Yöntem makalesi

Deterjan ve Enzimsiz YöntemLe Tüm Dokudan Çekirdek İzolasyon

DOI:

10.3791/61471

⸱

24 Haziran 2020

 ,  , 
1IRIBHM, Université Libre de Bruxelles (ULB), 2Medecine Faculty, Université Libre de Bruxelles (ULB)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek çekirdek izolasyonu ayrışma ve hücre zarının deterjan bazlı permeabilizasyonuna, optimizasyona ihtiyaç duyan ve teknik eserlere yatkın adımlara dayanır. Tek çekirdekli RNA-seq (snRNA-Seq) veya ATAC-seq için uygun olan çekirdekleri doğrudan tüm dokudan hızlı bir şekilde izole etmek için deterjan ve enzimsiz bir protokol gösteriyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek iş itimattransom ve epigenom profilleme tek bir hücre veya tek çekirdek süspansiyon hazırlanması nı gerektirir. Bozulmamış hücre veya çekirdekile süspansiyon hazırlanması ayrışma ve permeabilizasyon, istenmeyen gürültü ve istenmeyen hasara neden olabilir adımlar içerir. Özellikle, nöronlar gibi bazı hücre tipleri bireysel hücrelere ayrıştırmak için zor. Ayrıca, hücre zarının çekirdekleri serbest bırakmak için permeabilizasyonu deneme yanılma ile optimizasyon gerektirir, hangi zaman alıcı olabilir, emek yoğun ve mali açıdan cansız. Yüksek iş letim atabilen numune hazırlamanın sağlamlığını ve tekrarlanabilirliğini artırmak için hızlı bir enzim ve deterjansız kolon bazlı çekirdek izolasyon yöntemini tanımlıyoruz. Protokol, 20 dakika içinde tüm zebra balığı beyninden çekirdeklerin etkin bir şekilde izole edilmesini sağlar. İzole çekirdekleri bozulmamış nükleer morfoloji ve agrega düşük eğilimi görüntüler. Ayrıca, akış sitometri çekirdekleri zenginleştirme ve downstream uygulama için hücresel enkaz temizliği sağlar. Yumuşak dokular ve kültürlü hücreler üzerinde çalışması gereken protokol, başarılı tek çekirdekli RNA-seq ve ATAC-seq deneyleri için gerekli adımları basitleştirerek, yüksek iş yapma lı profilleme için kullanılabilen numune hazırlama için basit ve erişilebilir bir yöntem sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek hücreli RNA-seq (scRNA-Seq) ve ATAC-seq, karmaşık biyolojik sistemleri tek hücreli çözünürlükte incelemek için çok yönlü araçlardır. Hücre alt tiplerini ve durumlarını, gen ağlarını tanımlamak ve hücresel heterojenliği değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadırlar. ScRNA-seq yapmak için bir ön koşul doku dissosiyatasyonu ile tek hücreli süspansiyon hazırlanmasıdır. Hücre dışı matris bileşimi ve mekanik özelliklerindeki değişim nedeniyle, tek tek dokular tek hücreli süspansiyonun hazırlanması için ayrışma protokolünün optimizasyonunu gerektirir.

Tek hücrelere dokuların ayrışması genellikle 37 °C1,2,3,4de, kollajenaz, dispase veya tripsin gibi sindirim enzimleri ile tedavi içerir. Transkripsiyonel makineler 37 °C'de aktif kaldığından, enzimatik dissosilasyon mRNA ekspresyonu eserlerini ve gürültüyü5,6olarak tanıtabilir. Özellikle, uzun süreli kuluçka strese duyarlı genler ve tekdüze olmayan bir şekilde ısı şoku yanıtı neden olabilir - deneyde teknik değişkenlik yol7.

Tek bir hücre süspansiyon uyaratmanın bir diğer dezavantajı da karmaşık morfolojilere sahip canlı ve sağlam hücre tiplerini elde etmedeki zorlukdur. Özellikle, nöronlar, adipositler ve podositler,8,9,10,11izole etmek için zor . Örneğin, Wu ve meslektaşları bir yetişkin fare böbrek12scRNA profilleriglomerüler podositlerin eksikliği gösterdi. Benzer optimal olmayan gözlemler beyin dokusundan birbirine bağlı nöronların kurtarma ile ilgili yapılmıştır8,13,14. Özetle, ayrışma protokolleri hücre tiplerini daha kolay ayrıştırmaya yönelik algılama önyargısı getirebilmekte ve bu da organın hücresel mimarisinin yanlış yorumlanmasına yol açabilmektedir.

ScRNA-Seq.'de numune hazırlama sırasında ortaya çıkan teknik gürültü ve önyargının üstesinden gelmek için, çekirdeğin izolasyonu ve profilinin saptanması cazip bir alternatif sunar. Nükleer morfoloji farklı hücre tipleri arasında benzer olduğundan, çekirdeklerin izolasyonkarmaşık morfolojileri ile bozulmamış ve canlı hücreleri izole sorunu atlatır. Örneğin, Wu ve meslektaşları tek çekirdekli RNA-Seq ile glomerüler podositler başarılı profilleme gösterdi (snRNA-Seq.) bir yetişkin fare böbrek, hangi scRNA-Seq12eksikti . İlginçtir, tek hücreli ve tek çekirdekli RNA-seq arasındaki karşılaştırmalı çalışmalar snRNA-Seq12ile stres ve ısı şoku yanıt genlerinin indüksiyon bir azalma önerdi. Çalışmalar ayrıca iki yöntem tarafından saptanır genler arasında yüksek bir korelasyon göstermektedir. Ancak, insan mikroglia üzerinde yapılan yeni bir çalışmada Alzheimer hastalığında genetik aktivasyonu tespit etmek için başarısız oldu15. Böylece belirli bağlamlarda, snRNA-Seq scRNA-Seq16,17için uygun bir alternatiftir. Ayrıca, nükleer izolasyon tek hücreli ATAC-Seq için kullanılabilir., tek tek hücreler içinde açık kromatin bölgeleri hakkında bilgi sağlayan.

Çekirdek izolasyonu protokolü üç ana adımı içerir: i) hücre zarının çekirdeği serbest bırakmak için deterjan bazlı lysis; ii) bir Dounce homogenizer kullanarak doku homojenizasyonu; ve iii) çekirdeklerin zenginleşmesi ve degrade santrifüj,19,20,veya akış sitometri sitometri sitometri sitometri sitometri sitometri sitometri sitometri kullanarak hücre enkaz kaldırma , 21,1822.22 Bu, ilk iki adım doku tipine bağlıdır ve ampirik optimize edilmesi gerekir. Hafif deterjan hücre zarının kısmi rüptürüne ve nükleusların dokudan verimsiz alınmasına yol açar23. Öte yandan, deterjan ve sert homojenizasyon yüksek düzeyde nükleer membran rüptürü ve kaybı yol açar24,25. Yırtılmış çekirdekler daha da bir araya kümelenme eğilimindedir ve kaldırılmazsa aşağı profilleme deneyinde eserlere yol açabilir agregalar oluşturur.

Çekirdek izolasyonu için deterjan optimizasyonu ile ilgili sorunları atlatmak için, bozulmamış çekirdekleri deterjansız ve spin-kolon tabanlı bir yöntem kullanarak taze numunelerden izole etmek için bir protokol uyguluyoruz. Protokol, tüm organdan çekirdekleri 20 dakika içinde verir ve bu da transkripsiyonun indüksiyonunu sınırlar. İzole çekirdekler, tek çekirdekli RNA-Seq. ve ATAC-seq için FACS ile zenginleştirilebilir ve sağlam ve çoğaltılabilir yüksek iş lenme profili oluşturmayı sağlayan basit ve evrensel bir yöntem sağlar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıda sunulan tüm prosedürler, Université Libre de Bruxelles (protokoller 578N-579N) tarafından hayvan refahı etik komitesi (CEBEA) tarafından onaylanan kurumsal (Université Libre de Bruxelles (ULB)) ve ulusal etik ve hayvan refahı yönergeleri ve düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Doku diseksiyonu öncesi hazırlık

  1. Zebra balığı ötenazi için PBS'de %0.2 Tricaine çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi buzüzerinde soğutun.
  2. Dokuyu kıymak için 30 mm petri kabı hazırlayın.
  3. Buz soğuğu 1x PBS (doku numunesi başına 10 mL) hazırlayın.
  4. Santrifüj4 °C'ye kadar soğutun.
  5. Çekirdek lerin izolasyonu için deterjansız çekirdek izolasyon kiti(Tablo Malzemeler)kullanın.
  6. Protokolü başlatmadan önce, çekirdek izolasyonundan önce en az 30 dakika buzüzerinde yerleştirerek kitte ön soğutma tamponU A ve B sağlanır.
  7. İzole çekirdekleri işlemek için, %5 BSA çözeltisi ile tüpler ve pipet uçları gibi plastik reaktifleri kaplayın. Bunun için çözeltiyi 40 mL PBS'de 2 g BSA'yı eriterek hazırlayın. Plastik parçaların %5 BSA ile kaplanması, plastiğe yapışan çekirdekleri azaltır. Bu adım izole çekirdeklerin kurtarma artırır.
  8. Pipet uçlarını %5 BSA çözeltisini 2-3 kez pipetleyerek katlayın. Uçları 2 saat boyunca havayla kurutun. Numune başına 10 plastik ipucu hazırlayın.
  9. Çekirdeklerin toplanması için tüpleri %5 BSA ile doldurarak katlayın. Verimli bir kaplama sağlamak için tüpleri 3 kez ters çevirin. Çözeltiyi çıkarın ve tüpleri 2 saat boyunca temiz bir kağıt üzerinde baş aşağı kurulayın. Örnek başına, kitte sağlanan bir toplama tüpü katlayın. Ayrıca, FACS'dan sonra çekirdek lerin toplanması için kaplanmış 1,5 mL tüpler hazırlayın.
    NOT: Cam uçları yapışmayı en aza indirmek için plastik pipet uçlarına son derece tavsiye edilir.

2. Zebra balığı beyninin diseksiyonu

  1. Zebra balığının ötenaziiçin, 25 mL buz gibi Tricaine çözeltisi içeren 90 mm Petri kabı hazırlayın.
  2. Dikkatlice, bir balık ağı kullanarak tanktan zebra balığı almak ve Petri kabına yerleştirin.
  3. 5 dakika tricaine bırakarak balık ötenazi.
  4. Keskin bir jiletle hayvanın kafasını kopar.
  5. Forceps kullanarak, yavaşça kafatası kırmak ve yumuşak dokular kaldırmak, deri ve kemikler ventral ve kafatası nın dorsal tarafında.
  6. Yavaşça, buz gibi pbs içeren taze bir 30 mm çanak içine beyin aktarın.
  7. Spin sütunundaki numunenin yüklenmesikolay bir jilet kullanarak küçük parçalar halinde beyin kıyma.

3. Tek çekirdek izolasyonu

  1. Kıymalı dokuyu çekirdek izolasyon kitinde bulunan filtre kartuşuna aktarın ve dokuyu hassaslaştırmak için 200 μL soğuk tampon A ekleyin. 2 dakika kiti tarafından sağlanan plastik çubuk kullanarak doku grind.
  2. 300 μL soğuk tampon A ekleyin ve 10 dakika açık kapağı ile buz üzerinde filtre kartuşuna inkübün.
  3. Kartuş kapağı ve tüp ters 5 kez doku resuspend.
  4. 30 s için 16.000 x g santrifüj. Bu adımda filtreden geçerken hücreler yırtılır ve yüksek hızlı santrifüj kuvvetuygulanır. Akış, tüpün dibinde ki sağlam çekirdekleri içerir.
  5. Filtreyi atın ve 10 s'lik bir süre şiddetle girdap layarak peleti yeniden askıya alın.
  6. 3 dk. Çözeltiyi 500 x g'da santrifüj ederek çekirdekleri peletleyin.
  7. Peleti 0,8 mL soğuk tampon B ve santrifüj de 600 x g 10 dk için yeniden askıya alın. Bu adımda çekirdekler membran enkazından ayrılır. Elde edilen renksiz pelet izole çekirdekleri içerir.
  8. 500 μL PBS'de izole edilmiş çekirdekleri %5 BSA ile yeniden askıya alın. Kireçlenmeden sonra FACS gerçekleştirmek için çekirdek süspansiyonu buzüzerinde tutun.

4. Nükleus morfolojisinin görselleştirilmesi

  1. Hoechst boyama ile nükleer morfolojiyi doğrulayın. Bunun için, BSA kaplamalı uçları kullanarak yeni bir tüpte 100 μL tek çekirdekli süspansiyonu çıkarın. Çekirdekleri boyamak için 0.1 μL Hoechst (1 mg/mL) ekleyin. Tüpü yavaşça girdaplayın.
  2. Görüntüleme için çekirdek süspansiyonu cam alt çanağa aktarın.
  3. ~405 nm (Violet) dalga boyu lazer uyarma ayarları ile floresan mikroskobu kullanarak çekirdekleri görüntüleyin.

5. Çekirdeklerin FACS tabanlı zenginleştirme

  1. FACS yapmadan önce, 40 μm hücreli süzgeç kullanarak çekirdekleri BSA kaplı tüpe süzün.
  2. Filtrelenmiş süspansiyonu % 5 BSA ile 1.000 μL'lik son hacmine PBS ekleyerek seyreltin.
  3. İki yuvarlak alt FACS tüpünü 'kontrol' ve 'lekeli' olarak etiketlendirin. 'Kontrol' tüpü lekesiz çekirdekler içerirken, 'lekeli' tüp Hoechst lekeli çekirdeklere sahip olacaktır.
  4. BSA kaplamalı pipet ucu kullanarak çekirdek süspansiyonunun 250 μL'sini 'kontrol' tüpüne aktarın.
  5. Kalan 750 μL çözeltiyi 'lekeli' olarak etiketlenmiş FACS tüpüne aktarın ve çekirdekleri lekelemek için 1 μL Hoechst boya ekleyin. Yavaş girdap ile karıştırın.
  6. Lekesiz kontrol örneğini hücre ayırıcısına yükleyin. 5000 etkinlik kaydedin.
  7. Lekeli örnekleri yükleyin ve 5000 olay kaydedin.
  8. Tek çekirdeklerin tanımlanmasına olanak tanıyan FACS kapıları çizin. Çekirdekler, Hoechst floresan sinyalini kontrol ve lekeli numune arasında karşılaştırarak seçilebilir.
  9. Hoechst-pozitif çekirdekleri lekeli tüpten 50 μL PBS içeren yeni 1,5 mL tüpe ve %5 BSA'ya sıralayın.
    NOT: İzole çekirdekler, aşağı akım uygulamasının gereklerine göre istenilen ortama toplanabilir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

--Yukarıda açıklanan protokol, doğrudan zebra balığı beyin dokusundan tek çekirdek süspansiyonu oluşturmak için kullanılmıştır. İzolasyon genellikle 20 dakika gerektirir ve deterjan veya sindirim enzimi kullanmaktan kaçının. Protokolün tek tek adımlarını özetleyen bir şema Şekil 1'deve kılavuz olarak kullanılmak üzere yazdırılabilen bir şema sağlanır.

figure-results-1
Şekil 1: Çekirdek izolasyonu için deterjansız spin-kolon bazlı yöntem şeması.
Taze zebra balığı beyin dokusundan çekirdeklerin çıkarılması sırasında yapılan bireysel adımların grafiksel gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Nükleer morfolojinin görselleştirilmesi

Nükleer morfolojinin nitel teyidi için izole edilmiş çekirdekler Hoechst ile boyandı ve floresan mikroskopisi kullanılarak görselleştirildi. Çekirdekler sağlam, yuvarlak ve iyi ayrılmış olarak ortaya çıktı (Şekil 2). Daha da önemlisi, nükleer membran yırtığının bir işareti olan nükleer toplama yoktu.

figure-results-2
Şekil 2: Zebra balığı beyninden tek çekirdek izolasyonu.
Hoechst lekeli çekirdeklerin bozulmamış morfolojilerini gösteren floresan mikroskopi görüntüsü. Ölçek çubuğu: 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bozulmamış çekirdeklerin FACS tabanlı zenginleşmesi

İzole çekirdeklerin zenginleştirilmesi ve hücresel enkazın çıkarılması, hoechst floresan sinyalinin varlığı üzerine gating edilerek akış sitometrisi ile gerçekleştirilmiştir. Hoechst sinyali menekşe, 405 nm, lazer (Brilliant Violet 421 – BV421) ile uyarma üzerine tespit edildi. Lekesiz çekirdekler arka plan floresan görüntülenen (Şekil 3A, Ek Şekil 1A), lekeli çekirdekleri güçlü floresan sinyal sergilerken (Şekil 3B, Ek Şekil 1B). Şekil 3C'degösterildiği gibi, lekesiz ve Hoechst lekeli çekirdekler menekşe kanalında iyi ayrılmıştır.

figure-results-3
Şekil 3: İzole çekirdekler akış sitometrisinde güçlü ve spesifik Hoechst floresan sinyali gösterir.
Hoechst boyama dağılımını gösteren tek çekirdeksüspansiyoniçin histogram çizimleri. Hoechst menekşe, 405 nm, lazer (Brilliant Violet 421 – BV421) tarafından heyecanlı. Lekesiz örnek(A)100-103aralığında sinyal görüntülerken, Hoechst lekeli çekirdekleri (B) 103-105 aralığında sinyal yontabilir. Lekesiz (gri) ve lekeli (mavi) örnekler(C)tarafından yayılan floresan yoğunluğunun bir bindirme iki popülasyon arasında net bir ayrım göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Ek Şekil 1: İzole çekirdekler için akış sitometri gating stratejisi. İzole çekirdek süspansiyonu için temsili akış çizimleri. İzole çekirdekler ileri dağılım ve 405 nm hoechst heyecanlandıran Violet lazer BV421 kullanılarak analiz edildi. Lekesiz örnek(A),100-103 aralığında BV421 sinyalini görüntüledi. 13130 olaydan 141'i FSC-A'ya (toplamın %1,07'si) dayalı tek çekirdek, BV421 sinyaline (toplamın %0'ı) dayalı lekesiz çekirdekler için 0 olay olarak saptandı. Hoechst lekeli çekirdekleri(B)103-105 aralığında BV421 sinyali görüntüledi. 50000 olaydan 2418'i FSC-A'ya (toplamın %4,84'ü) dayalı tek çekirdek, BV421 sinyaline (toplamın %4,83'ü) dayalı Hoechst-pozitif çekirdekler için 2414 olay olarak saptandı. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transkriptom ve epigenomun tek hücreli çözünürlükte profilini çıkarmak biyolojik sistemlerin incelenmesinde devrim yarattı. Katı bir doku için tek bir hücrenin çözünürlüğünde yapılan çalışmalar, organın tek tek hücrelere veya çekirdeklere ayrıştırılmasına bağlıdır. Dissosyon, sistemin 55, 6'nın6doğru bir temsilinin geliştirilmesini engelleyebilen teknik eserler idamı veren yıkıcı bir prosedürdür. Örneğin, enzimatik dissociation karmaşık morfolojileri ile hücrelere zarar verebilir, nöronlar veya podositler gibi, ve stres ve ısı şoku yanıt genlerinin ifade neden olabilir7,12. Ayrıca, dissosilasyon sırasında deterjan kullanımı nükleer membran yırtılması ve toplama yol açabilir23,25. Bu nedenle, tek bir hücre veya en yüksek kalitede çekirdek süspansiyon elde etmek için ayrışma optimize yüksek iş çıkışlı profilleme deneylerin başarısı için çok önemlidir.

Burada, zebra balığı beyninden bozulmamış çekirdeklerin 20 dakikadan daha kısa bir sürede çıkarılmasını sağlayan bir deterjan ve enzimsiz çekirdek izolasyon yöntemi gösteriyoruz. Protokol tipik morfolojisi ve sağlam bütünlüğü ile çekirdekleri verir(Şekil 2). 6 mg ağırlığındaki tek bir zebra balığı beyninden, protokol hemositometre sayısı ile belirlenen toplam 60.000 çekirdek verir. İzole çekirdekleri snRNA-seq, ATAC-seq ve immünboyama dahil olmak üzere birden fazla downstream uygulamaları için kullanılabilir. İzole çekirdekleri sitoplazmik fraksiyonlardan çapraz kontaminasyon içerebilir, özellikle endoplazmik retikulum ve mitokondri bileşenleri. Yüksek iş bölümü profilleme deneyleri için, hücresel enkazın, özellikle mitokondrilerin temizlenmesi şiddetle tavsiye edilir. Akış sitometrisi (Şekil 3) çekirdeklerin saflaştırılması için uygun bir seçenek sağlar. Alternatif olarak, sakaroz gradyanı da enkaz kaldırılması için kullanılabilir.

Protokol fare tiroid bezi üzerinde test edilmiştir (veriler gösterilmez) ve zebra balığı beyin dokusuna benzer sonuçlar sağlar. Genel olarak, protokol tek çekirdek süspansiyonu hazırlanması için sağlam, tekrarlanabilir ve evrensel bir yöntem sağlayarak yüksek iş çıkarma lı profil oluşturma deneyleri için lojistiği basitleştirmeye yardımcı olur.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların çıkar çatışması yok. Makaleye açık erişim yapmak için ödeme Invent Biotechnologies Inc, ABD tarafından yapılmıştır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Sabine Costagliola ve Singh laboratuarı üyelerine el yazması hakkındaki yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Fonds de la Recherche Scientifique-FNRS tarafından 34772792 – MISU'dan S.P.S.'ye hibe numarası altında desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sığır serum albümini (BSA)Carl Roth90604-29-8Albümin fraksiyonu V
Hücre sıralayıcıBD BiosciencesFACSAria III
SantrifüjSartoriusA-14C
Eppendorf tüpleri (1.5 mL)Eppendorf22363204
Falcon (15 mL)Corning352096Polipropilen santrifüj tüpleri
Falcon (5 mL)Corning352052Polistiren yuvarlak tabanlı test tüpleri
İnce forsepsGüzel Bilim Araçları11295-10
Flowmi hücre süzgeci (40 & mu; m)SigmaBAH136800040
Floresan mikroskobuLeicaDMI6000 B
Cam şişe (250 mL)VWR215-1593
Cam tabanlı çanakWorld Precision InstrumentsFD3510-100Florodish 35 mm
Cam Pasteur pipetleriVWR612-1701
Cam pipet soketiCarl Roth388.1Pipetleme yardımcısı pi-pump 2500
Hoechst boyama boya çözeltisiAbcamab228551Hoechst 33342
Dakika Deterjansız Çekirdek İzolasyonKiti Invent BiotechnologiesNI-024
PBS (10X)ThermoFisher70011069
Petri kabı (30 mm)FisherScientific11333704Pyrex
Petri kabı (90 mm)Corning758-10178-CSGosselin
Pipet uçlarıVWR8907910 & L, 200 μ L, 1000 μ L
PipetlerGilsonF167380Pipetman
Tıraş bıçağıSwann-Morton7981809
Trikain metan sülfonatSigmaE10521
Vorteks makinesiBilimsel EndüstrilerSI-0236Vorteks-Cin 2

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).
  2. Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
  3. Khan, M. R., Chandrashekran, A., Smith, R. K. W., Dudhia, J. Immunophenotypic characterization of ovine mesenchymal stem cells. Cytometry Part A. 89 (5), 443-450 (2016).
  4. Cavanagh, T. J., Lakey, J. R. T., Wright, M. J., Fetterhoff, T., Wile, K. Crude collagenase loses islet-isolating efficacy regardless of storage conditions. Transplantation Proceedings. 29 (4), 1942-1944 (1997).
  5. Massoni-Badosa, R., et al. Sampling artifacts in single-cell genomics cohort studies. bioRxiv. , (2020).
  6. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  7. O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumour tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Bioarxiv. 683227, (2019).
  8. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. Plos One. 13 (12), 0209648(2018).
  9. Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  10. Rajbhandari, P., et al. Single cell analysis reveals immune cell-adipocyte crosstalk regulating the transcription of thermogenic adipocytes. eLife. 8, (2019).
  11. Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
  12. Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
  13. Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7 (1), 1-13 (2016).
  14. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
  15. Thrupp, N., et al. Single nucleus sequencing fails to detect microglial activation in human tissue. bioRxiv. , (2020).
  16. Selewa, A., et al. Systematic Comparison of High-throughput Single-Cell and Single-Nucleus Transcriptomes during Cardiomyocyte Differentiation. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  17. Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).
  18. Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neuroscience. 9, 42(2008).
  19. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
  20. Birnie, G. D. Isolation of Nuclei from Animal Cells in Culture. Methods in Cell Biology. 17, 13-26 (1978).
  21. Dounce, A. L., Witter, R. F., Monty, K. J., Pate, S., Cottone, M. A. A method for isolating intact mitochondria and nuclei from the same homogenate, and the influence of mitochondrial destruction on the properties of cell nuclei. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 1 (2), 139-153 (1955).
  22. Hymer, W. C., Kuff, E. L. Isolation of Nuclei From Mammalian Tissues Through the Use of Triton X-100. The journal of Histochemistry and Cytochemistry. 12, 359-363 (1964).
  23. Johnson, M. Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More. Materials and Methods. 3, (2013).
  24. Sikorskaite, S., Rajamäki, M. L., Baniulis, D., Stanys, V., Valkonen, J. P. T. Protocol: Optimised methodology for isolation of nuclei from leaves of species in the Solanaceae and Rosaceae families. Plant Methods. 9 (1), 31(2013).
  25. Graham, J., Rickwood, D. Subcellular fractionation: a practical approach. , IRL Press. (1997).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Deterjan ermeyen Y ntemEnzim ermeyen ProtokolZebrafish BeyniAk SitometrisiHEX BoyamaTekil ekirdek S spansiyonuBSA KaplamaSantrif gasyon ProtokolFloresan Mikroskobu

İlgili makaleler