Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Tetrodotoksin Mikroenjeksiyonları ile Ters İnaktivasyon Yoluyla Yumurtlamanın Düzenlenmesinde Sıçan Beyninin Ayrık Alanlarının Rolünün Çözülmesi

2.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61493

⸱

3 Eylül 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Chronobiology of Reproduction Research Lab, Biology of Reproduction Research Unit, Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Developmental Biology Lab, Biology of Reproduction Research Unit, Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, Universidad Nacional Autónoma de México, 3Neuroendocrinology Lab, Biology of Reproduction Research Unit, Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, Universidad Nacional Autónoma de México, 4Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Autónoma de México, 5Department of Basic Research, Instituto Nacional de Geriatria, Ministry of Health

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, düşük maliyetli bir mikroenjeksiyon sisteminin inşasını, derin beyin yapılarına stereotaksik implantasyonunu ve uyanık ve sınırsız sıçanlarda tetrodotoksin zamanlanmış mikroenjeksiyon prosedürünü açıklar. Amaç, hipotalamik yapıların nöral aktivitelerini engelleyerek yumurtlamanın düzenlenmesine katılımını ortaya çıkarmaktır.

Özet

Yumurtlamanın düzenlenmesinde beynin rolünü incelemek için birçok deneysel yaklaşım kullanılmıştır. Örnekler arasında, her ikisi de hedef alanın bütünlüğünü kalıcı olarak bozan invaziv yöntemler olan nöronal grupların lezyonu ve sağırferentasyonu say verilebilir. Bu yöntemlere akut ve zamansal düzenleyici mekanizmaların analizini etkileyebilecek ikincil etkiler eşlik eder. Belirli beyin bölgelerini hedefleyen kılavuz kanüllerin stereotaksik implantasyonu, ardından bir iyileşme dönemi, araştırmacıların ameliyatın istenmeyen etkilerinin ortadan kalkmasından sonra farklı ilaçları mikroenject etmelerini sağlar. Tetrodotoksin, çeşitli fizyolojik süreçlerde birkaç beyin bölgesinin rollerini belirlemek için kullanılmıştır, çünkü sodyuma bağımlı eylem potansiyellerini geçici olarak inhibe eder, böylece hedef bölgedeki tüm sinirsel aktiviteyi engeller. Bu protokol, bu yöntemi, östrous döngüsünün herhangi bir aşamasının belirli zamanlarında yumurtlamanın düzenlenmesinde ayrı beyin bölgelerinin rolünü ortaya çıkarmak için östrous döngüsünün ve yumurtlamanın değerlendirilmesi için stratejilerle birleştirir. Anesteziklerin ve stres hormonlarının yumurtlama üzerinde uyguladığı bloke etme etkilerinden kaçınmak için uyanık ve sınırsız sıçanlar(Rattus norvegicus)kullanılmıştır. Bu protokol, farklı fizyolojik süreçleri incelemek için diğer türlere, beyin hedeflerine ve farmakolojik ajanlara kolayca uyarlanabilir. Bu yöntemde gelecekteki iyileştirmeler, kılavuzüller yerine küçük çaplı cam kılcal damarlar kullanılarak bir mikroenjeksiyon sisteminin tasarlanmasını içerir. Bu, implantasyon sırasında hasar gören doku miktarını azaltacak ve aşılanan ilaçların hedef alan dışına yayılmasını azaltacaktır.

Giriş

Yumurtlama, her estral/adet döngüsünde bir veya daha fazla olgun oositin yumurtalıklardan salındığı süreçtir. Tüm memeli türleri üremek için gametlerin üretimine bağlı olduğu için, yumurtlamayı düzenleyen mekanizmaların anlaşılması biyotıp, hayvancılık endüstrisi ve nesli tükenmekte olan türlerin bakımından geniş alanlarda büyük bir etkiye sahiptir. Yumurtlama, birkaç hipotalamik ve ekstra hipotalamik alanı, ön hipofizdeki gonadotropları ve oositlerle birlikte yumurtalıkların içindeki yumurtalık köklerini oluşturan theca ve granüloza hücrelerini içeren hipotalamik-hipofiz-yumurtalık ekseni ile düzenlenir1.

Yumurtalık folikülleri, folikül uyarıcı hormonun tonik ve phasic salgılanmasına ve gonadotroplar tarafından salgılanan iki gonadotropin olan luteinize edici hormona yanıt olarak büyür, gelişir ve sonunda yumurtlar. Gonadotropin salgılama patörü, uygun foliküler gelişim ve yumurtlama için çok önemlidir ve gonadotropin salgılayan hormon (GnRH)1,2tarafından düzenlenir. Bu nöropeptid, bazal diencephalon boyunca dağılmış nöronlar tarafından sentezlendi ve daha sonra hipotalamus ve ön hipofizini birbirine bağlayan portal vaskülat salgılandı. GnRH-nöronların salgı aktivitesi, çeşitli beyin yapılarından kaynaklanan sinaptik girdi ile modüle edilir. Bu yapılar, yiyeceklerin mevcudiyeti, fotoperiyodun uzunluğu ve kandaki hormonların konsantrasyonu da dahil olmak üzere organizmanın dış ve iç ortamının durumu hakkında bilgi aktarır. Bu anlamda, her türün üreme düzenini şekillendiriyorlar ve yumurtlamayı yöneten mekanizmaların düzgün bir şekilde anlaşılması için bu tür yapıların belirli rolleri belirlenmelidir. Örnek olarak, östrous döngüsü sırasında estradiol seviyelerindeki dalgalanmanın GnRH salgısını düzenlediği gösterilmiştir; bununla birlikte, GnRH-nöronları bu tür değişiklikleri tespit etmek için gereken estradiol reseptör izoformını ifade etmez. Bu reseptörleri ifade eden iki nöron popülasyonu, sırasıyla üçüncü ventrikülün rostral periventriküler bölgesinde ve arcuate çekirdeğinde ve GnRH-nöronları ile stablish sinapslarında bulunur. Bu nöronların estradiol konsantrasyonunu yorumladığını ve daha sonra GnRH salgısının güçlü bir indüktörü olan kisspeptin'i serbest bırakarak GnRH-nöronlarının aktivitesini uyardığını gösteren kanıtlarvardır 3.

Thermik veya kimyasal lezyonların yanı sıra mekanik sağırferentasyonu içeren deneyler, araştırmacıların yumurtlama4,5 , 6 , 7 ,8,9,10,11,12'nin düzenlenmesinde birkaç beyin yapılarının katılımını belirlemelerine izinverdi. . Bununla birlikte, bu deneyler invaziv ve travmatik olmanın dezavantajıdır, tedavinin etkilerini değerlendirmeden önce birkaç gün iyileşme gerektirir ve tedavinin akut etkilerinin analizini engeller. Ayrıca hedeflenen alanları kalıcı olarak etkiler ve uzun vadede diğer fizyolojik süreçleri bozar. Bu sorunlar nedeniyle, bu deneylerin sonuçları genellikle hayvanın vücudundaki homeostatik telafi edici mekanizmalar tarafından gizlenmektedir ve alanın dahil olduğu zamansal düzenleyici dinamikler hakkında doğru bilgi almak oldukça zordur.

Nöronların aktivitesini geçici olarak bozan ilaçların kılavuz kanüller aracılığıyla mikroenjeksiyonu, yukarıda belirtilen dezavantajları aşan uygun bir alternatiftir. Kanüller stereotaksik bir ameliyatla herhangi bir beyin bölgesine yerleştirilecek ve araştırmacının ameliyatın şaşırtıcı etkileri ortadan kaybolduktan sonra ilaç tedavisine başlamasını sağlar. İlaçların zamanlanmış mikroenjeksiyon, araştırmacıların bölgenin sürecin belirli bir adımına katkısı ile ilgili hipotezleri test etmelerini sağlar ve uyanık kısıtlanmış veya serbest hareket eden hayvanlarda gerçekleştirilebilir. Lokal anestezistler, agonistler, antagonistler, ters agonistler ve tetrodotoxin (TTX) gibi biyolojik toksinler de dahil olmak üzere çeşitli ilaçlar belirli zamanlarda ilgi alanına mikroenjeksiyon yapılabilir.

TTX, kirpi balığının vücudunda yaşayan bakterilerin yanı sıra diğer omurgalılar ve omurgasızlar tarafından sentezlenen biyolojik bir toksindir. TTX, sodyum kanallarının seçici ve geçici ablukası yoluyla sinirsel aktiviteyi susturur, bu da sodyuma bağımlı eylem potansiyellerinin inhibisyonu ile sonuçlanır. TTX varlığında, hücreler depolarizasyon aşamasında bir değişiklik yaşarlar ve bu nedenle heyecan verici değildir, ancak canlı kalırlar. TTX'in bloke etkisi moleküler bileşimi ile açıklanmaktadır: bir guanidinium grubu sodyum kanalının hücre dışı yönünden geçebilir, ancak molekülün geri kalanı boyutu nedeniyle geçemez, bu nedenle sıkışmıştır ve kanal13 , 14,15,16,17'yi engeller. . TTX'in etki mekanizması, sinir sistemini hem in vitro hem de in vivo incelemek için bir araç olarak kullanılmasına izin verdi. Bu toksinin intraserebral enjeksiyonu, hafıza tutma18,uyku ve uyarılma 19 , yer tanıma20, mekansal navigasyon21, uyuşturucu bağımlılığı 22 , termoregülasyon23, şizofreni gelişimi24,cinsel davranış25ve yumurtlamanın düzenlenmesi26gibi çeşitli işlemlerde ayrı beyin bölgelerinin rolünü incelemek için kullanılmıştır. diğerleri arasında. Bu protokolde hipotalamik çekirdeklerin uyanık ve sınırsız sıçanlarda TTX mikroenjeksiyonu ile geçici inaktivasyonunun yumurtlaması üzerindeki etkileri açıklıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvanları içeren prosedürler Facultad de Estudios Superiores Zaragoza Etik Kurulu, UNAM tarafından onaylandı. Bu kurum, meksika hayvan taşıma kurallarına, Resmi Norma: NOM-062-ZOO-1999'a sıkı sıkıya uygun olarak faaliyet göstermektedir.

1. İki taraflı canüllerin yapımı

  1. Paslanmaz çelik şaftı basınçlı cımbız kullanarak iki 23 G hipodermik iğnenin göbeğinden çıkarın ve ardından neşter bıçağı kullanarak kalan yapıştırıcıyı çıkarın.
  2. Şaftların künt ucundan 15 mm uzakta ince kalıcı bir işaretleyici ile bir çizgi çizin. Eğimli uçları çıkarmak için kesme cımbızı kullanın.
  3. 15 mm'lik parçaları ince hemostatlarla tutun ve 14 mm'lik boru parçaları elde edilene kadar bir döner alete bağlı bir kesme diski ile dik olarak bastırın. Bu adım, şaftların tıkalı kısmını ortadan kaldırmak için yapılır, açık ve künt uçlar oluşturur. Son olarak, herhangi bir iç tıkanıklığı ortadan kaldırmak için segmentlere 30 G'lik bir iğne yerleştirin.
  4. Beynin sol ve sağ yarımkürelerindeki ilgi yapıları arasındaki mesafeyi bir beyin atlası yardımıyla belirleyin27. İki 14 mm'lik parçayı bir mikroskop kaydırağından bağlamak ve her ikisinin de aynı yatay seviyede olduğundan emin olmak için kalıplama kilini kullanın. Bir oküler mikrometre (10x) ile gözlemleyin ve istenen mesafe elde edilene kadar parçaları ince cımbızla ayarlayın.
  5. Lehim macunu% 10 hidroklorik asitle 2:1 oranında karıştırın ve parçaların künt ucunun 2 mm altına bir damla karışım ekleyin. Lehimleme demiri ve 0,5 mm çapında lehim teli kullanarak her iki segmenti de tek bir nokta ile lehimler. Lehim parçaların lümenini engellemediğinden emin olun.
  6. 10 mm'lik esnek 0,3 mm paslanmaz çelik tel segmentini keserek, canülleri stereotaks tutucuya takmak için bir destek oluşturun. Bir önceki lehim noktasıyla temas eden telin 2 mm'sini ve geri kalanının de canüllerin künt ucunun üzerine sermek için kalıplama kili kullanın. Kabloyu konservelere lehimle.
  7. Lehim macunun fazlalığını gidermek için kanüllerin yüzeyini% 70 etanol ile temizleyin. Metalik parçacıkları gidermek için kanolün içini steril suyla yıkayın. Mikroskop altında 10x büyütmede parçacık tespit edene kadar bu işlemi tekrarlayın.

2. Obturatörlerin ve kapakların yapımı

  1. Obturatörleri oluşturmak için yuvarlak paslanmaz çelik yumuşak telden (0,35 mm çapında) iki adet 16 mm'lik parça kesin. Hemostatlı, laboratuvar tezgahına dik iki taraflı bir canül tutun ve bu segmentlerden birini tezgaha ulaşana kadar her bir makula yerleştirin. Kalıntıyı 90° açıyla bükün.
  2. Kapaklar için iki adet 2 mm'lik silikon boruyu kesin (iç çap=0,76 mm) ve her segmentin uçlarından birine bir damla silikon yapıştırıcı uygulayın. Tutkalın boruya girmesine izin vermeyin. En az 24 saat kurulayın.

3. Mikroenjektörlerin yapımı

  1. Şaftları oluşturmak için 30 G hipodermik iğne kullanarak 1.1.
  2. Millerin künt ucundan 18,5 mm aralıklarla bir çizgi çizin ve eğimli uçların kalıntılarını kesme cımbızı ile çıkarın.
  3. 1.1. adımı tek bir 23 G iğneyle tekrarlayarak künt uçtan başlayarak 6 mm uzunluğunda iki segment keserek adaptörler oluşturun.
  4. 6 mm'lik parçaların tıkalı kısımlarını, iki adet 4 mm adaptör elde edilene kadar kesme diskine dik bir şekilde bastırarak ortadan kaldırın. herhangi bir iç tıkanıklığı ortadan kaldırın.
  5. 30 G segmentinin eğimli ucunun adaptörlere yerleştirin. Her ikisinin de, segmentlerin ve adaptörlerin sonunun aynı seviyede olduğundan emin olmak için bir stereomikroskoptan bakın. Distal ekleme pamuklu çubuk kullanarak siyanoakrilat tutkal uygulayın ve 15 dakika kurumaya bırakın.
  6. İki Teflon boru konnektörünü% 70 etanolde 5 dakika bekletin ve ardından adaptörler aracılığıyla mikroenjektörlere takın. Konektörlerin çapı en az 24 saat küçülene kadar bekleyin ve ardından konektörlerin zarar görmesini önlemek için mikroenjektörü düşük sıcaklık yöntemiyle sterilize etmeyin (etilen oksit sterilizasyonu önerilir).

4. Hayvan bakımı ve vajinal lekeler

  1. 230 ila 260 gram ağırlığında döngüsel yetişkin dişi kapüşonlu sıçanlar(Rattus norvegicus, CIIZ-V suşu) kullanın. Sıçanları 14:10 açık-koyu fotoperiyodlu bir odada standart polipropilen kafeslerde dört kişilik gruplar halinde barındırın. Sıcaklık ve nemi sırasıyla 22 ± 2 °C ve % 40 olarak ayarlayın. Gıda ve su reklam libitumsağlayın.
  2. Her gün 10:00-12:00 saatleri arasında vajinal smear alın.
    1. İç çapı 1 mm olan modifiye edilmiş bir bakteriyolojik döngüyü alkol lambası kullanarak sterilize edin ve steril suyla soğutun. Sıçanı güvenli bir kavrama ile tutun ve iç duvarlarına dokunarak vajinaya 5 mm bakteriyolojik döngü sokun. Bakteriyolojik döngüyü çıkarın. Başarılı olursa, uçta bulutlu bir düşüş görülecektir. Bu damlayı mikroskop slaydına yerleştirin.
    2. Her sıçan için bu işlemi tekrarlayın ve her hayvan arasındaki döngüyü sterilize edin ve soğutun.
    3. Damlalar kuruduktan sonra hematoksilin-eosin ile lekeleyin ve örnekleri 10x'te mikroskop altında gözlemleyin.
    4. Her smear üzerindeki lökositlerin, epitel çekirdekli hücrelerin ve keratinize hücrelerin oranını belirleyin ve şekil 1'debildirilen östrous döngü aşamalarının kriterlerine göre sınıflandırın , önceki literatür28,29ile aynı fikirdedir.

5. Canüllerin stereotaksik implantasyonu

NOT: Düzenli bir aseptik stereotaksik cerrahi sonrasında ve kurumsal normlara uygun olarak kanüllerin implantasyonunu gerçekleştirin.

  1. Ameliyattan önce
    1. Cerrahi aletleri, kanülleri, cerrahi vidaları, obturatörleri, gazlı bezleri ve ahşap pamuklu çubukları bir buhar otoklav kullanarak ameliyattan 24 saat önce sterilize edin. Metalik aletlerin arka arkaya ameliyatlar arasındaki uçlarını% 10 hidrojen peroksit ve ardından su ile temizleyerek sterilize edin ve ardından sıcak boncuk sterilizatörüne yerleştirin.
    2. Hayvanı evden çıkarmadan önce çalışma alanlarını ve stereotaksik aleti hazırlayın. İşlem sırasında kirlenmeyi önlemek için hayvanı ameliyat masasından mümkün olduğunca uzak bir alanda ameliyata hazırlayın.
    3. Hazırlık ve ameliyat alanlarını% 70 etanol ile temizleyin ve ardından on dakika boyunca% 10 klorür çözeltisi uygulaması yapın. Stereotaksik aletin tabanını, çerçevesini ve manipülatörlerini % 70 etanol ile temizleyin ve kulak çubuklarının uçlarını sıcak boncuk sterilizatörü kullanarak sterilize edin ve ameliyattan önce hava soğutun.
    4. Özel bir laboratuvar önlüğü, yüz maskesi, baş bone, cerrahi kollar, ayakkabı örtüleri ve cerrahi eldivenler giyerek ameliyatı gerçekleştirin. Asistandan hayvanları ameliyata hazırlamasını ve işlem sırasında genel durumlarını kontrol etmesini isteyin.
    5. Canül stereotaks tutucuya takın. Asistandan ameliyat edilecek ilk hayvanı odaya getirmesini isteyin. Laboratuvarımızdan yapılan gözlemler, bu hayvanların diğer aşamalarda çalıştırılan sıçanlardan daha hızlı uygun östrous döngülerini geri kazandığını gösterdiğinden, muhtemelen strese verilen yanıt östrous döngüsü ile birlikte değiştiğinden, ameliyat için diestrus'ta sıçanları seçin.
    6. Hayvanı tartın ve bir izofluran buharlaştırıcıya bağlı sıçanlar için bir indüksiyon odasında% 100 oksijende% 4 izofluran ile anesteziye neden olabilir. Hayvanları strese sokarak önlemek için odayı önceden doldurmayın. Sağ refleksin kaybını gözlemledikten sonra gözbebeği genişlemesini ve kuyruk ve kulak çimdikleme testlerinin ölçttürü olduğu gibi ağrı kaybını kontrol ederek cerrahi bir anestezi düzlemini onaylayın.
      1. Bir izoflurane buharlaştırıcı yoksa, ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile sıçanı uyuşturun.
    7. Sıçanı indüksiyon odasından çıkarın ve % 100 oksijende% 2.5 izofluran ile anestezinin etkilerini korumak için hazırlık tablosunda bir burun konisi kullanın. Saç derisinin saçını makasla kesin ve gevşek saçları bir tiftik silindiri ile çıkarın. Steroidal olmayan bir antienflamatuar/analjezik ve antibiyotik olarak sırasıyla 2 mg/kg Meloxicam ve 5 mg/kg Enrofloksasin preoperatif deri altı dozu enjekte edin.
      1. Ameliyat sırasında oluşmamak için her göze hypromelloz yapay gözyaşı uygulayın.
    8. Hayvanı stereotaksik alete, yırtılmayan kulak çubukları ve anestezi maskesi kullanarak bir ısıtma yastığının üzerine monte edin. Hayvanın başının düz olduğundan emin olmak için burun kelepçesini ayarlayın. Tıraşlı bölgede sabunlu povidone-iyot ile bir kez %70 etanol arasında değişen ve daha sonra iki kez povidone-iyot ve %70 etanol kullanarak cerrahi bir ovma yapın. İşlem sırasında hayvanın sıcaklığını kaydetmek için bir rektal termometre yerleştirin ve ardından steril bir cerrahi alanla örtün.
  2. Ameliyat sırasında
    1. Tıraş edilen bölgenin ortasında ciltte ve kasta 2 cm'lik bir kesi yapmak için neşter kullanın. Hedef koordinatları hesaplamak için kullanılacak yer işaretleri olan bregma veya lambda'yı ortaya çıkarmak için% 2 hidrojen peroksit ile kaplanmış bir pamuklu çubuk kullanarak periosteumu kafatasından çıkarın. Dönüm noktasının daha iyi görselleştirilmesi için kafatasını hava ile kurutun.
    2. Kanülleri tercih edilmiş dönüm noktasının hemen üzerinde bir konuma taşımak için stereotaksik cihazın manipülatörlerini kullanın. Ön-arka ve medial-lateral koordinatları stereotaksik aletten kaydedin ve hedef alanın koordinatlarını beyin atlası27'yegöre hesaplamak için kullanın.
    3. Hesaplanan koordinatları stereotaksik alete ayarlayın ve damarın ucunu kafatasının yüzeyine yerleştirin. Dorsal-ventral koordinatı kaydedin ve hedef bölgeye derinliği hesaplamak için kullanın.
    4. Manipülatörün kolunu çerçeveden sökerek çıkarın. Kraniyotomi yapılacak yerde bir iz bırakmak için 15.000 rpm hızında bir döner alete bağlı bir diş çapağı kullanın. Daha sonra çapak kullanarak üç delik açın ve işaretin etrafında eşkenar üçgen oluşturun. Bu delikler kafatasını delmemeli. Cerrahi vidaları deliklere yerleştirin ve sıkıca yerleştirildiklerinden emin olabilirsiniz.
    5. Kraniyotomiyi her yarımkürede hedef alanlar arasındaki mesafeyi karşılayacak kadar geniş hale getirin. Çapı mümkün olduğunca küçük olmalı, ancak kafatasının sınırlarına dokunmadan kanüllerin indirilmesine izin verecek kadar büyük olmalıdır, çünkü bu yörüngeyi değiştirecektir. Kraniyotomiyi mümkün olan en düşük basıncı uygulayarak kademeli olarak gerçekleştirin. Kemirgen kafatası sadece birkaç milimetre kalınlığındadır ve aşağıdaki dokuların bütünlüğünü korumak çok önemlidir.
    6. Dura mater görünür olduktan sonra, kemik kıymıklarını çıkarmak ve menenjitlerde ön-arka kesim yapmak için ucu 90 ° açıyla kavisli steril bir 21 G iğne kullanın. Hedef alan orta çizgiye yakın bir yerde bulunuyorsa üstün sagittal sinüsün zarar görmesini önlemek için Wirtshafter ve iş arkadaşları30 tekniğini kullanın.
      1. Kanül ile tutucuyu çerçeveye yerleştirin ve ventral koordinata ulaşmak için dorsal-ventral manipülatörü kullanın. İğnenin inerken kenarlıklara temas etmediğini kontrol edin ve gerekirse kraniyotomi çapını artırın.
        NOT: Kılavuz canüllerin ucunun ilgi çekici bölgenin 0,5 ila 2,0 mm üzerinde bir bölgeyi hedeflemesi önemlidir. Bu, yabancı cisimlerin tanıtımına ve dokunun tahrip olmasına yanıt olarak beynin enflamatuar reaksiyonlarından kaynaklanmaktadır. Bu, özellikle ilgi alanı küçükse ve çalışma mesafesinin ampirik olarak önceden hesapılması gerekiyorsa kritik öneme sahiptir.
    7. Canülleri kafatasına takmak için diş çimentosu uygulayın ve kurumasını bekleyin. Diş çimentosunun kanüllerin künt ucunun üzerini kapatmamasını sağlayın, çünkü bu onu geri döndürülemez bir şekilde engelleyecektir. Çimento tamamen katılanınana kadar bekleyin.
    8. Daha fazla tıkanıklığı önlemek ve çalışma sırasında açıklığı sağlamak için obturatörleri yerleştirin. Kirlenmeyi önlemek için silikon kapağı takın.
  3. Ameliyattan sonra
    1. Kayıp sıvıları fizyolojik bir sıcaklıkta 1,0 mL steril salin çözeltisinin intraperitoneal enjeksiyonu ile değiştirin. Hayvanı anesteziden iyileşene kadar termal destekle bir geri kazanım kafesine yerleştirin. Hayvanın sıcaklığını ve ocağını / solunum hızını periyodik olarak kontrol edin. İzofluran etkileri gaz akısının kesilmesinden sonra birkaç dakika sürerken ketamin/ksilazin etkileri 40-50 dakika sürer.
    2. 48-72 saat boyunca antibiyotik, analjezik ve antienflamatuar ilaçların (daha önce belirtilen dozlarda ve rotalarda) ameliyat sonrası enjeksiyonlarını sağlayın ve deney geri kalanı için hayvanları günlük olarak yakından inceleyin. Herhangi bir ağrı, stres veya kilo kaybı belirtisini veteriner hizmetlerine veya laboratuvarın eğitimli bir üyesine bildirin. Bu süre zarfında sıçanlara başka bir manipülasyon yapmayın.
    3. Ameliyat sonrası tedaviden sonra vajinal smear almaya başlayın ve hayvan dört günlük ardışık üç östrous döngüsü gösterene kadar yapmaya devam edin.
      NOT: Kronik juguler kateterler cerrahi olarak implante edilebilir, araştırmacının estradiol, progesteron, testosteron, luteinize edici hormon, folikül uyarıcı hormon ve kortikosteron gibi hormonların salgısını analiz etmek için seri kan örnekleri almasına izin verir. Hayvan beyin ameliyatından iyileştikten sonra böyle bir kateter yerleştirmenizi öneririz, çünkü bu hayatta kalma oranını artırırken aynı zamanda uzun bir iyileşme süresinden neden olabilecek kateterin tıkanmasını önler.

6. Tetrodotoksin elleçleme ve çözümlerin hazırlanması

DİkKAT: TTX bilinen en toksik maddelerden biridir. İskelet kaslarına ve sinir dokusuna etki eder. Temas yoluyla zehirlenme olası değildir, ancak herhangi bir açık yara vücuda aşılama için potansiyel bir yoldur. TTX ile çalışırken temel endişeler, toksinle temas etmiş keskin aletlerle cildin delinmesi ve ağız, göz ve mukoza zarlarına ulaşabilecek aerosollerin üretilmesidir. Doza bağlı olarak, TTX teneffüs edilirse, yutulursa veya cilt tarafından aşılanırsa ölümcül olabilir. Gözlerin güçlü tahrişine neden olur. LD50 farelerde oral ve intravenöz uygulama ile test edilmiştir ve sırasıyla 334 μg / kg ve 7.3 μg / kg'dır. Şu anda antitoksin mevcut değildir.

NOT: inaktive edici madde, 0.25 N NaOH veya % 10 çamaşır suyu çözeltisi olan veya olmayan% 1.0 NaOCl'dir. Tam inaktivasyon 30 dk maruz kaldıktan sonra gerçekleşir. TTX, %10'un altındaki bir konsantrasyonda, otomatik olarak veya 500 °F'den düşük bir sıcaklıkta kuru ısı sterilizasyonu ile türetilen herhangi bir klorür tarafından tamamen inaktive edilemez. TTX ile ilgili tüm prosedürler, iç ve dış nitril eldiven, özel laboratuvar önlüğü, güvenlik gözlüğü, tek kullanımlık yüz maskesi, kapalı ayakkabı ve tam boy pantolon giyen iki bilgili kişi tarafından yapılmalıdır.

  1. Stok çözeltisinin hazırlanması
    1. Dökülme durumunda kirlenmeyi önlemek için duman kaputuna inaktive madde ile ıslatılmış bir ped yerleştirin. Başlamadan önce duman kaputunun düzgün çalıştığından emin olun. Pipet uçlarını atmak için inaktive çözeltisi ile bir kap hazırlayın.
    2. Steril TTX sitrat sitülize tozu, steril suni beyin omurilik sıvısı ile son derece dikkatli ve yavaş bir titrasyon ile üretici talimatlarına göre yeniden uygulayın ve işlem sırasında şişenin duvarlarını durulayın. Köpük ve aerosol oluşumundan kaçının. Canlı hayvanların beynine enjekte edildiğinden, TTX çözeltisinin kirlenmesini önlemek için aseptik bir teknik izleyin. TTX şişelerinizde aerosol oluşumunu önlemek için dış zar varsa mikropipette yerine iğneli şırınga kullanın.
    3. Stok çözeltisini steril mikro tüplere aliquot. Dondurma/çözme döngüleri moleküllerin stabilitesini değiştirebileceğinden, aliquotları mümkün olduğunca küçük hale getirin. Tüplerin yarısından fazlasını doldurmayın, çünkü su dondurulduğunda hacmi artar, bu da kapağın açılmasına ve tüpün ve kapta depolanan diğer numunelerin kirlenmesine neden olabilir.
    4. Tüplerin dışını ve TTX'in kullanıldığı yüzeyleri inaktivat maddesi ile arındırın. Tüpleri -20 °C'de ikincil bir kabın içindeki şişe kutusunda saklayın.
  2. Stok çözeltisini çalışma konsantrasyonuna seyreltme
    1. Seyreltilmiş çözeltiler daha az kararlı olduğundan, kullanılacakları gün taze seyreltilmiş çözeltiler hazırlayın. Duman kaputuna inaktivasyon maddesi ile ıslatılmış bir ped ve üzerine bir mikro tüp rafı yerleştirin. Pipet uçlarını atmak için inaktive çözeltisi ile bir kap hazırlayın.
    2. Stok çözeltisini steril bir mikrotüpün altına pipetleyin ve ardından 10 ng / μL konsantrasyon elde etmek için hesaplanan yapay beyin omurilik sıvısı miktarını ekleyin. TTX tozunun yeniden askıya alınması için açıklandığı gibi, şişenin duvarlarını durulayarak ve köpük ve aerosol oluşumunu önleyerek son derece dikkatli ve yavaş bir titrasyon gerçekleştirin.
    3. Dondurucuda bulunan numuneler mikroenjeksiyon için kullanılacaksa, deneyden önce en az bir saat oda sıcaklığında dengelenmelerine izin verilmelidir.

7. TTX veya araç çözümlerinin serbestçe hareket eden sıçanlara mikroenjeksiyon

  1. Mikroenjeksiyon pompasını deneye göre infüzyon oranı ve toplam enjeksiyon süresi ile yapılandırın. Hedef yapının kapladığı hacmi ve enjekte edilecek çözelti miktarını göz önünde bulundurarak bu parametreleri önceden hesaplayın. Bu deney için toplam 4 dakikalık bir infüzyon süresi için dakikada 50 nL hızında 200 nL çözelti enjekte edin.
  2. İki adet 10 μL Hamilton şırıngasını steril damıtılmış su ile doldurun, her mikroinjektörün boru konektörüne bir parça steril Teflon boru yerleştirin, boru uzunluğunun sıçanın hareketini kısıtlamamasını sağlayın (tüp etilen oksit kullanılarak sterilize edilebilir).
  3. İnaktive edici madde ve üzerine 2 cm x 2 cm kare parafin filmi ile ıslatılmış bir ped yerleştirin. Pipet enjektörün iğnesini ve filmin üzerindeki borunun 1 cm'sini doldurmak için yeterli miktarda TTX. Pistonu hafifçe geri çekerek TTX damlasını emin. Şırıngaları mikroenjeksiyon pompasına monte edin ve her mikroinjektörün ucunda bir damla TTX görülene kadar pistonu manipüle etmek için kontrollerini kullanın. Damlaları inaktive madde ile ıslatılmış ped içine atın.
  4. Mikroenjected olacak sıçanları seçin. Ameliyattan sonra sadece en az üç ardışık döngü gösteren sıçanları kullanın. Döngünün evresini ve günün saatini düşünün. Hem zaman hem de aşama, test edeceğiniz spesifik hipoteze bağlıdır, bu deney için 14:00 saat prosestrus seçilen, bu anda fason GnRH salgısını yöneten sinirsel preovülatör sinyaller meydana geldiğinden beri. Sıkıntıyı önlemek için enjeksiyonun kendi barınma kafeslerinin içinde gerçekleşeceği odaya taşıyın.
  5. Sıçanı sıkıca kavrayın, kapağı ve obturatörleri canüllerden çıkarın, mikroenjektörleri kılavuz damarlara yerleştirin ve hayvanı kafese geri koyun.
  6. Pompayı açın ve mikroenjeksiyon bitene kadar bekleyin. Mikroenjektörlerin olası bir kopuşlarını tespit etmek ve Teflon tüplerinin bükülmesini önlemek için bu süre zarfında hayvanı gözlemleyin.
  7. Çözeltinin reflüden kaçınmak için mikroenjektörleri iki dakika daha yerinde bırakın. Bunları çıkarın, implantın yüzeyini iodopovidon antiseptik çözeltisi ile temizleyin, kılavuz kanonların içindeki akışını önleyin. Steril obturatörler yerleştirin, kapağı takın ve hayvanı koloni odasına geri verin. İlacın olası yan etkilerini tespit etmek için hayvanı periyodik olarak gözlemleyin.
  8. Pompayı mikroenjeksiyon sırasındakiyle aynı parametrelerle açın ve işlem sırasında sistemin açıklığının korunup korunmadığını doğru bir akış olup olmadığını kontrol edin.
  9. Hava kabarcığı iğnenin ucuna ulaşana kadar TTX/aracı mikroenjektörden çıkarmak için pistona basın. TTX'i mikrotüpte hatırlayın. Şırınnayı damıtılmış suyla doldurun ve tüplerin içini temizlemek için kullanın. Suyu inaktive edici maddeye atın ve bu işlemi en az üç kez tekrarlayın. Şırıngaların, tüplerin ve mikroenjektörlerin dışını inaktivasyon maddesine batırılmış bir bezle temizleyin.

8. Ötenazi ve doku işleme

  1. Tahmin edilen veya vajinal olarak doğrulanan östrusun gününde, sıçana intraperitoneal aşırı doz sodyum pentobarbital (75 mg / kg) enjekte edin. Bilinç kaybını kontrol edin ve 7.1 ile 7.9 arasında açıklanan kılavuz ampuller aracılığıyla% 0.5 metilen mavi çözeltisinin 200 nL'sini enjekte edin. Parmak veya kuyruk kıstırma testini kullanarak ağrı belirtilerini kontrol edin ve hiçbiri tespit edilirse, kemirgen giyotini kullanarak sıçanın kafasını koparın.
  2. Karın boşluğunu açmak ve yumurtalıkları bulmak için makas kullanın. Her yumurtalığı kesmek için ince iris makası kullanın, bir büyüteç yardımıyla rahim-tubal kavşakta kesin. Yumurta kanalına zarar vermekten kaçının, çünkü bu oositlerin kaybına neden olacaktır.
  3. Yumurtalıkları stereomikroskop altına koyun ve organa zarar vermeden tüm yağ dokusunu çıkarmak için bir jilet kullanın. Ampulla bölgesinden mümkün olduğunca jiletle keserek her yumurtalıktan yumurtalığı çıkarın. Her yumurta kanalını farklı bir kaydıramaya monte edin ve bir damla su ile örtün. Yumurtalıkları Bouin'in çözeltisini içeren bir şişede saklayın.
  4. Yumurta kanallarını emici bir kağıt havlu ile hafifçe kurulayın ve stereomikroskop altında ampulla arayın. Baskın olmayan el ile ampulla uzak bir yere 23 G iğne ile sıkıştırarak yumurta kanalını yerinde tutun, ardından ampullanın orta bölgesinde 1 mm'lik bir kesi yapmak için baskın elde 23 G'lik bir iğne daha kullanın. Kümülüs-oosit kompleksleri kesiden viskoz sıvı damlası olarak çıkıntı yapacaktır(Şekil 2D). Damlayı yumurtalıktan yavaşça ve yavaşça çekmek için baskın eldeki iğneyi kullanın. İçinde oosit kalmadığından emin olmak için ampulla kalıntısına basın. Yumurta kanallarının çıkarılması oositleri geri döndürülemez bir şekilde içine hapsedeceğinden, yumurta kanallarından mümkün olduğunca hızlı bir şekilde oositleri çıkarın.
  5. Yumurta kanalını slayttan çıkarın ve oositleri içeren sıvı damlası kuruyana kadar bekleyin. Örneği hematoksilin-eosin ile lekele. Kapak kaplamak için montaj ortamını kullanın. Her yumurtalığın döktüğü oosit sayısını belirlemek için mikroskop altında (10x) gözlemleyin.
    NOT: Kardiyak perfüzyon ile kurban bu protokolde yapılmaz, çünkü oositler yumurtlamalarda sıkışıp kalacaktır ve bu nedenle yumurtlamayı değerlendirmek için histolojik yöntemler gerekli olacaktır. Kullanıcının diğer dokuları analiz etmek için perfuse yapması gerekiyorsa, önce yumurtalıklar çıkarılabilir ve inen arterler fiksatif sızıntıyı önlemek için karaciğerin altındaki kalın hemostatlarla kenetlenebilir.
  6. Başın derisini çıkarın ve kafatasını% 10 formalin çözeltisi ile bir cam kaba batırın. Dokunun bozulmasını önlemek için canülleri çıkarmadan önce başın en az on gün sabitlenmesine izin verin. Canül kaldırmak için, onu çevreleyen kafatası bölgesindeki tüm kasları ayırmak için makas kullanın. Burun ve frontal kemikler arasında kemik düzelticilerle kesin ve ardından oksipital kemiği çıkarın. Düzelticilerin ucunu foramen magnum'a yerleştirin ve burun kemiğinin kalıntısına ulaşan sagittal kretleri kesmeye başlayın.
  7. Kafatasının üst kısmının izole bölgesi ön ve parietal kemikleri içermelidir. Kafatasının tepesine takılan implante kanülü yavaşça dik olarak başa doğru çekerek çıkarın. Beynin deformasyonunu önlemek için menenjitlerin herhangi bir kısmını ince iris makası ile kesin.
  8. Menenjitlerde ön-arka kesim yapın ve beyni kafatasının tabanından çıkarmak için bir kenara koyun. Koku ampullerinin altına künt cımbız yerleştirin ve optik sinirler görünene kadar beyni hafifçe yukarı çekin. İnce iris makasıyla sinirleri kesin ve beyni çekin. Beyni fiksatif çözeltide koruyun.
  9. Bir vibratom kullanarak beynin 50 μm kalınlığında bölümlerini elde edin, poli-L-lizin kaplı slaytlara (damıtılmış suda% 0.1) monte edin ve Nissl tekniği ile lekeleyin. Bir sıçan beyin atlası27yardımıyla, kolayların son konumunu ( Şekil 2A-2C) ve boyanın yayılmasını belirlemek için mikroskop altındaki slaytları(10x)gözlemleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan protokol, tek bir TTX veya aracın (yapay beyin omurilik sıvısı) etkileri değerlendirilerek test edildi; ACSF) sıçanda yumurtlamanın düzenlenmesinde rol aldığı bilinen iki farklı çekirdeklerden birine mikroenjeksiyon: suprachiasmatic ve arcuate çekirdeği. Suprachiasmatic çekirdeği, memelilerde merkezi sirkadiyen kalp pilini içerdiğinden seçilmiştir. Gonadotropinlerin salgılanması olarak döngüsel olayların düzenlenmesinde rol oynar. Arcuate çekirdeği, östrous döngüsünün çoğunda GnRH salgısını uyaran estr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu makalede, uyanık ve sınırsız sıçanların beyninde herhangi bir zamanda ayrı bir bölgeyi geçici olarak devre dışı bırakma yöntemi açıklanmaktadır. Östrous döngülerini izlemek ve yumurtlamayı değerlendirmek için basit bir yöntem de sağlanır. Bu protokol, TTX ile tedavi edilen hayvanların yumurtlama sonuçlarını araç tarafından tedavi edilenlerinkiyle karşılaştırarak belirli beyin bölgelerinin yumurtlamayı yönlendiren mekanizmalara katkısının basit bir analizine izin verir. Nörobilim laboratuvarlarında yaygın olan stereota...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların bu makaleye göre açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Washington Üniversitesi'nden Raymond Sanchez'e el yazması düzenlemedeki değerli yardımları ve M.Sc Georgina Cortés ve M.Sc Cintia Javier'e bu tekniğin standartlaştırılmasındaki teknik destekleri için minnettarız. Ayrıca Facultad de Estudios Superiores Zaragoza: MVZ'deki veterinerlik hizmetleri üyelerine de minnettarız. Adriana Altamirano, MVZ. Roman Hernández ve MVZ. Dolores-Elizabeth Guzmán deney hayvanlarının mükemmel bakımı ve bakımı için. Bu protokolde açıklanan deneyler DGAPA-PAPIIT hibe numarası: IN216015 ve CONACyT hibe numarası: roberto Domínguez'e 236908 desteklendi. Carlos-Camilo Silva, Program de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) doktor öğrencisidir ve Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Hibe numarası: 294555) tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10 & mu; L Hamilton şırıngalarHamilton80314
21 G x 1 "paslanmaz çelik hipdermik iğneBD305165
23 G x 1" paslanmaz çelik hipdermik iğneBD305145
30 G x 1/2 "paslanmaz çelik hipdermik iğneBD305106
Yapay beyin omurilik sıvısıBASiMD-2400
Kemik düzelticiGüzel Bilim Araçları16152-12
Mikro matkap için çapakGüzel Bilim Araçları19007-05
ClipperWahl
Kesme diskiDremelSM5010
Kesme cımbızıTruper17367
Siyanokrilat yapıştırıcıKola lokaK-1
Diş çimentosuNic Tone
EnrofloxasinSenosiain
EosinSigmaE4009
EstereoscopeZeiss
Ekstra ince Bonn makasGüzel Bilim Araçları14084-08
Yüz maskesiLanceta HG60036
Graefe ForsepsGüzel Bilim Araçları11050-10
HematoksilinSigmaH3136
Kanama DurdurucularGüzel Bilim Araçları13008-12
Sıcak boncuk sterilizatörüGüzel Bilim Araçları18000-45
Hidroklorik asitSigma320331
Hipromeloz yapay gözyaşlarıSophia Labs8950015
IsofluranPisa Agropecuaria
MeloksikamAranda1183
Mikroenjeksiyon pompasıKD Scientific788380
MonomerNic Tone
MototoolDremel3000
Nitril eldivenLanceta HG69028
Yırtılmayan Kulak ÇubuklarıDavid Kopf Instruments855
Poli-L lizinSigmaP4707
Povidon-iyotDermo Dine
Sabunlu Povidon-iyotGermisin espuma
Basınçlı cımbızTruper17371
Sıçan anestezi maskesiDavid Kopf InstrumentsModel 906
Tuzlu su çözeltisiPISA
NeşterGüzel Bilim Araçları10004-13
Neşter bıçağıGüzel Bilim Araçları10015-00
Sodyum pentobarbitalPisa Agropecuaria
Standart elektrot tutucuDavid Kopf Instruments1770
Paslanmaz çelik telAmerikan Ortodonti856-612
Stereotaksik cihazDavid Kopf AletleriModel 900LS
Cerrahi SissorlarGüzel Bilim Araçları14001-12
Teflon konektörlerBasiMD-1510
Teflon boruBasiMF-5164
TetrodotoksinAlomone labsT-500
BuharlaştırıcıKent bilimselVetFlo

Kaynaklar

  1. Herbison, A. E. Control of puberty onset and fertility by gonadotropin-releasing hormone neurons. Nature Reviews Endocrinology. 12 (8), 452-466 (2016).
  2. Fink, G. Neuroendocrine Regulation of Pituitary Function. Neuroendocrinology in Physiology and Medicine. Conn, M., Freeman, E. , Springer Science Business Media. New York. 107-133 (2000).
  3. Herbison, A. E. The Gonadotropin-Releasing Hormone Pulse Generator. Endocrinology. 159 (11), 3723-3736 (2018).
  4. Morello, H., Taleisnik, S. Changes of the release of luteinizing hormone (LH) on the day of proestrus after lesions or stimulation of the raphe nuclei in rats. Brain Research. 360 (1-2), 311-317 (1985).
  5. Slusher, M. A., Critchlow, V. Effect of Midbrain Lesions on Ovulation and Adrenal Response to Stress in Female Rats. Experimental Biology and Medicine. 101 (3), 497-499 (1959).
  6. Sawyer, C. H., Haun, C. K., Hilliard, J., Radford, H. M., Kanematsu, S. Further Evidence for the Identity of Hypothalamic Areas Controlling Ovulation and Lactation in the Rabbit. Endocrinology. 73 (3), 338-344 (1963).
  7. Schiavi, R., Jutisz, M., Sakiz, E., Guillemin, R. Stimulation of Ovulation by Purified LH-Releasing Factor (LRF) in Animals Rendered Anovulatory by Hypothalamic Lesion. Experimental Biology and Medicine. 114 (2), 426-429 (1963).
  8. Bagga, N., Chhina, G. S., Mohan Kumar, V., Singh, B. Cholinergic activation of medial preoptic area by amygdala for ovulation in rat. Physiology & Behavior. 32 (1), 45-48 (1984).
  9. Barraclough, C. A., Yrarrazaval, S., Hatton, R. A Possible Hypothalamic Site of Action of Progesterone in the Facilitation of Ovulation in the Rat. Endocrinology. 75 (6), 838-845 (1964).
  10. Critchlow, V. Blockade of ovulation in the rat by mesencephalic lesions 1, 2. Endocrinology. 63 (5), 596-610 (1958).
  11. Terasawa, E., Wiegand, S. J. Effects of Hypothalamic Deafferentation on Ovulation and Estrous Cyclicity in the Female Guinea Pig. Neuroendocrinology. 26 (4), 229-248 (1978).
  12. Halász, B., Köves, K., Molnár, J. Neural control of ovulation. Human Reproduction. 3 (1), 33-37 (1988).
  13. Narahashi, T. Pharmacology of tetrodotoxin. Journal of Toxicology: Toxin Reviews. 20 (1), 67-84 (2001).
  14. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. Tetrodotoxin blockage of sodium conductance increase in lobster giant axons. The Journal of General Physiology. 47 (5), 965-974 (1964).
  15. Narahashi, T., Deguchi, T., Urakawa, N., Ohkubo, Y. Stabilization and rectification of muscle fiber membrane by tetrodotoxin. American Journal of Physiology-Legacy Content. 198 (5), 934-938 (1960).
  16. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiological Reviews. 54 (4), 813-889 (1974).
  17. Ritchie, J. M., Rogart, R. B. The binding of saxitoxin and tetrodotoxin to excitable tissue. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 79 (1), 1-50 (1977).
  18. Bermudez-Rattoni, F., Introini-Collison, I. B., McGaugh, J. L. Reversible inactivation of the insular cortex by tetrodotoxin produces retrograde and anterograde amnesia for inhibitory avoidance and spatial learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5379-5382 (1991).
  19. Tang, X., Yang, L., Liu, X., Sanford, L. D. Influence of Tetrodotoxin Inactivation of the Central Nucleus of the Amygdala on Sleep and Arousal. Sleep. 28 (8), 923-930 (2005).
  20. Klement, D., Pašt’alková, E., Fenton, A. A. Tetrodotoxin infusions into the dorsal hippocampus block non-locomotor place recognition. Hippocampus. 15 (4), 460-471 (2005).
  21. Conejo, N. M., Cimadevilla, J. M., González-Pardo, H., Méndez-Couz, M., Arias, J. L. Hippocampal Inactivation with TTX Impairs Long-Term Spatial Memory Retrieval and Modifies Brain Metabolic Activity. PLoS ONE. 8 (5), 64749(2013).
  22. Grimm, J., Ronald, E. Dissociation of Primary and Secondary Reward-Relevant Limbic Nuclei in an Animal Model of Relapse. Neuropsychopharmacology. 22 (5), 473-479 (2000).
  23. Hasegawa, H., et al. Inhibition of the preoptic area and anterior hypothalamus by tetrodotoxin alters thermoregulatory functions in exercising rats. Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1458-1462 (2005).
  24. Meyer, F., Louilot, A. Early Prefrontal Functional Blockade in Rats Results in Schizophrenia-Related Anomalies in Behavior and Dopamine. Neuropsychopharmacology. 37 (10), 2233-2243 (2012).
  25. Rothfeld, J. M., Harlan, R. E., Shivers, B. D. Reversible disruption of lordosis via midbrain infusions of procaine and tetrodotoxin. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 25 (4), 857-863 (1986).
  26. Silva, C., Cortés, G. D., Javier, C. Y., Flores, A., Domínguez, R. A neural circadian signal essential for ovulation is generated in the suprachiasmatic nucleus during each stage of the estrous cycle. Experimental Physiology. , (2019).
  27. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (7th Ed). , Academic Press. California. (2014).
  28. Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
  29. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS ONE. 7 (4), 35538(2012).
  30. Wirtshafter, D., Asin, K., Kent, E. W. Simple technique for midline stereotaxic surgery in the rat. Physiology & Behavior. 23 (1), 409-410 (1979).
  31. Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
  32. Kazim, S. F., Enam, S. A., Shamim, M. S. Possible detrimental effects of neurosurgical irrigation fluids on neural tissue: An evidence based analysis of various irrigants used in contemporary neurosurgical practice. International Journal of Surgery. 8 (8), 586-590 (2010).
  33. Miyajima, M., et al. Role of cerebrospinal fluid as perfusate in neuroendoscopic surgery: A basic investigation. Acta Neurochirurgica. 113, 103-107 (2012).
  34. Mori, K., et al. Potential risk of artificial cerebrospinal fluid solution without magnesium ion for cerebral irrigation and perfusion in neurosurgical practice. Neurologia Medico-Chirurgica. 53 (9), 596-600 (2013).
  35. Oka, K., Yamamoto, M., Nonaka, T., Tomonaga, M. The significance of artificial cerebrospinal fluid as perfusate and endoneurosurgery. Neurosurgery. 38 (4), (1996).
  36. James, T. A., Starr, M. S. Effects of the rate and volume of injection on the pharmacological response elicited by intraingral microapplication of drugs in the rat. Journal of Pharmacological Methods. 1 (3), 197-202 (1978).
  37. Freund, N., Manns, M., Rose, J. A method for the evaluation of intracranial tetrodotoxin injections. Journal of Neuroscience Methods. 186 (1), 25-28 (2010).
  38. Zhuravin, I. A., Bures, J. Extent of the tetrodotoxin induced blockade examined by pupillary paralysis elicited by intracerebral injection of the drug. Experimental Brain Research. 83 (3), 687-690 (1991).
  39. Myers, R. Injection of solutions into cerebral tissue: relation between volume and diffusion. Physiology and Behavior. 1 (2), 171-174 (1966).
  40. Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal of Visualized Experiments. (46), e2082(2010).
  41. McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. J Neuroimmunol. 194 (1-2), 27-33 (2008).
  42. Cunningham, M. G., O'Connor, R. P., Wong, S. E. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of VisualizedExperiments. (13), e716(2008).
  43. Akinori, A., Masamichi, S., Hiroshi, T. A new device for microinjection of drugs into the lower brain stem of conscious rats: Studies on site of action of morphine. Journal of Pharmacological Methods. 2 (4), 371-378 (1979).
  44. Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
  45. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  46. de Sousa, A. F., et al. Optogenetic reactivation of memory ensembles in the retrosplenial cortex induces systems consolidation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences. 116 (17), 8576-8581 (2019).
  47. Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Beyin Bölgesi İnaktivasyonuÖstrus Döngüsü DeğerlendirmesiOvülasyon DüzenlemesiStereotaksik İmplantasyonKılavuz KanüllerGeri Döndürülebilir Nöral BlokajSıçan Beyin ÇekirdekleriÖstrus Döngüsü EvreleriNöral Devre Haritalama
Tetrodotoksin Mikroenjeksiyonları ile Ters İnaktivasyon Yoluyla Yumurtlamanın Düzenlenmesinde Sıçan Beyninin Ayrık Alanlarının Rolünün Çözülmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.