Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yetişkin İnsan Beyin Dokusundan İnsan Mikroglia elde

7.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61438

⸱

30 Ağustos 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioscience and Bioengineering, Indian Institute of Technology Jodhpur, 2Department of Neurosurgery, All India Institute of Medical Sciences Jodhpur

Bu makalede

Özet

Bu protokol, canlı, yetişkin, insan beyin dokusundan birincil mikroglia izole etkili, uygun maliyetli ve sağlam bir yöntemdir. İzole birincil insan mikroglia homeostaz ve hastalık hücresel süreçleri incelemek için bir araç olarak hizmet verebilir.

Özet

Mikroglia merkezi sinir sisteminin yerleşik doğuştan gelen bağışıklık hücreleridir (CNS). Microglia gelişim sırasında kritik bir rol oynar, homeostaz bakımında, ve enfeksiyon veya yaralanma sırasında. Birçok bağımsız araştırma grupları otoimmün hastalıklarda, otoinflamatuar sendromlarda ve kanserlerde mikroglianın oynadığı merkezi rolü vurgulamıştır. Bazı nörolojik hastalıklarda mikroglia aktivasyonu doğrudan patojenik süreçlere katılabilir. Primer mikroglia beyinde bağışıklık yanıtları anlamak için güçlü bir araçtır, hücre-hücre etkileşimleri ve hastalıkta disregulated mikroglia fenotipler. Primer mikroglia in vivo mikroglial özelliklerini ölümsüzleştirilmiş mikroglial hücre hatlarını daha iyi taklit. İnsan yetişkin mikroglia insan fetal ve kemirgen mikroglia ile karşılaştırıldığında farklı özellikleri sergiler. Bu protokol yetişkin insan beyninden birincil mikroglia izolasyon için etkili bir yöntem sağlar. Bu mikroglia çalışma dahil olmak üzere Mikroglia ve CNS diğer yerleşik hücresel popülasyonlar arasındaki hücre hücre etkileşimleri içine kritik anlayışlar sağlayabilir, oligodendrocytes, nöronlar ve astrositler. Ayrıca, farklı insan beyninden mikroglia kişiselleştirilmiş tıp ve terapötik uygulamalar sayısız için benzersiz bağışıklık yanıtları karakterizasyonu için kültürlü olabilir.

Giriş

Merkezi sinir sistemi (CNS) nöronlar ve glial hücrelerden oluşan karmaşık bir ağ inşa edilmiştir1. Glial hücreler arasında, CNS doğuştan gelen bağışıklık hücreleri olarak mikroglia fonksiyonu2,3. Microglia sağlıklı CNS4homeostaz korumak için sorumludur. Mikroglia da nörogelişim önemli bir rol oynamaktadır, sinaps budama tarafından2. Mikroglia dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli nörolojik hastalıkların patofizyolojisi merkezidir; Alzheimer hastalığı5, Parkinson hastalığı6, inme7, multipl skleroz8, travmatik beyin hasarı9, nöropatik ağrı10, omurilik yaralanması11 ve gliomas gibi beyin tümörleri12.

CNS homeostaz ve hastalıklar ile ilgili çalışmalar maliyet etkin ve zaman etkin insan birincil mikroglia izolasyon protokolleri13bir eksikliği nedeniyle kemirgen microglia kullanır. Kemirgen mikroglia Iba-1, PU.1, DAP12 ve M-CSF reseptörü gibi genlerin ekspresyonunda birincil insan mikroglia benzer ve normal yanı sıra hastalıklı beyin13anlamada etkili olmuştur. İlginçtir, TLR4, MHC II, Siglec-11 ve Siglec-3 gibi birçok bağışıklık ilişkili genlerin ekspresyonu insan ve kemirgen microglia13arasında değişir. Çeşitli genlerin ekspresyonu da zamansal ekspresyon ve her iki türde nörodejeneratif hastalıklarda değişir14,15. Bu önemli farklılıklar insan mikroglia homeostaz ve hastalık mikroglia fonksiyonu çalışma için gerekli bir model olun. Birincil insan mikroglia da potansiyel ilaç adaylarının preklinik tarama için etkili bir araç olabilir16. Yukarıda belirtilen nedenler birincil insan mikroglia izolasyonu için maliyet etkin protokoller için artan ihtiyaç altını çizmektedir.

Tümör rezeksiyonları veya diğer cerrahi rezeksiyonlar için oluşturulan cerrahi pencere sonucunda toplanan erişkin insan beyin dokusundan birincil insan mikrogliasının izolasyonu için bir protokol geliştirdik. Buradaki yöntem mevcut yöntemlerden oldukça farklıdır. Doku toplama alanından laboratuvarda izolasyon protokolüne başlamak için yaklaşık 75 dakikalık bir geçiş süresinden sonra mikrogliayı izole etmeyi ve kültürü kültürü eleyebildik. Biz izole mikroglia büyümesini teşvik etmek için L929 fibroblast hücrelerinin supernatant kullandık. Bu yöntem özellikle sadece birincil mikroglia nın kültürü ve gelişimine odaklanır. Ortaya çıkan kültür yaklaşık% 80 microglia olduğunu. Diğer protokoller yoğunluk gradyan santrifüj, akış sitometri ve manyetik boncuklar tarafından mikroglia zenginleştirilmiş bir kültür sağlarken, protokol kültür birincil insan microglia17,18,,19,20hızlı, basit, sağlam ve maliyet etkin bir yoldur. Kadavralardan sabit beyin dokuları yerine cerrahi olarak çıkarılan canlı beyin dokusunu kullanabilme yeteneği mevcut prosedürlerin aksine bu yöntemin ek bir avantajını kanıtlıyor18,21.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm dokular, Indian Institute of Technology Jodhpur ve All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur'un etik komitelerinden etik izin aldıktan sonra edinilmiştir.

1.Doku edinimi ve işlenmesi (Gün 0)

  1. 10 mL buz gibi suni beyin omurilik sıvısı (aCSF) (2 mM CaCl2,2H2O, 10 mM glikoz, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3,2,5 mM NaH2PO4,1 mM MgCl2°6H2O, 202 mM sucrose)içeren 50mL tüpte dokuyu toplayın 20 . Doku farklı bir yere transfer edilmesi gerekiyorsa tüp buz üzerinde tutulur emin olun.
    NOT: Otoklavlı distile suda aCSF hazırlayın. Laminar kaputta 0,22 μm şırınga filtresi ile filtreleyin. Bu 4 °C'de 1 ay saklanabilir.
  2. Toplama tüpünü %70 alkolle dikkatlice silin ve aseptik laminar hava akış odasına aktarın.
  3. ACSF'yi dikkatlice atın ve aseptik durumda dokuyu tarttı. Doku ağırlığı sonraki adımlar için gerekli tripsin-EDTA hacmini hesaplamak için gereklidir.
  4. 37 °C'de 5 dakika taze sıcak aCSF doku tutun. Bu adım hücre ölümü önlemek için önemlidir.
  5. 37 °C'de 1x PBS (fosfat tamponlu salin) ile bir kez aCSF atın ve doku yıkayın. Tüm kanın tekrarlanan PBS yıkıntıları (gerektiği gibi) ile yıkandığından emin olun.
  6. 5 dakika boyunca, 37 °C sıcak PBS doku kuluçka.
  7. PBS'yi dikkatlice atın ve sterilize edilmiş petri kabına doku aktarın. PBS bir pipet ile kaldırılabilir. Bu herhangi bir doku kaybını önleyecektir.
  8. Steril bir neşter kullanarak dokuyu küçük (en az 1 mm3)parçalara ayırın. İnce doğranmış doku, tripsin-EDTA ile daha yüksek verim sağlayarak doku ayrışması için daha yüksek doku yüzey alanı sağlar.
  9. Doğranmış dokuyu %0,25 tripsin-EDTA içeren 10 mL/g doku içeren 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 10 mL serolojik pipet ile boru ile karıştırın. Petri kabına 2 mL tripsin/EDTA ekleyin ve pipet yardımıyla tabağı iyice yıkayın. Bu tripsini şahin tüpüne geri ekle. Bu doğrama sırasında doku ve hücre kaybını en aza indirir.
  10. Tüpü 37 °C'de 250 rpm'de 30 dakika çalkalayın. Bu adım dokudan hücrelerin dissociation artırır.
  11. Kuluçka sonunda, tripsin nötralize etmek için 10 mL nötralize ortamı (%50 DMEM/%50 F12 glutamin, %1 penisilin-streptomisin, %10 FBS) ekleyin. 10 mL serolojik pipet ile karıştırın. Eklenen nötralize ortam miktarı kullanılan trypsin miktarına eşit olmalıdır.
  12. Tüpü 2.000 x g'de 4 °C'de 10 dakika santrifüj edin.
  13. Supernatant atın ve kültür orta 1 mL pelet yeniden askıya (%50 DMEM/50% F12 glutamin ile, 1% penisilin-streptomisin, 20% L929 supernatant, 10% FBS).
    NOT: L929 hücreleri DMEM'de kültürdür (Glutaminli DMEM, %1 penisilin-streptomisin, %10 FBS). HÜCRE KÜLTÜRÜ için ATCC önerilen kültür yöntemi takip edilmelidir. Supernatant en az% 75 confluent olan kültür şişesi toplanmalıdır. Büyüme faktörlerinin bozulmasını önlemek için toplu olarak toplanabilir ve -80 °C'de saklanabilir. Bu stok kültür ortamına ekleyerek yerine şişelerde ayrı ayrı L929 supernatant eklenmesi önerilir.
  14. Bir T-25 şişesi, yapışık hücreler için uygun hücreleri plaka ve ek kültür orta 4 mL ekleyin. Şişeyi %5 CO2ile 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Dikkatlice homojen doku dağıtmak için şişe sallamak. Bu kontaminasyon şansını artırabilir gibi, titreme sırasında, şişenin boynuna medya getirerek kaçının.

2.Hücre kültürü (Gün 2)

  1. Her tüpte eşit hacimli ortam toplayarak, 1,5 mL'lik üç santrifüj tüpünde 0.gün hazırlanan T-25 kültür şişesinden ortam toplayın. Şişeyi 1 x PBS ile bir kez yıkayın. Sol herhangi bir kalıntı doku parçaları kaldırmak için yavaşça şişe çalkalayın. Herhangi bir kalıntı parçaları kültürü olumsuz etkilemez gibi şişe sert sallayarak kaçının. Şişeye 5 mL taze kültür ortamı ekleyin.
  2. Toplanan ortamları 4 °C'de 1.466 x g (4000 rpm) 4 dakika santrifüj edin.
  3. Her tüpten supernatant atın ve tüplerbirine kültür orta 1 mL ekleyin. Pipet ile iyice karıştırın. Seri diğer tüplere hücreleri ile karışık ortam ekleyin. Pipet ile iyice karıştırın ve bir tüp içinde hücreleri havuz.
  4. Hücreleri yapışık hücreler için uygun ayrı bir T-25 şişesine koyun. 4 mL kültür ortamı ekleyin ve şişeyi %5 CO2ile 37 °C'de inkübedin.

3.Hücre kültürü (Gün 4)

  1. Her iki şişeden de ortam atın ve şişeye yeni 5 mL kültür ortamı ekleyin.
  2. Şişeyi 37 °C'de %5 CO2 ile 2 gün kuluçkaya yatırın.

4. Hücre Kültürü (Gün 6)

  1. Hücreler daha fazla deney için hazır olacak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yukarıda bahsedilen protokolü kullanarak(Şekil 1),birincil insan mikrogliasını cerrahi olarak rezeke edilmiş canlı beyin dokularından izole etmeyi başardık. Kültürlü hücreler ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) mikroglia için lektin ile boyandı (yeşil) ve glial fibrillary asidik protein ile (GFAP) astrositler için (kırmızı) (Şekil 2) daha önce açıklandığı gibi22,23

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mikroglia normal beyinde homeostaz sağlamak ve çeşitli nörolojik hastalıkların patofizyolojisi merkezi rol oynamak4. Mikroglia nörogelişim ve sinaps oluşumuiçinmerkezi 2 . Mikroglial çalışmalar, çeşitli nörolojik hastalıkların gelişimi ve ilerlemesini anlamada önemli bir değer kanıtlamıştır4. Kemirgen mikroglia birincil mikroglial çalışmalar için tercih yaygın modeli olsa bile, kemirgen microglia önemli yönleriyle birincil insan mikroglia farklıdır

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

SJ'nin laboratuvarı IITJ'nin kurumsal hibeleri ile kurulmuş olup, Biyoteknoloji Bakanlığı (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) ve Hindistan Elektronik ve Bilgi Teknolojileri Bakanlığı (No.4(16)/2019-ITEA) tarafından finanse edilmektedir. İnsan beyin dokusu bölümleri Kurumsal Etik Komitesi izni sonra All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur elde edildi. Biz Mayank Rathor, Tasarım ve Sanat Derneği IIT Jodhpur B.Tech Öğrenci üyesi, videografi desteği için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Antibiyotik-Antimikotik çözeltiHimediaA002
Kalsiyum klorürSigma223506
Santrifüj (4 ° C)Sigma146532
Santrifüj tüpleriAbdosP10203
CO2< / sub> inkübatörüYeni BrunswikGalaxy 170 S
D-GlikozHimediaGRM077
Glutamin HimediaAL007S
ile DMEM ortamı Fetal sığır serumuHimediaRM9955
Flacon tüp (50 ml)Thermo Fsiher Scientific 50CD1058
Floresan Ricinus communis aglütininin-1VektörFL-1081
Floresan mikroskopLeicaDM2000LED
DAPISigmaF6057
GFAP antikoruGA53670S
İnkübatör çalkalayıcıYeni Brunswik ScientificInnova 42
L929 hücre hattıATCCNCTC klonu 929 [L hücresi, L-929, Suş L'nin türevi] (ATCC  CCL-1)
Laminer hava akışıThermo Fsiher Scientific  1386
Magnezyum klorürHimediaMB040
Monosodyum fosfatMerck567545
Besin Karışımı F-12 Jambon OrtaHimediaAl106S
Petri kabıDuran Grubu237554805
Fosfat tamponlu salinHimediaML023
Potasyum klorürHimediaMB043
Serolojik pipetLabwareLW-SP1010
Sodyum bikarbonatHimediaMB045
SükrozHimediaMB025
Şırınga filtresi (0.2μ, 25 mm çap)AxivaSFPV25R
T-25 doku kültürü şişeleri, yapışık hücre kültürü için uygundur.HimediaTCG4-20X10NO
Tripsin-EDTA (% 0.25)Gibco 25200-056
ile Fluoroshield

Kaynaklar

  1. Allen, N. J., Barres, B. A. Glia - more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
  2. Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).
  3. Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions. Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).
  4. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
  5. Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum. Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).
  6. Tremblay, M. -E., Cookson, M. R., Civiero, L. Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16(2019).
  7. Qin, C., et al. Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke. Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).
  8. Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology. Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).
  9. Loane, D. J., Kumar, A. Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated. Experimental Neurology. 275 (03), Pt 3 316-327 (2016).
  10. Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
  11. Bellver-Landete, V., et al. Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury. Nature Communications. 10 (1), 518(2019).
  12. Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
  13. Smith, A. M., Dragunow, M. The human side of microglia. Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).
  14. Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
  15. Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
  16. Rustenhoven, J., et al. PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44(2018).
  17. Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55 (4), 412-424 (2007).
  18. Mizee, M. R., et al. Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16(2017).
  19. Rustenhoven, J., et al. Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies. Scientific Reports. 6 (1), 19371(2016).
  20. Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
  21. Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
  22. Jha, S., et al. The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18. The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811(2010).
  23. Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
  24. Plant, S. R., et al. Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein. The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).
  25. Arnett, H. A., et al. The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model. The Journal of Immunology. 168 (1), 427(2002).
  26. Arnett, H. A., et al. TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).
  27. Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. Journal of Visualized Experiments. (81), e50966(2013).
  28. Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
  29. Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Beyin Dokusu zolasyonuDoku SindirimiTrypsin EDTAH cre K lt rmm nositokimyaPrimer H cre zolasyonuH cre HasadSantrif gasyon ProtokolMikroglia Karakterizasyonu
Yetişkin İnsan Beyin Dokusundan İnsan Mikroglia elde
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.