24varlığında P. aeruginosa daha önce tanımlanmamış hareketlilik davranışlarının görselleştirilmesi sağladı. P. aeruginosa'nın S. aureus'u uzaktan algılama ve S. aureus hücre kümelerine doğru artan ve yönlü tek hücreli hareketlerle yanıt verme yeteneğine sahip olduğu bulunmuştur. S. aureus doğru P. aeruginosa hareketi tip IV pili gerektiren bulundu (TFP), koordine uzantısı ve geri çekme seğirme hareketliliği denilen bir hareket oluşturmak saç benzeri projeksiyonlar25.

Bu çalışmalar türler arasındaki daha önceki etkileşimleri sorgulamak için bu yöntemin yararını göstermektedir. Ancak, daha sonraki etkileşim zaman noktalarında yüksek hücre yoğunluklarında görüntüleme, daha sonra tek hücre tabakalarının tanımlanamayacağı göz önüne alındığında zordur ve bu da çoğunlukla görüntüleme sonrası analiz sırasında sorunlara yol açabilir. Bu sınırlama göz önüne alındığında, yöntem daha sonra daha sonraki etkileşimleri temsil eden yüksek hücre yoğunlukları temsilcisi geleneksel makroskopik tahliller ile takip edilebilir önceki etkileşimler için en uygundur. Bu yöntemin ek sınırlamaları düşük iş bölümü doğasını içerir, çünkü bir seferde yalnızca bir örnek görüntülenebilir ve mikroskop, kamera ve çevre odasının maliyeti. Ayrıca floresan mikroskopisi fototoksisite ve fotobeyaztma gibi bakteri hücreleri için risk oluşturur, bu nedenle floresan görüntülerin elde edilebilir sıklığını sınırlayan. Son olarak, bu yöntemde kullanılan agarose pedleri, koşullar doğru değilse pedleri küçültmeye veya genişletmeye başlayabilir göz önüne alındığında, sıcaklık ve nem gibi koşulları kontrol etmek için kritik hale, ortamdaki değişikliklere son derece duyarlıdır. Son olarak, bu yöntem ana ortam taklit etmez iken, farklı bakteri türlerinin yüzeylerde nasıl tepki ipuçları sağlar, hangi çevresel / konak koşulları taklit etmek için tasarlanmış tahlillerde takip edilebilir.

Bu yöntem, tek hücreli hareketi takip eden önceki çalışmalardan farklıdır, bu hücreler bir coverslip ve agarose ped arasında aşılanmış, yüzeyhücreleri kısıtlayan. Bu, hücre izlemenin tek bir düzlemde zaman içinde izlenmesini sağlar; ancak, hücreler sıvı26'yabatırıldığında gözlenen geçici yüzey etkileşimdöngülerini sınırlar. Bir agarose ped altında görüntüleme bakterilerin bir diğer yararı klasik P. aeruginosa seğirme motilite25incelemek için kullanılan makroskopik plaka tabanlı yüzey altı inogülasyon tahlilleri taklit olmasıdır. Bu testte, bakteri hücreleri petri kabının alt kısmı ile agar arasında aşılanır, bu mikroskop protokolü gibi, kabın alt kısmından dışa doğru hareket ederken hücreleri tek bir düzlemde tutarlar.

Burada sunulan türler arası etkileşimleri görselleştirmek için hızlandırılmış mikroskopi protokolü 1) bakteri örneği ve agarose pedinhazırlanması, 2) görüntüleme edinimi için mikroskop ayarlarının seçilmesi ve 3) görüntüleme sonrası analizden oluşur. Hücre hareketinin ve takibinin ayrıntılı görselleştirilmesi, faz kontrastı ile kısa zaman aralıklarında görüntülerin elde edilmesiyle gerçekleştirilebilir. Floresan mikroskopisi de zaman içinde hücre canlılığını veya gen ekspresyonunu belirlemek için kullanılabilir. Burada, floresan mikroskobu için adaptasyon bir örnek agarose pedleri için canlılık boyaları eklenmesi ile göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokoldeki tüm sarf malzemelerinin tam açıklama ve katalog numaralarını Malzemeler Tablosu'nda bulabilirsiniz.

1. M8T minimal ortamın hazırlanması

  1. 2 L şişede 64 g Na2HPO4·7H2O, 15 g KH2PO4ve 800 mL ultra saf suda (UPW, direnç 18 MΩ/cm) 2,5 g NaCl eriterek 1 L M8 minimal tuz tabanı (5x) hazırlayın. pH 7.6'ya kadar. UPW ile 1 L'ye kadar tam ses düzeyi. 45 dk için otoklav.
  2. 1 L şişede 400 mL UPW'de 100 g glikoz uğrarak 500 mL glikoz çözeltisi (%20 w/v) hazırlayın. UPW ile 500 mL'ye komple çözüm. 45 dk için otoklav.
  3. 400 mL UPW'de 100 g tripton eriterek 500 mL tripton çözeltisi (%20 w/v) hazırlayın. UPW ile 500 mL'ye kadar tamamlayın. 45 dk için otoklav.
  4. 200 mL 5x M8 minimal tuz (1x final), 10 mL %20 glikoz (%0,2 final), 1 mL 1 MMG 1 MgSO4 (1 mM final) ve 50 mL %20 tryptone (%1 final) ilave ederek 1 L M8 + %10 tripon (M8T) minimal ortam hazırlayın. UPW ile 1 L'ye kadar tamamlayın. Steril 500 mL ortam depolama şişesine 0,2 m steril filtreden süzün.

1. Gün:

2. Bakteri bir gecede kültürlerinin hazırlanması

  1. 5 mL M8T minimal ortama tek bir P. aeruginosa veya S. aureus kolonisi ile aşılanın (uygun olduğunda antibiyotikler dahil) ve bir gecede 37 °C'de 16 saatten fazla havalandırma ile kuluçkaya yatırın.
    NOT: Bakteriyel patojenler P. aeruginosa ve S. aureus bu yöntem için kullanılmıştır, çünkü bunlar genellikle kronik enfeksiyonlardan koizole edilmiştir ve bunların etkileşimlerinin incelenmesi polimikrobiyal enfeksiyonlar sırasında hasta sonuçlarına nasıl katkıda bulunmalarını anlamak için önemlidir. Diğer bakteri türleri çalışmanın odağına bağlı olarak kullanılabilir.

2. Gün:

3. Bakteriyel suşların alt kültürü

  1. Alt kültür P. aeruginosa 1:500 ve S. aureus 1:1000 taze M8T 5 mL (uygun olduğunda antibiyotik içerir). Kültürler orta günlük fazına ulaşınceye kadar 37 °C'de kuluçkaya yatırın (OD600 = ~0,3 - 0,5).

4. Ped kalıpları için malzemelerin hazırlanması

  1. Düz ucun yarısı 90° açıya bükülene kadar düz, yuvarlak bir laboratuvar spatulasının ucunu Bunsen brülörüyle ısıtarak metal spatulahazırlayın. Başka bir düz, yuvarlak laboratuvar spatulasının ucunu ısıtın ve son 10 mm'yi 45 °C'lik bir açıya hafifçe bükün.
  2. Silikon kalıpların dört köşesini, kalıpların 35 mm'lik bir tabağa sığacak şekilde kesin.
  3. % 70 etanol ekleyerek ve Bunsen brülör alev onları geçirerek spatulalar ve cımbız bir çift sterilize.
  4. Çanak ve silikon kalıpları %70 etanol ile temizleyin ve tüy bırakmayan mendillerle kurulayın.

5. Agarose pedlerin hazırlanması

NOT: Pedler, bu protokolde kullanılan bakterilerin besin kaynağı olarak M8T minimal ortam ile hazırlanır. Ancak, pedleri kullanılan besin farklı organizmalar için değiştirilebilir.

  1. Temiz bir 50 mL Erlenmeyer şişesinde 10 mL M8T'de %2 düşük erime agarose eritin. Mikrodalga kısa aralıklarla (2-5 s) kadar agarose üzerinde kaynama gelen şişe içeriğini önlemek için çözelti içinde. Eritildikten sonra, en az 15 dakika 50 °C su banyosunda soğumaya bırakın.
  2. 35 mm çanak açıklık ile silikon kesim hizalayarak kalıpları hazırlayın ve çanak silikon güvenli ve kalıp ve çanak arasındaki tüm hava kabarcıkları kaldırmak için spatula ile hafifçe dokunun.
  3. Bir kez serin, pipet 915 μL erimiş agarose kalıp içine. Kapağı açık bırakın ve 30 dakika oda sıcaklığında ped kuru maya bırakın.
  4. Kapağı kapağı ile çanak ve ek bir 2 saat oda sıcaklığında bırakın.
  5. Tüy bırakmayan bir mendil sıkıca yuvarlayarak nem mendilleri hazırlayın. Haddelenmiş mendilin üzerine steril petri kabının içine yerleştirin ve sile doğru 500°L steril su ekleyin. 1 saat boyunca 37 °C'ye kadar ılık.
  6. 1 saat boyunca 37 °C'ye kadar pedi ve steril 35 mm çanak ısıtın.

6. Bakteri hücrelerinin hazırlanması ve aşı pedleri

  1. Her alt kültürün OD600'ü ölçün ve P. aeruginosa'yı OD600 = 0,03 ve S. aureus'u 37 °C'ye önceden ısıtılmış M8T'de600 = 0,10'a kadar seyreltin. P. aeruginosa ve S. aureus'u 1:1 oran ve girdap olarak karıştırın.
    NOT: Suşlar antibiyotik gerektiriyorsa, antibiyotikler bir gecede ve alt kültüre eklenebilir, ancak eşkültürdeki diğer türleri etkiliyorsa görüntüleme için türlerin karıştırılması nda eklenmemelidir. Plazmid stabilitesi ve antibiyotiklerin kokültürdeki tüm türler üzerindeki etkileri, kullanılan her organizma/plazmid için belirlenmelidir.
  2. Pipet 1 μL coculture eşit bir önceden ısıtılmış, steril 35 mm cam coverslip çanak altında.
  3. Steril cımbız kullanarak kalıptan silikon kesiti çıkarın.
  4. Steril spatulalar kullanarak pedi yemekten çıkarın.
    1. Yastık kenarının altında hafifçe bükülmüş spatula slip, baş aşağı kalıp tutarken, steril bir Petri plaka kapağı üzerine bırakın.
      NOT: Pedi dışarı zorlamamaya dikkat edin yoksa yırtın. Pedin hangi tarafının alt tabaka olduğunu takip edin.
  5. Pedi, 90° açılı spatulayı pedin altına kaydırarak ve aşılanmış kapak kaymasının üzerine yerleştirerek alt-yan aşağı bakteri hücreleriyle tabağa aktarın. 90° açılı spatulayı kullanarak pedi kapak kaymasına karşı temize çıkarın ve hava kabarcıklarını hafifçe bastırın.
  6. Nemli mendillerdeki fazla nemi çıkarın ve ardından yemeğin kenarına yerleştirin ve yüzeye dokunmadığından emin olun. Örnek görüntüleme için hazır.

7. Canlı görüntüleme için mikroskobun kurulması

  1. Deneysel kurulumdan en az 2 saat önce 37 °C'ye kadar sıcak çevre odası.
  2. Brightfield ve floresan görüntüleme için mikroskop, bilgisayar ve ışık kaynakları dahil olmak üzere tüm bileşenleri açın.
  3. Görüntüleme yazılımını açın ve ışık kaynaklarının bağlı ve çalışır durumda olduğundan emin olun.
  4. Tüm görüntü düzlemlerini hizalamak için Köhler aydınlatma27 gerçekleştirin.
    1. İlk olarak, bir "kukla" çanak kullanarak 20x hedefi ile odak işaretli coverslip getirmek. Kondansatör taretinin "açık" konuma ayarlandıklarına emin olun.
      NOT: Görüntü düzlemlerini düzgün bir şekilde hizalamak için her benzersiz amaç/örnek için Köhler aydınlatması yapılmalıdır. Ancak, odak ve düşük büyütme üzerinde "kukla" çanak ile uyum kurulum ve deneme başlangıç zamanı arasındaki zamanı sınırlamak için daha yüksek büyütme canlı numuneler üzerinde kurulum hızlandırır.
    2. Kondansiyi odakla.
      1. Alan diyaframını kapatın.
        NOT: Sekizgen şekilli bir diyafram açıklığı görünmelidir. Kondansatör tamamen odak dışında ise, tüm görüş alanı (FOV) koyu görünür.
      2. Sekizgen kenarlar net olana kadar kondansatör odaklama düğmelerini döndürün.
        NOT: Görüntü düzlemleri doğru hizaya yaklaştıkça ışık yoğunluğu artacaktır.
    3. Kondansiyi hizala.
      1. Hizalama düğümlerini ayarlayarak alan kondansini ortala.
        NOT: Sekizgen FOV'un ortasına ortalanmalıdır. Hizalama düğümleri mikroskoba bağlı olarak değişir. Örneğin, bazı mikroskop kondansatörleri tonoblara sahipken, bazılarında tornavida gerektiren vidalar vardır.
    4. Lamba filamentine odaklanın ve kondansatör diyaframAçıklığını ayarlayın.
      1. Hedefin arka odak düzlemini gözlemlemek için ışık yoluna bir faz teleskopu veya Bertrand lens yerleştirin.
        NOT: İki eşmerkezli daire olmalıdır.
      2. Halkalar net görünene kadar Bertrand lens odak düğmesini çevirin.
      3. Bertrand lensini ışık yolundan çıkarın.
    5. Sekizgen FOV'un hemen dışında olana kadar alan diyaframını açın.
    6. 100x hedefine değiştirin ve bir damla daldırma yağı eklemeden önce eşleşen faz halkasını yerine kaydırın ve hazırlanan numune kabını en üste yerleştirin.
    7. Bakteriyel örnek çanak ile 100x objektif Köhler aydınlatma gerçekleştirin.
  5. Sadece ince ayar kullanarak bakterilere odaklanın. FOV'daki bakteriler mercek boyunca odaklandıktan sonra, mikroskoptaki kamera düğmesine basarak ışık yolunu kameraya çevirin.
  6. Görüntüleme yazılımında Aşama seçeneğini tıklatın.
  7. Yazılımdaki ışık kaynağını seçerek ve kullanılmak üzere istenilen ışık yüzdesini el ile girerek veya Çubuğu ışık yüzdesi ölçeğinde kaydırarak yayılan DIA LED ışığının yüzdesini ayarlayın.
  8. Dia LED ışık pozlama süresini, ışık kaynağına tıklayarak ve istenilen pozlama süresini manuel olarak girerek veya sağlanan açılır menüden bir pozlama süresi seçerek ayarlayın.
    NOT: Pozlama süresi kullanılan kameraya bağlı olarak değişir.
  9. Floresan kullanıyorsanız, ilgili her kanaldaki kamera ayarlarını (örneğin, TxRed, GFP) floresan kanalına tıklayarak ayarlayın.
    1. Yayılan floresan ışığının yüzdesini ayarlayın, ardından pozlama süresini ayarlayın (DIA LED ışığı için 7,7 ve 7,8 adımlarında yapıldığı gibi).
    2. Alternatif olarak, görselleştirme denetimleri açılır menüsündeki diğer bit derinliği seçeneklerinden birini seçerek dinamik aralığı ayarlamak için bit derinliğini değiştirin.
  10. Edinme denetimleri menüsündeki XY seçeneğini tıklayarak ilgi çekici XY konumlarını seçin.
    1. Sahne konumunu sevinç çubuğuyla veya ekrandaki FOV'u tıklatıp sürükleyerek taşıyın ve belirli bir konumun X ve Y koordinatlarını kaydetmek için boş kutuya tıklayın.
      NOT: En fazla üç farklı XY pozisyonunun seçilmesi, mümkün olduğunca birbirine yakın, hızlandırılmış edinim için önerilir.
  11. Satın alma kontrol menüsünün XY sekmesindeki PFS kutusunu tıklatarak veya joy stick kontrol panelindeki PFS düğmesine basarak mükemmel odak sistemini (PFS) açın.
  12. Bakteri hücrelerine odaklanmak için ince ayar düğümlerini döndürün.
  13. Hücreler istenilen odak düzleminde olduktan sonra her XY konumu için PFS düğmesini tıklatın.
    NOT: PFS, zaman atlamalı deneyler sırasında Z eksenindeki sürüklenmeyi telafi eder. Bu zaman içinde bakteri hücrelerinin odak korumak için gereklidir. Farklı üretimler farklı kompanzasyon sistemlerine sahiptir.
  14. Edinme denetimleri menüsündeki seçeneklerden seçim yaparak her kanal için satın alma aralığı ve sıklığı (örneğin, faz kontrastı ve her florofor) dahil olmak üzere görüntü edinme koşullarını seçin.
    NOT: Burada sunulan deneylerde faz kontrastı görüntüleri her 5-10 sn aralıklarla elde edilirken, GFP ve TxRed kanallarındaki floresan görüntüler her 20 dakikada bir elde edilir.
  15. Mikroskop ve edinme ayarları ayarlandıktan sonra görüntülemeye başlayın.

8. İsteğe bağlı: Canlı/ölü görüntüleme için modifikasyonlar

  1. M8T'nin 10 mL'sinde %2 agarose eritin ve 50 °C su banyosunda en az 15 dakika soğumaya bırakın.
  2. Erimiş agarose propidium iyodür 1 mM ekleyin.
  3. Soğuduktan sonra, hazırlanan kalıpta 915 μL agarose.
  4. Kapağı açık bırakın ve 30 dakika oda sıcaklığında ped kuru maya bırakın. Işıktan koruyun.
  5. Kapağı kapağı ile çanak ve ek bir 2 saat oda sıcaklığında bırakın.
  6. Nem mendilleri hazırlayın.
    1. Tüy bırakmayan bir kağıdı sıkıca yuvarlayın.
    2. Mendili steril bir Petri kabına yerleştirin ve menisine 500°L steril su ekleyin.
    3. 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
  7. 37 °C'de 1 saat boyunca pedi ve steril 35 mm çanak kuluçkaya yatırın.
  8. Bölüm 6'da belirtildiği gibi çanak aşılamaya devam edin: Bakteri hücrelerinin hazırlanması ve aşıpedleri.

9. Veri analizi

  1. Hücrelerin tanımlanması
    1. Görüntüleme yazılımındaki görüntü dosyasını açın ve dosyayı yalnızca izleme için kullanılacak çerçeveleri içerecek şekilde kırpın, ilgi hücrelerine yakınlaştırın ve yalnızca faz kontrast ı sevesi kanalında.
      NOT: Kırpılan dosya, izleme verilerinin özgün dosyaya müdahale etmeden depolanabileceği yeni bir dosya olarak kaydedilebilir.
    2. Çözümleme denetimleri menüsünde ilgi çekici bölgeleri (YG) seçme seçeneğini seçin ve analiz için kullanılacak ilk karedeki tek tek bakteri hücrelerini veya hücre kümelerini izleyerek ROI'ları tanımlayın.
      NOT: ROI'lar el ile veya ikili olarak tanımlanabilir.
      1. Yatırım Getirisini el ile tanımlayın
        1. RoI'ları el ile tanımlamak için her bir bakteri hücresinin veya hücre kümelerinin çevresini izlendirin.
          NOT: Analiz yazılımında, P. aeruginosa, veya diğer çubuk şekilli hücreler, Ellips Yatırım Getirisi seçilerek ve bakteri hücresinin boyutuna göre ayarlanmış bir elips çizilerek elle izlenebilir. Alternatif olarak, çokgen yatırım getirisi seçeneği, hücre kümeleri gibi geleneksel olmayan şekilli ROI'ları izlemek için seçilebilir.
      2. İkili ROI'ları tanımlayın
        1. İkili ROI'ları tanımlamak için İkili YG seçeneğini tıklatın.
          NOT: Nesneler, faz kontrast ı kanalındaki daha açık pikselli arka plandan koyu pikselli bakteri hücrelerinin ayrılmasına dayanan ikili bir katmanda tanımlanır.
        2. Hücreleri eşlemek için çözümleme denetimleri menüsünde Eşik seçeneğini belirleyin. İlgi kanalını seçin ve eşik aralığı değerlerini ayarlamak için floresan histogramındaki çubukları kaydırın.
          NOT: ROI'lar için ikili nesne tanımlaması, bakteri hücrelerinin eşiğine gelindiğinde floresan görüntülerde de tanımlanabilir. Eşik, hangi floresan yoğunluklarının nesne olarak kabul edilir ve hangi floresan yoğunlukları arka planı oluşturur.
  2. Hücre izleme
    1. ROI'ları el ile izlemek için, görüntüleme dizisindeki bir sonraki kareyi seçin ve her YG'yi orijinal bakteri hücresinin yeni konumuyla hizalamak üzere tıklatıp sürükleyerek ROI'ların konumunu ayarlayın.
      NOT: Bakteri hücrelerinin konumları değişmemişse, ROI'ların taşınması gerekmez.
    2. Hücrelerin izlendiği tüm sıralı karelerde tekrarlayın.
    3. Hücreler bölündükçe, adım 9.1'de açıklandığı gibi, kız hücreleri yeni ROI'lar olarak tanımlayın ve yeni bölünmüş hücreleri izlemeye başlayın.
      NOT: Hücreler ikili olarak tanımlanırsa, seçili karelerde ROI'ları otomatik olarak izlemek için Parça İkilileri işlevini kullanın.
    4. Hücreler seçili tüm kareler boyunca izlendikten sonra, analiz edilecek verileri dışa aktarın.
    5. Veri tablosunu açın ve analiz için gereken ölçümleri (örneğin, nesne hızı, ivme veya yol uzunluğu) tanımlayın.
      NOT: Yönlendirselliğin ölçülmesi durumunda Yol Uzunluğu ve Çizgi Uzunluğu ölçümleri gereklidir. Çizgi Uzunluğu, Öklidizya mesafesinin veya pist inden S. aureus kolonisinin kenarına doğru düz bir mesafenin ölçümüdür. Yol Uzunluğu, biriken mesafenin veya tüm çerçevelerden parça segmentlerinin toplamının bir ölçüsüdür. Yönlendirilme, Ökaryodi uzaklığı, D(E), (Çizgi Uzunluğu), birikmiş mesafe, D(A), (Yol Uzunluğu) oranı olarak hesaplanabilir.
  3. Floresan nicelleştirme
    1. Adım 9.1'de açıklandığı gibi floresan bakteri hücreleri için ROI'ları tanımlayın.
    2. Kalan floresan çerçevelerde bakteri hücreleri veya kümeler için ROI'ların izini veya hareketini tekrarlayın.
    3. Floresan yoğunluğunun analizi için oluşturulan tabloyu elektronik tablo dosyasına dışa aktarın.
    4. Veri tablosunda, izlenen bakteri hücresi(ler) Yatırım Getirisi için ortalama floresan yoğunluğunu temsil eden "Ortalama Yoğunluk" sütununa bakın.
    5. Zaman içinde floresan daki değişimlere bakmak için Ortalama Yoğunluk değerlerini grafiklendirin.
      NOT: Floresan'ın zaman içinde değişimi, floresan olarak etiketlenmiş gen için gen ekspresyonundaki dalgalanmayı temsil eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan yöntemin başarılı bir şekilde kullanılması, türler arası etkileşimlerin zaman içinde gözlemlenebildiği bir video oluşturan bir dizi kareyle sonuçlanır. Şekil 1'deki şema, görüntüleme için malzemelerin hazırlanmasında yer alan önemli adımları vurgulamak için görsel bir görüntü sağlar. Bu yöntemin kullanımı S. aureusile coculture karşı monokültür farklı davranışlar sergileyen P. aeruginosa hücrelerinin gösteri izin verdi. S. aureusile birlikte, P. aerug...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan yöntemler, hücre izleme ve hücre canlılığının izlenmesi de dahil olmak üzere diğer uygulamalar için değişiklikler ile tek hücre düzeyinde bakteri türleri etkileşimlerinin canlı hücre görüntüleme için bir protokol açıklar. Bu yöntem, mikroorganizmaların zaman içinde diğer türlerle birlikte tek hücreli davranışlarını incelemek için yeni yollar açılmaktadır. Özellikle protokol, özellikle hem yüzey hem de sıvı ile ilişkili uzantıları olan organizmaların hareketliliği incelerken bakteriyel yüzey davranışlarını ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar açıklayacak bir şey olmadığını beyan ediyorlar.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Kistik Fibrozis Vakfı Postdoc-to-Fakülte Geçiş Ödülü LIMOLI18F5 (DHL), Kistik Fibrozis Vakfı Junior Faculty Recruitment Award LIMOLI19R3 (DHL) ve NIH T32 Eğitim Hibe 5T32HL007638-34 (ASP) tarafından finanse edilerek desteklenmiştir. Jeffrey Meisner, Minsu Kim ve Ethan Garner'a görüntüleme ve ped yapımı için ilk protokolleri ve tavsiyeleri paylaştıkları için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
< güçlü > agaroz pedler< / güçlü>
35 mm 20 mm Mikro kuyulu Cam Alt Çanak # 1.5 Kapak CamCellvisD35-20-1.5-NBiri agaroz ped kalıpları için, biri deney için
KimWipesKimberly-Clark Professional06-666A
Düşük Eriyik AgarozNu-Elek GTG/Lonza50081Agaroz pedleri
yapmak içinYuvarlak Tabanlı SpatulalarVWR82027-492
Yuvarlak Konik SpatulalarVWR82027-530
Silikon İzolatörler, Presle Sızdırmazlık, 1 kuyulu, D çapı 2,0 mm 20 mm, silikon/yapıştırıcıSigma-AldrichS6685-25EAAgaroz ped kalıpları için
Steril Petri Plakaları, 85 mmKord-Valmark / RPI2900
CımbızVWR89259-944
M8T Minimal Ortam
D (+) GlikozRPIG32045
KH2PO4RPIP250500
MgSO4Sigma-Aldrich208094
NaClRPIS23025
Na2< / sub>HPO4< / sub>.7H2< / sub>OSigma-Aldrich230391
TriptonBD BiosciencesDF0123173
Mikroskobu
Andor Sona 4.2B-11Andor77026135Kamera. 4.2 Megapiksel Arkadan aydınlatmalı sCMOS, 11 & mu; m piksel, %95 QE, 48 fps, USB 3.0, F yuvası.
Filtre Küpü GFPNikon96372Filtre küpü
Filtre Küpü TxRedNikon96375Filtre küpü
H201-NIKON-TI-S-EROkolab77057447Sahne üstü kuluçka makinesi
GA3 ve 2D ve 3D izleme özellikli Nikon NIS-Elements AR77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950Veri analizi için yazılım
Nikon Ti2 EclipseNikonModel Ti2-EMikroskobu
CFI Plan Apo ƛ 20x objektif (0.75NA)NikonMRD00205Objektif
CFI Planı Apo ƛ 100x yağ Ph3 DM objektif (1.45NA)Dahili
fanlı ısıtıcılara sahip Nikon MRD31905 Objektif ThermoBoxTokai HitTI2TB-E-BKMuhafaza
Bakteriyel Suşlar
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT)PMID: 7604262mukoid olmayan prototrof
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP)PMID: 9361441
Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2PMID: 26041805
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT)PMID: 23404398USA300 CA-Metisilin dirençli suş LAC, plazmid içermez
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP)PMID: 20829608
Staphylococcus aureus USA300 LAC Δ agrBDCAPMID: 31713513
Canlılık Boyası
Propidyum İyodürInvitrogenL7012CANLI/ÖLÜ ve ticaret; BacLight ve ticaret; Bakteriyel Canlılık Kiti
tarafından satılmaktadır

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lamichhane, J. R., Venturi, V. Synergisms between microbial pathogens in plant disease complexes: a growing trend. Frontiers in Plant Science. 6, 385(2015).
  2. Cursino, L., et al. Identification of an operon, Pil-Chp, that controls twitching motility and virulence in Xylella fastidiosa. Molecular Plant-Microbe Interactions. 24 (10), 1198-1206 (2011).
  3. Limoli, D. H., Hoffman, L. R. Help, hinder, hide and harm: what can we learn from the interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus during respiratory infections. Thorax. 74, 684-692 (2019).
  4. Gabrilska, R. A., Rumbaugh, K. P. Biofilm models of polymicrobial infection. Future Microbiology. 10 (12), 1997-2015 (2015).
  5. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Microbial biofilms: e pluribus unum. Current Biology. 17 (10), 349-353 (2007).
  6. Marino, P. J., et al. Community analysis of dental plaque and endotracheal tube biofilms from mechanically ventilated patients. Journal of Critical Care. 39, 149-155 (2017).
  7. Frank, D. N., et al. Microbial diversity in chronic open wounds. Wound Repair and Regeneration. 17, 163-172 (2009).
  8. Fazli, M., et al. Nonrandom distribution of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in chronic wounds. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4084-4089 (2009).
  9. Shimizu, K., et al. Pathogens in COPD exacerbations identified by comprehensive real-time PCR plus older methods. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 10, 2009-2016 (2015).
  10. Behnia, M., Logan, S. C., Fallen, L., Catalano, P. Nosocomial and ventilator-associated pneumonia in a community hospital intensive care unit: a retrospective review and analysis. BMC Research Notes. 7, 232(2014).
  11. Maliniak, M. L., Stecenko, A. A., McCarty, N. A. A longitudinal analysis of chronic MRSA and Pseudomonas aeruginosa co-infection in cystic fibrosis: a single-center study. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 350-356 (2016).
  12. Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (6), 947-953 (2016).
  13. Hotterbeekx, A., Kumar-Singh, S., Goossens, H., Malhotra-Kumar, S. In vivo and in vitro interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus spp. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7 (106), (2017).
  14. Smith, K., et al. Aspergillus fumigatus enhances elastase production in Pseudomonas aeruginosa co-cultures. Medical Mycology. 53, 645-655 (2015).
  15. Michelson, C. F., et al. Staphylococcus aureus alters growth activity, autolysis, and antibiotic tolerance in a human host-adapted Pseudomonas aeruginosa lineage. Journal of Bacteriology. 196 (22), 3903-3911 (2014).
  16. Ngamdee, W., et al. Competition between Burkholderia pseudomallei and B. thailandensis. BMC Microbiology. 15, 56(2015).
  17. Heir, E., Møretrø, T., Simessen, A., Langsrud, S. Listeria monocytogenes strains show larger variations in competitive growth in mixed culture biofilms and suspensions with bacteria from food processing environments. International Journal of Food Microbiology. 275, 46-55 (2018).
  18. Lutz, C., Thomas, T., Steinberg, P., Kjelleberg, S., Egan, S. Effect of interspecific competition on trait variation in Phaeobacter inhibens biofilms. Environmental Microbiology. 18 (5), 1635-1645 (2016).
  19. Meisner, J., et al. FtsEX is required for CwlO peptidoglycan hydrolase activity during cell wall elongation in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 89 (6), 1069-1083 (2013).
  20. Coates, J., et al. Antibiotic-induced population fluctuations and stochastic clearance of bacteria. eLife. 7, 32976(2018).
  21. Korber, D. R., Lawrence, J. R., Sutton, B., Caldwell, D. E. Effect of laminar flow velocity on the kinetics of surface recolonization by Mot+ and Mot- Pseudomonas fluorescens. Microbial Ecology. 18, 1-19 (1989).
  22. Lawrence, J. R., Korber, D. R., Caldwell, D. E. Behavioral analysis of Vibrio parahaemolyticus variants in high- and low- viscosity microenvironments by use of digital image processing. Journal of Bacteriology. 174 (17), 5732-5739 (1992).
  23. Lawrence, J. R., Wolfaardt, G. M., Korber, D. R. Determination of diffusion coefficients in biofilms by confocal laser microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 60 (4), 1166-1173 (1994).
  24. Limoli, D. H., et al. Interspecies interactions induce exploratory motility in Pseudomonas aeruginosa. eLife. 8, 47365(2019).
  25. Burrows, L. Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 493-520 (2012).
  26. Lee, C. K., et al. Multigenerational memory and adaptive adhesion in early bacterial biofilm communities. PNAS. 115 (17), 4471-4476 (2018).
  27. Tolosa, A., et al. Enhanced field-of-view integral imaging display using multi-Köhler illumination. Optical Society of America. 22 (26), 31853-31863 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tek H cre TakibiZaman Atlamal MikroskopiPseudomonas aeruginosaStaphylococcus aureusAgaroz Ped Haz rlamaFloresan G r nt lemeH cre Canl l BoyamaGen Ekspresyon AnaliziMotilite Kantifikasyonu

İlgili makaleler