Method Article

Fonksiyonel ve Polarize Safra Epitel Kistlerinin Oluşumu ve Kantitatif Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/61404

⸱

May 16th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Physiopathogénèse et traitement des maladies du foie, Université Paris-Saclay, Inserm U1193, 2ESPCI Paris, Université PSL

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Üç boyutlu (3D) hücresel sistemler organogenezin araştırılması için uygun modellerdir. Safra kist üretimi ve karakterizasyonu için hidrojel bazlı bir yöntem önerilmektedir. Bu protokol, kist oluşumu verimliliğini, boyutlarını değerlendirmek ve işlevselliklerini test etmek için basit ve güvenilir bir yöntemle 3B karakterizasyonunun engellerini ortadan kaldırmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolanjiyositler, karaciğerdeki safra kanallarını oluşturan epitel hücreleri, safra oluşumunu ve modifikasyonu denetler. Son yirmi yılda, karaciğer hastalıkları bağlamında, kolanjiyositlere dayalı 3 boyutlu (3D) modeller, organogenez, hastalık modellemesi ve ilaç tarama çalışmaları için doku topolojisini taklit etmek için kistler, küreseloidler veya tüp benzeri yapılar gibi ortaya çıkmıştır. Bu yapılar esas olarak bir hidrojel kolanjiyositkitler katıştırma ile elde edilmiştir. Temel amaç epitelyal polarite, fonksiyonel ve morfolojik özellikleri ele alarak kendi kendini örgütleme çalışması oldu. Ancak, çok az çalışma kist oluşumu verimliliği üzerinde duruluyor. Bu durumda, verimlilik genellikle tek bir düzlemin görüntülerinden ölçülür. Hidrojel polimerizasyon heterojenitelerinden ve yan etkilerinden kaynaklanan kist dağılımının potansiyel heterojenliğini temsil etmeden fonksiyonel tahliller ve yapısal analizler yapılmaktadır. Bu nedenle, nicel çözümleme yapıldığında, bir makaleden diğerine karşılaştırma için kullanılamaz. Ayrıca, bu metodoloji farklı matrisler ve hücre türlerinin 3D büyüme potansiyelinin karşılaştırmalarına izin vermez. Ayrıca, immünboyama kistler için deneysel sorun giderme söz yoktur. Bu makalede, ilk hücre dağılımının kist oluşumunun heterojen dikey dağılımı ile ilişkili olduğunu göstermek için güvenilir ve evrensel bir yöntem sayılmiyoruz. Hidrojel gömülü kolanjiyosit hücreleri 10 gün boyunca hidrojel derinliği boyunca Z-yığınları analizi ile takip edilir. Bu yöntemle kist oluşumunda verimlilik ve büyüme sağlam bir kinetik elde edilir. Ayrıca kist polaritesini ve salgı fonksiyonunu değerlendirmek için yöntemler saklıyız. Son olarak, görüntüleme için kist çöküşünü sınırlamak için immünboyama protokollerini optimize etmek için ek ipuçları sağlanmıştır. Bu yaklaşım diğer 3D hücre kültürü çalışmalarına uygulanabilir, böylece bir sistemi diğer sistemle karşılaştırma olanakları açılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son otuz yılda, in vitro araştırma alanı 3D kültür sistemlerine doğru ilerlemiştir. Bir iskele/matrisin varlığında veya yokluğunda, bir damla, ajitasyonda, mikroakışkan cihazlarda veya yüzen 1'de, 3Boyutlu olarak hücreleri küresel olarak veyaagrega olarak bir dizi şekilde kültüre alma için bir dizi protokol ortaya çıkmıştır. 3D kültür yöntemlerinin kullanımı, özellikle kistler veya acini adı verilen 3Boyutlu yapılarda kendi kendini organize ettiği gösterilen epitel hücreleri başta olmak üzere 2 boyutlu (2D) kültürlere göre avantajlarını kanıtlamıştır. Bu durumda, hücreler bir lümen çevreleyen bir monolayer oluşturur, hücrelerin geliştirilmiş fizyolojik özel fonksiyonları ile tam epitel fenotip eldenerede 2.

Doğal matrislerde bu epitel organoidlerin oluşturulması için yöntemlerin geliştirilmesine çok sayıda çalışma katkıda bulunmuştur. Bu vivo hücre-hücre ve hücre-mikroçevre etkileşimleri recapitulate izin verdi, kurulması ve epitel fenotip istikrar elde etmekiçin 3,4,5,6,7. Son zamanlarda, ve özellikle nakledilebilir organoidler geliştirmek ve epitel programı düzenlemek için mikroortamın gereksinimini deşifre amacı ile, sentetik hidrojeller epitel acini oluşumunu artırmak için geliştirilmiştir8,9,10. Ne yazık ki, bu çalışmalar nitel veri raporu, ya da 2D düzlemde olmayan kistler üzerinde kistlerin oranı gibi iç referanslar kullanarak mevcut hesaplama yöntemleri8,9,10. Bu, epitel organoidlerinin verimlilik, stabilite veya morfolojik ve fizyolojik karakterizasyonu açısından farklı çalışmalar arasında herhangi bir karşılaştırma yıkmaktadır.

Mikroakışkan cihazlar kullanarak boncuklarda epitel hücrelerinin mikrokapsülasyonu daha gerçekçi nicel ve karşılaştırmalı sonuçlar almıştır. Bu teknoloji kullanılarak, çeşitli hücre tiplerinden organoidler oluşmuş ve farklı 3D hücresel yapılar arasında morfolojiye dayalı farklılaşmış11,12. Ancak, bu teknoloji ile çalışmak kolay değildir ve mikroakışkan cihazlar üretmek için temiz oda kullanımını gerektirir. Bu teknoloji hidrojeller birkaç tür için kurulmuştur ama teknik adaptasyon diğer hidrojeller için uygulanacak gerektirir, onun çok yönlülük kısıtlayan. Bu nedenle, epitel organoidler geliştirmek için amaçlanan çoğu çalışma bir hidrojel toplu epitel hücrelerinin katıştırma güveniyor. Bu yöntemlerde, tüm 3D kültür içinde jel strüktürasyonu ve hücre dağılımı yüksek heterojenlik genellikle ihmal edilir. Bu nedenle, analizlerin çoğu tek 2B görüntülerle ilgilidir, bu da yalnızca kabaca tüm 3B hacimdeki çeşitli hücresel nesnelerin dağılımını temsil eder.

Kolanjiokarsinom, safra atrezisi, primer sklerozan kolanjit gibi safra kanallarını etkileyen hastalıklar mortalite ve morbiditenin başlıca nedenidir. Karaciğer nakli dışında bu durumlar için etkili bir tedavi yoktur13. Safra yolu oluşumunu, hastalık nedenlerini ve ilerlemesini araştırma çabaları yeni tedavilerin geliştirilmesine olanak sağlayacaktır14.

Normal veya hasta kaynaklı, diferansiye veya ata türevi kolanjiyosit hücre hatları kullanan kist, küresel oidler veya tüp benzeri yapıların biliyer organotipik modelleri geliştirilmiştir15,16,17,18,19,20. Çeşitli çalışmalar da kolanjiyofit polaritere, kolanjisit belirteçlerinin ekspresyonu, silya varlığı, kolanjiyosit salgıve reabsorptif yetenek, ve lümen oluşumu ve obstrüksiyonu; bunların hepsi kolanjiyosit fenotip, morfoloji ve fonksiyon15,17,19önemli özelliklerini temsil eder. Diğerleri uzun süre hasta kaynaklı safra organoidleri bakım bildirdin20. Son zamanlarda, biz biliyer kistler organogenez biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçları rolünüaraştırdı21. Daha da önemlisi, biliyer atrezisi patogenezi safra spheroidleri ve tüpler7,22çalışıldı. Ayrıca, kolanjiyosit senescence, pro-inflamatuar sitokinlerin salgılanması gibi birincil sklerozan kolanjitin temel özellikleri, yanı sıra makrofaj işe başarıyla safra spheroids kullanılarak çalışılmıştır15,20. Ancak, bu soruların ele alınabileceği kolanjiyosit fenotip, fizyoloji ve mikroçevreyi fizyolojik olarak modüle eden in vitro 3D kantitatif modellere hala ihtiyaç duyulmaktadır. Ayrıca, sadece birkaç yayın kist oluşumu verimliliği21,23 bildirdin. Bu, özellikle organogenez, hastalık nedeni ve kolanjiyosit fonksiyonu ve polarizasyon ile ilaç yanıtlarının korelasyonunu araştırırken, saptanması gereken önemli bir noktadır. Buna ek olarak, protokolden protokole kadar kullanılan iskele/matris farklılıkları ile sistemler arasında karşılaştırmak zordur. Bu sorunları çözmek için lümen oluşumunu, kolanjisit polarizasyonunu ve kolanjiyit salgı işlevini taklit eden biliyer kistler oluşturmak için nicel, güvenilir ve evrensel bir yöntem öneriyoruz. Daha da önemlisi, zaman içinde değerlendirilirken 3D jel boyunca Z-ekseni boyunca yapılan sistematik bir analiz, kist oluşumu verimliliği, boyut, canlılık, polarizasyon ve işlevsellik sayılmaktadır. Ayrıca, doğal bir hidrojel ve normal sıçan kolanjiyositler (NRC) s, protokol için bir örnek olarak kullanılan, ancak diğer doğal veya sentetik hidrojeller, yanı sıra epitel hücreleri 3D kistik yapıların oluşumu için kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kistlerin üretimi

NOT: Jelleşme hücrelerin katıştırılmasına izin veriyorsa, bu protokol her türlü hidrojel ile yapılabilir.

  1. Hidrojel kaplama
    NOT: Hazne saklıdoğru hidrojel kaplama kuyunun alt kısmında 2D hücre tabakaları oluşumunu önlemek için kritik bir adımdır, sonraki kist görüntüleme müdahale ve kist oluşumu verimliliği hesaplama sını bozabilir.
    1. Jel çözeltisinin homojenliğini sağlamak için hidrojeli bir gecede 4 °C'de (O/N) eritin.
    2. -20 °C'de buz veya O/N üzerinde precool pipet uçları ve -20 °C O/N'de 8 kuyulu bir hazne kaydırağı.
    3. Buz dolu bir buz kovası üzerine hidrojel ve 8-iyi oda slayt yerleştirin.
    4. 15 mL konik bir tüpte, soğuk NRC komple ortamda @ hidrojel (V/V) içeren bir çözelti hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu)ve tüpü buzüzerine yerleştirin.
    5. Soğuk pipet uçları kullanarak bir hazne slaytKaplamak için, her kuyunun ortasına 50 μL hidrojel çözeltisi ekleyin ve hazne ucunu buz üzerinde tutarken bir pipet ucu kullanarak tüm yüzeye yayıldı(Şekil 1A).
      NOT: Hidrojel çözeltisini mümkün olduğunca eşit olarak kabarcıklardan kaçınarak yayın.
    6. Hidrojeli polimerize etmek için, 37 °C,% 5 CO2en az 15 dakika için oda slayt kuluçka .
  2. Hücre hazırlama
    1. Isınma NRC komple orta, fosfat tamponlu salin (PBS), ve tripsin-etilendiamin tetraasetik asit (tripsin-EDTA) önceden ısıtılmış bir su banyosunda 37 °C.
    2. Hidrojel polimerize iken, NRCs bir T-25 cm2 kollajen kaplı şişe21%birleşimi için yetiştirilen emin olun. Önceden ısıtılmış 1x PBS ile hücreleri bir kez yıkayın.
    3. NRC'leri 5 mL önceden ısıtılmış 1x PBS (T-25 cm2 şişe için) 37 °C'de 20 dk, %5 CO2ile inkübedin.
      NOT: Tripsin-EDTA ile kuluçka süresini kısaltan bu adım, hücrelerin kendi kendini organize eden özelliklerini korumada etkilidir.
    4. PBS atın, trypsin-EDTA 1 mL ekleyin ve 37 °C, % 5 CO25-10 dakika kuluçka.
    5. Önceden ısıtılmış tam NRC ortamının 4 mL'si ile nötralize edin. Hücre süspansiyonuna 15 mL konik bir tüp toplayın ve aktarın ve 4 dk boyunca 150 x g'da döndürün.
    6. Orta atın ve önceden ısıtılmış orta 5 mL hücre pelet resuspend.
    7. 40 μm hücreli süzgeç kullanarak hücre çözeltisini 50 mL konik bir tüpe filtreleyin ve hücreleri sayın.
      NOT: Hücreleri bir süzgeçten geçirmek, kantitatif sonuçların tekrarlanabilir olması, yani gömülü hücre agregalarının neredeyse benzer boyutunu elde etmesi için kritik bir adımdır.
  3. Hidrojel çözeltisindeki hücre süspansiyonunun gömülmesi












    1. figure-protocol-1

    2. figure-protocol-2








Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kistlerin oluşumu ve karakterizasyonu
3D hücre kültür sistemleri organogenez ve hastalık modelleme25çalışma için önemli bir araçtır. Ne yazık ki, bu yöntemlerin çoğu nitel veya çeşitli çalışmalar arasında kist oluşumu verimliliği açısından herhangi bir karşılaştırma önleme, değişken ve genellikle belirtilmemiş hacimlerde, kistler ve non-kistler karşı kistlerin sayısı karşılaştırarak tek bir düzlemde yapılan iç nicelleştirme kullanın7,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organogenez ve 3D hücresel yapıların bakım çalışması için, çeşitli dokular modellenmiştir, farklı hücresel kökenleri kullanarak ama aynı zamanda sentetik hidrojeller de dahil olmak üzere ekstra-hücresel matrisfarklı türleri8,9,10,21. Ancak, organoidoluşumu veya işlevselliği açısından yöntemler arasında karşılaştırmalar sağlar 3D kantitatif analiz eksikliği nedeniyle7

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Dr Nicholas LaRusso (Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, Amerika Birleşik Devletleri), kim nazilikle NRC hücre hattı sağlanan teşekkür ederiz.

Bu çalışma hem iLite RHU programı (grant ANR-16-RHUS-0005) hem de DHU Hepatinov'un mali desteğini almıştır.

Isabelle Garcin ve Réseau d'Imagerie Cellulaire Paris Saclay'e görüntüleme konusundaki desteklerinden dolayı teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 ve mikro; l- Pipet Eppendorf Research PlusThermo Fisher Scientific3120000020
100 & l - Pipet Eppendorf Research PlusThermo Fisher Scientific3120000046
1000 & l - Pipet Eppendorf Research PlusThermo Fisher Scientific3120000062
1X PBSThermo Fisher Scientific14190-094
200 & mikro; l - Pipet Eppendorf Research PlusThermo Fisher Scientific3120000054
3,3&asal;,5-Triiyodo-L-tironin sodyum tuzuSigma-AldrichT5516NRC tam orta nihai konsantrasyon = 3.4 &mikro; g/mL
Asetik asitVWR20104-2980.02N son
Aerosol bariyer pipet uçları 10 ve mikro; l (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific2707439
Aerosol bariyer pipet uçları 1000 ve mikro; l (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific2707404
Aerosol bariyer pipet uçları 200 & mikro; l (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific2707430
Antibiyotik Antimikotik Çözelti (100X)Sigma-AldrichA5955NRC tam orta nihai konsantrasyon = 1:100 seyreltme
Sığır hipofiz özüThermo Fisher Scientific13028-014NRC tam orta nihai konsantrasyon = 30 &mikro; g / mL
Sığır serum albüminiSigma-AldrichA21531:1000 seyreltme
Kimyasal Olarak Tanımlanmış Lipid Konsantresi (100X)Thermo Fisher Scientific11905-031NRC tam orta nihai konsantrasyon = 1:100 seyreltme
Kollajen yüksek konsantrasyon, sıçan kuyruğuThermo Fisher Scientific35424950 &mikro; g / mL nihai konsantrasyon
DeksametazonSigma-AldrichD4902NRC tam orta nihai konsantrasyon = 0.393 &mikro; g/mL
DMEM F12Thermo Fisher Scientific21331-020NRC tam orta nihai konsantrasyon = 1X
E-kaderin Tavşan anti-İnsan, Sıçan, PoliklonalThermo Fisher ScientificPA5-321781:400 seyreltme
Eclipse TE300 ters mikroskopNikongörüntüleme
EtanolaminSigma-AldrichE9508NRC tam orta final konsantrasyon = 0.32 mM
Fetal buzağı serumuThermo Fisher Scientific10270-106NRC tam orta nihai konsantrasyon = 5:100 seyreltme
DAPI ile Fluoroshield (Montaj ortamı)Sigma-AldrichF6057
Formaldehit %16 (A/V)Thermo Fisher Scientific28906%4 (A/H)
Keçi serumuThermo Fisher Scientific16210-0641:10 seyreltme
Hamamatsu kamera (Dijital kamera C11440 ORCA - flaş 4.OLT)Hamamatsugörüntüleme
Hoechst 33258Sigma-AldrichB11555 & mikro; g / mL nihai konsantrasyon
IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Keçi anti-Tavşan, Alexa Fluor Plus 647Thermo Fisher ScientificA327331:500 seyreltme
ImageJ sürüm 2.0.0-rc-69/1.52nAçık kaynaklı görüntü işleme yazılımı
İnsülin-Transferrin-Selenyum (100X)Thermo Fisher Scientific51300-044NRC tam orta nihai konsantrasyon = 1:100 seyreltme
L-Glutamin (100X)Thermo Fisher Scientific25030-024NRC tam orta nihai konsantrasyon = 1:100 seyreltme
Matrigel GFR (stok konsantrasyonu 9.7 mg/mL)Thermo Fisher Scientific3562314:10 seyreltme
NIS Elements yazılım sürümü 4.50.00Nikongörüntü alma ve görüntüleme
Esansiyel Olmayan Amino Asitler-Çözeltisi (100X)Thermo Fisher Scientific11140-035NRC tam orta nihai konsantrasyon = 1:100 seyreltme
Amaç Planı Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (∞/1.2 WD 15.2)Nikon
Prolong Altın Antifade ReaktifiThermo Fisher ScientificP36931
Probidyum İyodür (PI)Sigma-AldrichP417020 & mikro; g / mL nihai konsantrasyon
Rhodamine PhalloidinThermo Fisher ScientificR41516.2 nM nihai konsantrasyon
Sir-Actin / Verapamil kitiSpirochromeSC00110 & mikro; M nihai konsantrasyon
Soya fasulyesi tripsin inhibitörüThermo Fisher Scientific17075-029NRC tam orta nihai konsantrasyon = 50 &mikro; g/mL
Steril hücre süzgeci 40 & mikro; m (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific22363547
Steril pipetler 10 mL (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific1367811E
Steril pipetler 5 mL (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific1367811D
Steril tüpler 1,5 mL (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific11926955
Steril tüpler 15 mL (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific7200886
Steril tüpler 50 mL (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific553913
SucroseSigma-AldrichS03895:100 seyreltme
Doku kültürü ile tedavi edilmiş şişe 25cm2 (Falcon)ThermoFisher Scientific353108
Triton X-100Sigma-AldrichT87875:1000 seyreltme
Tripsin-EDTA (% 0.05) fenol kırmızısıThermo Fisher Scientific25300-0541X
Tween-20Sigma-AldrichP13795:10000 seyreltme
Vitamin (100X)Thermo Fisher Scientific11120-037NRC tam orta nihai konsantrasyon = 1:100 seyreltme
&-Slayt 8 Peki ibiTreat, IbidiClinisciences80826

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  2. Martín-Belmonte, F., et al. Cell-polarity dynamics controls the mechanism of lumen formation in epithelial morphogenesis. Current Biology. 18, 507-513 (2008).
  3. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  4. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging Cells in Three-Dimensional Collagen Matrix. Current Procotols in Cell Biology. , Chapter 10 (Unit 10) (2010).
  5. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bisell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9064-9068 (1992).
  6. Kim, S. P., Lee, D. H., Park, J. K. Development of hepatocyte spheroids immobilization technique using alternative encapsulation method. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 3, 96-102 (1998).
  7. Lorent, K., et al. Identification of a plant isoflavonoid that causes biliary atresia. Science Translational Medicine. 7 (286), 67(2015).
  8. Nowak, M., Freudenberga, U., Tsurkana, M. V., Wernera, C., Levental, K. R. Modular GAG-matrices to promote mammary epithelial morphogenesis in vitro. Biomaterials. 112, 20-30 (2017).
  9. Miroshnikova, Y. A., et al. Engineering Strategies to Recapitulate Epithelial Morphogenesis Within Synthetic Three-Dimensional Extracellular Matrix With Tunable Mechanical Properties. Physical Biology. 8 (2), 026013(2011).
  10. Ozdemir, T., et al. Tuning Hydrogel Properties to Promote the Assembly of Salivary Gland Spheroids in 3D. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (12), 2217-2230 (2016).
  11. Dolega, M. E., Abeille, F., Picollet-D'hahan, N., Gidrol, X. Controlled 3D culture in Matrigel microbeads to analyze clonal acinar development. Biomaterials. 52, 347-357 (2015).
  12. Laperrousaz, B., et al. Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens. Nucleic Acids Research. 46 (12), 70(2018).
  13. Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. The Cholangiopathies. Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).
  14. Tam, P. K., Yiua, R. S., Lendahl, U., Andersson, E. R. Cholangiopathies - Towards a molecular understanding. EBioMedicine. 35, 381-393 (2018).
  15. Loarca, L., et al. Development and characterization of cholangioids from normal and diseased human cholangiocytes as an in vitro model to study primary sclerosing cholangitis. Laboratory Investigation. 97, 1385-1396 (2017).
  16. De Assuncao, T. M., Jalan-Sakrikar, N., Huebert, R. C. Regenerative medicine and the biliary tree. Seminars in Liver Disease. 37, 17-27 (2017).
  17. Dianat, N. H., et al. Generation of functional cholangiocyte-like cells from human pluripotent stem cells and HepaRG cells. Hepatology. 60, 700-714 (2014).
  18. Masyuk, A. I., et al. Cholangiocyte autophagy contributes to hepatic cystogenesis in polycystic liver disease and represents a potential therapeutic target. Hepatology. 67 (3), 1088-1108 (2018).
  19. Sampaziotis, F., Cardoso, M., Madrigal, P., Bertero, A., Saeb-Parsy, K., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nature Biotechnology. 33 (8), 845-852 (2015).
  20. Soroka, J. C., et al. Bile-Derived Organoids From Patients With Primary Sclerosing Cholangitis Recapitulate Their Inflammatory Immune Profile. Hepatology. 70 (3), 871-882 (2019).
  21. Funfak, F., et al. Biophysical Control of Bile Duct Epithelial Morphogenesis in Natural and Synthetic Scaffolds. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7 (417), 417(2019).
  22. Du, Y., et al. Bile Duct-on-a-Chip With Organ-Level Functions. Hepatology. 0 (0), (2019).
  23. Shiota, J. M., Mohamad Zaki, N. H., Merchant, J. L., Samuelson, L. C., Razumilava, N. Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts. Journal of Visualized Experiments. (146), e59544(2019).
  24. Bircsak, K. M., Richardson, J. R., Aleksunes, L. M. Inhibition of Human MDR1 and BCRP Transporter ATPase Activity by Organochlorine and Pyrethroid Insecticides. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (2), 157-164 (2013).
  25. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., Blitterswijk, C., Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  26. Kanade, S., Nataraj, G., Ubale, M., Mehta, P. Fluorescein Diacetate Vital Staining for Detecting Viability of Acid-Fast Bacilli in Patients on Antituberculosis Treatment. International Journal of Mycobacteriology. 5 (3), 294-298 (2016).
  27. Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death. Journal of Visualized Experiments. (50), e2597(2011).
  28. Tabibian, J. H., Masyuk, A., Masyuk, T. V., O'Hara, S. P., LaRusso, N. F. Physiology of Cholangiocytes. Comprehensive Physiology. 3 (1), (2013).
  29. Spirlì, C., et al. Functional polarity of Na+/H+ and Cl-/HCO3- exchangers in a rat cholangiocyte cell line. American Journal Physiology. 275, 1236-1245 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Biliary Epithelial CystsCholangiocyte CultureHydrogel EmbeddingZ stack AnalysisCyst Formation EfficiencyCyst Polarity AssessmentSecretory Function EvaluationImmunostaining OptimizationLive Dead StainingFluorescein Secretion

Related Articles