DNA hasarının ardından, insan hücreleri genomlarının bütünlüğünü geri yüklemek için gerekli onarım yollarını aktive ederler. Burada, dolaylı immünoffloresan yöntemini DNA onarım proteinlerini tespit etmek, mekansal ve zamansal işe alımlarını analiz etmek ve DNA hasarı nın olduğu yerlerde protein-protein etkileşimini sorgulamaya yardımcı olmak için bir araç olarak tanımlıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
DNA Onarım Proteinlerinin İmmünfluoresan Etkileşiminin Görselleştirilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Memeli hücreleri sürekli kimyasallara maruz kalırlar, radyasyon, ve doğal olarak meydana gelen metabolik yan ürünler, DNA hakaret belirli türleri oluşturmak. Genotoksik ajanlar DNA omurgasına zarar verebilir, kırabilir veya tek tek bazların kimyasal doğasını değiştirebilir. DNA hakaretinin ardından DNA hasar yanıtı (DDR) yolları aktive edilir ve onarımda yer alan proteinler işe alınır. Hasarın türünü algılamada ve uygun onarım yanıtını etkinleştirmede çok sayıda faktör rol oynar. DDR faktörlerinin doğru bir şekilde etkinleştirilmesi ve işe alınmaması, kanser de dahil olmak üzere birçok insan patolojisinde yatan genomik istikrarsızlığa yol açabilir. DDR proteinleri çalışmaları genotoksik ilaç yanıtı ve ilaç direnci hücresel mekanizmaları içine anlayışlar sağlayabilir.
Proteinleri in vivo'dagörselleştirmenin iki ana yolu vardır: doğrudan gözlem, ilgi proteinini floresan proteinle etiketleyerek ve canlı görüntüleme ile takip ederek veya sabit numunelerde dolaylı immünofülans. Floresan etiketli proteinlerin görselleştirilmesi zaman içinde hassas izleme sağlarken, N- veya C-terminus doğrudan etiketleme protein lokalizasyonu veya fonksiyonu ile engelleyebilir. Proteinlerin değiştirilmemiş, endojen versiyonlarında gözlemi tercih edilir. DNA onarım proteinleri DNA hakaret işe olduğunda, onların konsantrasyonu yerel artar ve gruplar oluşturur, ya da "foci", belirli antikorlar kullanılarak dolaylı immünoresans ile görselleştirilmiş olabilir.
Protein foci'nin saptanması doğrudan etkileşimin kesin bir kanıtı olmasa da, hücrelerdeki proteinlerin birlikte lokalizasyonu hasar mahallinde yeniden grupladıklarını ve karmaşık oluşum için gerekli olayların dizisini bilgilendirebileceklerini gösterir. Bir proteinin vahşi tipini veya mutant versiyonlarını ifade eden hücrelerdeki fosi uzamsal örtüşmelerin dikkatli analizi, DNA onarım fonksiyonu için önemli olan fonksiyonel etki alanları hakkında değerli ipuçları sağlayabilir. Son olarak, proteinlerin birlikte lokalizasyonu, hücrelerde ko-immünopresipitasyon veya saflaştırılmış proteinler kullanılarak doğrudan aşağı çekilme ile doğrulanabilecek olası doğrudan etkileşimleri gösterir.
Giriş
İnsan hücreleri sürekli çeşitli kökenlerden DNA zararlı ajanlar çeşitli maruz kalırlar. Ekzojen kaynaklar çoğunlukla radyasyona maruz ilerler, kimyasallar (kemoterapötik ajanlar ve bazı antibiyotikler dahil) ve virüsler, ana endojen kaynaklar DNA replikasyonu ve oksidatif stres hataları içerir iken. Genotoksik maruziyetin doğrudan etkileri, strese ve maruz kalma dozuna bağlı olarak modifiye edilmiş bir bazdan potansiyel olarak öldürücü DNA çift iplikçik kırılamı (DSB) arasında değişebilir. Sonuçta, onarılmamış veya yanlış onarılmış DNA hasarı mutasyonların birikimine yol açabilir, genomik yeniden düzenlemeler, genom istikrarsızlık ve sonunda karsinogenez yol 1 .
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. HeLa hücre kültürü
- 16-18 saat boyunca 50 °C'de 1 M HCl'lik yuvarlak cam kapaklar ön muamele. DDH2O ile durulayın ve 0 EtOH'ta saklayın.
- Hücre kültürü ortamını hazırlayın: DMEM ortamına (v/v) FBS ekleyin.
- 37 °C'de 18 mm yuvarlak cam kapak kaymaları ve nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde %5 CO2 ile steril 12 kuyulu tabakta 4,0 x 104
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
2. günde veya 24 saat sonrası kapaklarda tohumlama hücreleri, hücreler bir bölünme geçirmiştir ve% 80 confluent vardır. DNA onarım proteinlerinde belirli düşme ler veya mutasyonlar iki katına çıkarma süresini artırabilir veya hücreleri genotoksik tedaviye duyarlı hale getirebilir ve tohumlama yoğunluğunun yanı sıra tedavi dozları da buna göre ayarlanmalıdır. En iyi çalışma koşullarını belirlemek için, DNA hasar yanıtının zamanlaması zamanla γH2AX'ın Batı'da blotlama ile belirlenebilir ve ışınlanmaya karşı hassasiyet kolo.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
DNA hasar onarımının mikroskobik ile zamanlaması ve etkinliğinin analizi, DNA onarım makinelerinin normal hücrelerde ve kanser gibi insan patolojilerinde nasıl çalıştığını anlamak için gerekli olmuştur.
Onların fosforile sürümünde aktive proteinlerin tespitine olanak sağlayan spesifik antikorların geliştirilmesi (γH2AX, pRPA, pRAD50 ve diğerleri gibi10,23,39,43) olay.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma San Antonio Area Foundation'ın bir bağışı ile desteklenmiştir. Mays Kanser Merkezi NCI kanser merkezi destek çekirdek hibe P30 CA054174 tarafından desteklenir. Stephen Holloway'e reaktifleri ve Sung laboratuvarına alan ve mikroskopi kapasitesi sağladığı için yardımları için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| %16 (h/h) paraformaldehit (PFA) sulu çözelti | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 15710 | PFA'nın mikroskopi kalitesi en iyi görüntüleri sağlar. "Ev yapımı PFA" kullanıyorsanız, kullanmadan önce filtreleyin. |
| Sığır serum albümini (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059 | Yağış / arka planı önlemek için ısı şoku fraksiyonu önerilir. |
| Kapak camı #1, 18 mm yuvarlak (lameller) | Neuvitro | NC0308920 | Lamellerin kullanılmadan önce HCl veya etanol ile temizlenmesi ve sterilize edilmesi gerekir. |
| DMEM, Yüksek Glikoz [(+) 4.5 g/L D-Glikoz, (+) L-Glutamin, (-) Sodyum Piruvat] | Gibco | 11965118 | Yetiştirme ortamını kullanılan hücre hattının ihtiyaçlarına göre ayarlayın. |
| DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok | Gibco | 14190144 | doku kültürü için PBS. |
| Etilen glikol-bis (β - aminoetil eter) -N, N, N ve prime;, N ve prime;-tetraasetik asit (EGTA) | Araştırma Ürünleri Uluslararası | E57060 | Nükleer ekstraksiyon tamponu. |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Life Technologies | 104370028 | FBS'nin kalitesi, gH2AX odak oluşumu test edilerek değerlendirilebilir. Partide eser miktarda genotoksik endotoksin varsa, stres olmadığında gH2AX pozitif olacaktır. |
| Magnezyum klorür (MgCl2) | Araştırma Ürünleri International | M24000 | Nükleer ekstraksiyon tamponu. |
| Piperazin-N, N ve prime; -bis (2-etansülfonik asit) (PIPES) | Research Products International | P40150 | Nükleer ekstraksiyon tamponu. |
| Invitrogen | S36973 | 300 nM DAPI ile | SlowFade Diamond Antifade Mountant |
| Sodyum klorür (NaCl) | Research Products International | S23020 | Nükleer ekstraksiyon tamponu. |
| Sükroz | Araştırma Ürünleri Uluslararası | S24060 | Nükleer ekstraksiyon tamponu. |
| Bunun yerine Superfrost Plus Mikroskop Slaytları | Fisherbrand | 1255015 | Polisine Slaytlar kullanılabilir. |
| TC ile İşlem Görmüş Çoklu Kuyu Plakaları, 12 kuyu boyutu | Costar | 3513 | Lameller üzerine tohumlama 12 kuyulu plakada yapılır. |
| Triton X-100 | AmericanBio | AB02025 | Nükleer ekstraksiyon tamponu. |
| Bunun yerine TrypLE Express Enzyme (1X), Fenol Kırmızı | Gibco | 12604021 | Trypsin-EDTA kullanılamaz. |
| Tripsin-EDTA (% 0.5), Bunun yerine Fenol Kırmızı | Gibco | 15400054 | TrypLE kullanılamaz. |
Kaynaklar
- Prakash, R., Zhang, Y., Feng, W., Jasin, M. Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), 016600(2015).
- Jalan, M., Olsen, K. S., Powell, S. N.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
