Kas glukoz alımının bozulmamış bir şekilde düzenlenmesi, tüm vücut glikoz homeostazını korumak için önemlidir. Bu protokol, çeşitli fizyolojik müdahalelerin tüm vücut glikoz metabolizması üzerindeki etkisini tanımlarken, izole ve inkübe edilmiş olgun iskelet kasında insülin ve kontraksiyonla uyarılmış glikoz alımının değerlendirilmesini sunar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Farelerden İzole ve İnkübe Olgun İskelet Kasında İnsülin ve Kasılma ile Uyarılmış Glikoz Alımının Ölçülmesi
Bu makalede
Özet
Özet
İskelet kası insüline duyarlı bir dokudur ve tipik olarak bir yemekten sonra kana giren glikozun çoğunu alır. Ayrıca, iskelet kasının egzersiz sırasında kandan glikoz ekstraksiyonunu dinlenme koşullarına kıyasla 50 kata kadar artırabileceği bildirilmiştir. Egzersiz ve insülin stimülasyonu sırasında kas glukoz alımındaki artış, glikoz taşıyıcı 4'ün (GLUT4) hücre içi bölmelerden kas hücresi yüzey zarına translokasyonuna ve ayrıca glikozun heksokinaz II tarafından glikoz-6-fosfata fosforilasyonuna bağlıdır. M. soleus ve m . extensor digitorum longus (EDL) gibi fare kaslarının izolasyonu ve inkübasyonu, insülin ve elektriksel olarak indüklenen kontraksiyonun (egzersiz için bir model) olgun iskelet kasında glikoz alımı üzerindeki etkilerini incelemek için uygun bir ex vivo modeldir. Böylece, ex vivo model, kas insülin duyarlılığının değerlendirilmesine izin verir ve kas glikoz alımının ölçümleri sırasında kas liflerinin düzgün bir şekilde alınmasını sağlayan kasılma sırasında kas kuvveti üretimini eşleştirmeyi mümkün kılar. Ayrıca, tarif edilen model, kas insülin duyarlılığı üzerinde etkisi olabilecek veya iskelet kası glikoz alımının düzenleyici karmaşıklığını tanımlamaya çalışırken yardımcı olabilecek farmakolojik bileşik testi için uygundur.
Burada, hücre dışı bir belirteç olarak radyoetiketli [3H]2-deoksi-D-glukoz ve [14C] mannitol kullanılarak farelerden izole edilmiş ve inkübe edilmiş soleus ve EDL kas preparatlarında insülin ve kasılma ile uyarılmış glikoz alımının nasıl ölçüleceğine dair ayrıntılı bir protokol açıklıyor ve sunuyoruz. Bu, olgun iskelet kasındaki glikoz alımının, bozulmamış hayvan modeline müdahale edebilecek kafa karıştırıcı faktörlerin yokluğunda doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Ek olarak, inkübe edilmiş fare iskelet kasının metabolik canlılığı hakkında bilgi veriyoruz, bu da uygulanan yöntemin kas enerjisi metabolizmasını incelerken belirli koşullar altında bazı uyarılara sahip olduğunu düşündürmektedir.
Giriş
İskelet kası, insülin ve egzersize yanıt olarak hücre dışı boşluktan büyük miktarlarda glikoz çıkarma yeteneğine sahiptir. Bu, tüm vücut glikoz homeostazının korunmasına yardımcı olur ve yüksek enerji talebi zamanlarında glikoz arzını güvence altına alır. İskelet kası glukoz alımının bozulmamış bir şekilde düzenlenmesinin genel sağlık ve fiziksel performans için önemli olduğu gösterildiğinden1,2, çeşitli koşullar sırasında kas glikozu alımının ölçümleri çok dikkat çekmiştir. İnsanlarda ve hayvanlarda, hiperinsülinemik-öglisemik kelepçe, insülin duyarlılığını in vivo 3,4
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Araştırma hayvanlarını içeren prosedürler, ilgili kılavuzlara ve yerel mevzuata uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Bu çalışma için kullanılan tüm hayvan deneyleri, Deneysel ve Diğer Bilimsel Amaçlar için kullanılan Omurgalı Hayvanların Korunmasına İlişkin Avrupa Sözleşmesi'ne uygun ve Danimarka Hayvan Deneyleri Müfettişliği tarafından onaylanmıştır.
1. Deney aparatlarının ve dikiş ilmeklerinin hazırlanması
NOT: Bu çalışma için, izole edilmiş fare iskelet kaslarını inkübe etmek için özelleştirilmiş inkübasyon kancalarına sahip entegre bir kas şeridi miyograf sistemi kullanın (Şekil 1).....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 2'de gösterildiği gibi, bazal glikoz alım oranları, dişi farelerden izole soleus ve EDL kası arasında benzerdi. Bu da12,13,19,20'den önce birkaç kez bildirilmiştir. Glikoz alımı, submaksimal olarak etkili bir insülin konsantrasyonuna (100 μU / mL) yanıt olarak, soleus ve EDL kasında sırasıyla 12 ve 9 μmol / g protein / s'ye ul.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
İskelet kasında glikoz alımının bozulmamış bir şekilde düzenlenmesi, genel sağlığın korunması için önemlidir1. Bu nedenle, kas glukozu alımının araştırılması, çeşitli sağlık değiştirici müdahaleleri değerlendirirken genellikle birincil okuma görevi görür. Burada, insülin ve elektriksel olarak indüklenen kasılmalara yanıt olarak farelerden izole ve inkübe edilmiş soleus ve EDL kasında glikoz alımını ölçmek için bir ex vivo yöntemi tanımlamaktayız. Yöntem hızlı ve güvenilirdir ve kanda bulunabilecek.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur
Teşekkürler
Bu çalışma, Danimarka Bağımsız Araştırma Konseyi - Tıp Bilimleri (FSS8020-00288B) ve Novo Nordisk Vakfı'ndan (NNF160C0023046) gelen hibelerle desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda Novo Nordisk Vakfı tarafından finanse edilen Danimarka Diyabet Akademisi'nden Rasmus Kjøbsted'e NNF17SA0031406 hibe numaralı bir araştırma hibesi ile desteklendi. Yazarlar, yetenekli teknik yardımları için Karina Olsen, Betina Bolmgren ve Irene Bech Nielsen'e (Kopenhag Üniversitesi Fen Fakültesi Beslenme, Egzersiz ve Spor Bölümü) teşekkür eder.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| [14C] D-mannitol | Amerikan Radyoaktif İşaretli Kimyasallar, Inc. | ARC 0127 | |
| [3H] 2-deoksi-D-glikoz ve nbsp; | Amerikan Radyoaktif İşaretli Kimyasallar A.Ş. | ART 0103A | |
| 2-Deoksi-D-glikoz | Sigma | D8375 | |
| 4-0 USP steril olmayan cerrahi naylon sütür | Harvard Aparatı | 51-7698 | |
| Streptavidin / HRP (Konjugat) | DAKO | P0397 | ACC proteini |
| Akt2 antikorunu | Hücre Sinyali | 3063 | |
| AMPK & alfa; 2 antikor | Santa Cruz | SC-19131 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidin | Sigma | B6505 | |
| Sığır serum albümini (BSA) | Sigma | A7030 | |
| CaCl2 | Merck | 1020831000 | |
| Kalibrasyon kiti (kuvvet) | Danimarkalı Myo Technology A/S | 300041 | |
| Kemilüminesans | Millipore | WBLUF0500 | |
| D-Glikoz | Merck | 1084180100 | |
| D-Mannitol | Sigma | M4125 | |
| Veri toplama programı | National Instruments | LabVIEW yazılım sürümü 7.1 | |
| Diyaliz tüpü | Visking | DTV.12000.09 Boyut No.9 | |
| Dijital görüntüleme sistemi | BioRad | ChemiDoc MP | |
| EDTA | Sigma EDS | E9884 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Elektrik Nabız Stimülatörü | Digitimer | D330 MultiStim Sistemi | |
| Gliserol | Sigma | G7757 | |
| HEPES | Sigma | H7637 | |
| IGEPAL CA-630 ve nbsp; | Sigma | I8896 | |
| İnsülin | Novo Nordisk | Actrapid, 100 IE/mL | |
| KCl | Merck | 1049361000 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873025 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| MgSO4 | Merck | 1058860500 | |
| Kas Şeridi Miyograf Sistemi | Danimarka Myo Teknolojisi A/S | Model 820MS | |
| Na-Ortovanadat | Sigma | S6508 | |
| Na-Pirofosfat | Sigma | 221368 | |
| Na-Piruvat | Sigma | P2256 | |
| NaCl | Merck | 106041000 | |
| NaF | Sigma | S1504 | |
| NaHCO3 | VWR | 27778260 | |
| pACC Ser212 antikor | Hücre Sinyali | 3661 | |
| pAkt Thr308 antikor | Hücre Sinyali | 9275 | |
| pAMPK Thr172 antikor | Hücre Sinyali | 2531 | |
| fenilmetilsülfonilflorür | Sigma | P7626 | |
| Platin elektrotlar | Danimarkalı Myo Teknolojisi A/S | 300145 | |
| pTBC1D4 Ser588 antikor | Hücre Sinyali | 8730 | |
| Sintilasyon sayacı | Perkin Elmer | Tri-Carb-2910TR | |
| Sintilasyon sıvısı | Perkin Elmer | 6013329 | |
| İstatistiksel analiz yazılımı | Systat | SigmaPlot sürüm 14 | |
| TBC1D4 antikoru | Abcam | ab189890 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| Ultra saf su | Merck | Milli-Q Referans A + Sistemi | |
| ve beta; - gliserofosfat | Sigma | G9422 |
Kaynaklar
- DeFronzo, R., Tripathy, D. Skeletal muscle insulin resistance is the primary defect in type 2 diabetes. Diabetes Care. 32, suppl_2 157-163 (2009).
- Coyle, E. F., et al. Carbohydrate feed....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
