Method Article

Ekstra Hücresel Matris Tabanlı ve Ekstra Hücresel Matrissiz Murine Testiküler Organoidlerin Üretimi

DOI:

10.3791/61403

⸱

October 7th, 2020

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada primer neonatal murine testis hücrelerinden testis organoidi üretmek için dört yöntem tanımlanmıştır. Bu teknikler birden fazla araştırma uygulamasına sahiptir ve özellikle testis gelişimi ve fizyolojisi in vitro eğitimi için yararlıdır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testis organoidleri in vitro testis gelişimi, spermatogenez ve endokrinolojiyi incelemek için bir araç sağlar. Testis organoidleri oluşturmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin çoğu de novo doku montajını teşvik etmek için hücre dışı matriks (ECM) güveniyor, ancak, biyomimetik morfolojisi ve dokuların fonksiyonu açısından yöntemler arasında farklılıklar vardır. Ayrıca, yayınlanan yöntemlerin birkaç doğrudan karşılaştırmalar vardır. Burada organoid üretim protokollerinde sağlanan sonuçlarla ilgili farklılıklar incelenerek doğrudan bir karşılaştırma yapılır. Dört arketipik nesil yöntemi: (1) 2D ECM'siz, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM'siz ve (4) 3D ECM kültürü tanımlanmıştır. Testis organoid neslini değerlendirmek için üç ana kriter kullanıldı. Bunlar hücresel öz-montaj, büyük hücre tiplerinin dahil edilmesi (Sertoli, Leydig, mikrop ve peritubüler hücreler) ve uygun şekilde bölümlere ayrılmış doku mimarisidir. Test edilen dört ortamdan 2D ECM ve 3D ECM'siz kültürler, tübüler ve interstisyel hücre tiplerinin de novo kompartmanlaşması, tübüle benzeri yapıların geliştirilmesi ve uzun süreli endokrin fonksiyon dahil olmak üzere iç morfolojilere sahip organoidler üretti. İncelenen tüm yöntemlerde sıralanmamış, primer murine testis hücre süspansiyonları kullanılmıştır ve yaygın olarak erişilebilir kültür kaynakları kullanılmıştır. Bu testis organoid oluşturma teknikleri, testis organogenezi ve in vitro fizyolojisi araştırma girişimleri için son derece erişilebilir ve tekrarlanabilir bir araç seti sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testis organoidleri testis gelişimi, spermatogenez ve in vitro1,2,,3,,4fizyolojisi üzerinde çalışmak için öncü bir tekniktir. Organoid nesil için çeşitli yöntemler araştırılmıştır; bunlar, hem iki boyutlu (2B) hem de üç boyutlu (3D) oryantasyonlarda çeşitli hücre dışı matris (ECM) ve ECM içermeyen kültür sistemlerini içerir. Farklı nesil yöntemleri farklı hücresel montaj stratejileri teşvik edebilir; bu da yayınlanmış organoid modeller arasında yüksek düzeyde morfolojik ve fonksiyonel değişkenlik ile sonuçlanır. Bu makalenin amacı in vitro t....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm fare deneyleri Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve tüm prosedürler IACUC onaylı protokoller altında gerçekleştirildi.

1. Enzimatik doku-dissosiyasyon çözeltilerinin hazırlanması

  1. Her ikisi de bazal kültür orta çözeltisi (BM) kullanılarak yapılan iki farklı enzimatik çözüm (Çözüm 1 ve Çözüm 2) kullanın.
  2. BM hazırlamak için serum ve penisilin-streptomisini sırasıyla %10 ve %1'lik son konsantrasyonlara en az gerekli ortama ekleyin (bkz. belirli reaktifler için Malzemeler Tablosu). Daha sonra BM'yi 0,22 μm'lik bir filtreden filtreleyin. Hücre....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoid nesil, testis hücrelerinin kültürün 72 saat içinde kendi kendine biraraya gelmemesi durumunda başarısız olarak kabul edilirken, burada sunulan tüm yöntemler juvenil (5 dpp) murine hücreleri kullanılırken 24 saat içinde bir araya getirilmiştir. Biyolojik yapı oluşumunun başarısızlığı, genişletilmiş kültürden (72 saat) sonra bile serbestçe askıda olan hücrelerin devamı olarak sunulmuştur (Şekil 1'de0 saat sütun). Doku kendi kendine montaj yokluğunda, herhangi bir görünür hücre kümeler.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu organoid nesil protokolünün tamamlanması ile, kullanıcı testis yapıları ve organoidler ecm veya ECM içermeyen ortamlarda montajı için onlara mevcut dört farklı kültür teknikleri olacaktır. Daha da önemlisi, dört yöntem de araştırmacının zaman atlamalı görüntüleme veya video kaydı yoluyla organoid kendi kendini birleştirmeyi zaman içinde non-invaziv olarak gözlemlemesine ve kültür sırasında dokuları rahatsız etmeden salgılanan hormonların ve sitokinlerin analizi için koşullandırılmış ortam toplamasına olanak sağlar. Tü.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsangelişimi Enstitüsü (NICHD) F31 HD089693, Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü / Ulusal Merkezi İlerletme Çeviri Bilimleri (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 ve 4UH3ES029073-03 ve Thomas J. Watkin's Professor Memorialship tarafından finanse edilmiştir.

Yazarlar iletim elektron mikroskobu ile yardım için Eric W. Roth teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Yumuşak ve Hibrid Nanoteknoloji Deneysel (SHyNE) Kaynak (NSF ECCS-1542205) destek aldı Northwestern Üniversitesi'nin NUANCE Merkezi, BioCryo tesisi kullanımı yaptı; Malzeme Araştırma Merkezi'ndeki MRSEC programı (NSF DMR-1....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 um Medya Steril FiltrelerMillipore Sigmascgpu05reSteril filtreleme ortamı
3 ve beta için; HSD birincil antikoruCosmo Bio CoK0607Leydig hücre belirteci, 1:500 seyreltme
AlexaFluor 568 α-MouseThermo Fisher ScientificA-21202Floresan etiketli ikincil antikor
AlexaFluor 568 α-RabbitThermo Fisher ScientificA10042Floresan etiketli ikincil antikor
Alfa Minimum Esansiyel OrtaThermo Fisher Scientific11-095-080Kültür ortamının tabanı
Kollajenaz IWorthington BioLS004197Ayrışma çözeltisi için 1
Corning Matrigel Membran Matrisi, LDEV içermeyenCorning3542342D ve 3D ECM kültür jellerinin dökümü için kullanılan hücre dışı matris
Kontes Hücre sayacıThermo Fisher ScientificC10227Otomatik hücre sayacı (hemasitometre makinesi)
Kontes Hücre Sayma Odası SlaytlarıThermo Fisher ScientificC10228Kontes otomatik sayıcı
DDX4 primer antikoruAbcam138540Spermatogonia marker, 1:500 seyreltme
Deoksiribonükleaz I (2,280 u/mgDW)Worthington BioLS002140Ayrışma çözeltisi için 1
DPBS 1X, + CaCl + MgClThermo Fisher Scientific14040182Hyaluronidaz
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu'nun sulandırılması için + Ca / + MgThermo Fisher Scientific14040117PBS
Embriyo Sınıfı H2OMIllipore SigmaW1503Kollajenaz I ve Dnase I'in sulandırılması için
Fetal Sığır SerumuThermo Fisher Scientific16000044Enzim dağıtma solüsyonlarını söndürmek için
Folikül uyarıcı hormonAbcamab51888Uzun süreli organoid kültür için
İnsan koryonik gonadotropinMillipore SigmaC1063uzun süreli organoid kültür
HyaluronidazMillipore SigmaH4272Ayrışma çözeltisi için 2
İnhibin B Enzime bağlı İmmünosorbent TestiAnsh LabsAL-107İnhibin B ELISA Kiti
KnockOut Serum DeğiştirmeThermo Fisher Scientific10828-028Bazal medya MicroTissue
3D Petri Kabı mikro kalıp sferoidleri için serum kaynağı (24-35, 5x7 dizi)Millipore SigmaZ7640513D ECM İçermeyen organoid üretimi için
Nunc, Lab Tek II Hazneli Kızak Sistemi, 4 kuyuluThermo Fisher Scientific12-565-72D ECM içermeyen ve 2D, 3D ECM kültürü için
Penisilin / StreptomisinThermo Fisher Scientific15-140-122Medya için antibiyotik
Richard-Allan Scientific; Histogel, Numune işleme jeliThermo Fisher ScientificHG-4000-012Parafin gömmeye yardımcı olmak için
SOX9 birincil antikoruMillipore SigmaAB5535Sertoli Marker, 1:500 seyreltme
Tedklad Global Mouse Chow (Damızlık)Teklad Global2920Fitoöstrojen içermeyen fare maması
Tedklad Global Mouse Chow (Bakım)Teklad Global2916Fitoöstrojen içermeyen fare maması
Testosteron Enzime bağlı İmmünosorbent TestiCalbiotechTE373STestosteron ELISA Kiti
Tripan Mavisi Çözeltisi,% 0.4Thermo Fisher Scientific15250061Hücre sayımı
ve alfa; SMA birincil antikoruiçin Millipore SigmaA2547Peritübüler işaretleyici, 1:500 seyreltme
ve beta; Katenin primer antikoruBD Biosciences610154Sertoli Sitoplazma belirteci, 1:100 seyreltme
Sığır testislerinden için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alves-Lopes, J. P., Stukenborg, J. B. Testicular organoids: a new model to study the testicular microenvironment in vitro. Human Reproduction Update. 24 (2), 176-191 (2018).
  2. Komeya, M., Sato, T., Ogawa, T. In vitro....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Testicular OrganoidsECM Culture2D ECM free3D ECM freeCellular Self assemblySertoli CellsLeydig CellsGerm CellsPeritubular CellsTissue Architecture

Related Articles