Bu protokol, floresan aktive hücre sıralama (FACS) için osteosit hazırlığına ek olarak, yenidoğan dmp1-topaz fare kalvarisinin diseksiyonunu ve yeşil floresan proteinini hücre sindirimi ve fraksiyonasyonu yoluyla eksprese eden osteositlerin izolasyonunu açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
GFP eksprese eden osteositlerin murin kalvarial fraksiyonasyonu yoluyla primer osteositlerin elde edilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Bir zamanlar mekanik yüklemeyi algılamanın sahne arkası işlevi göz önüne alındığında kemiğin pasif bir sakini olduğu düşünülen osteosit, şimdi spot ışığına çıkarılmıştır ve hücre dışı matrisi aktif olarak modifiye etmek ve uzak bölgelere mesaj gönderen lakunokanaliküler sistemle endokrin bir organ oluşturmak gibi birçok önemli fonksiyona sahip olduğu gösterilmiştir. Osteositi in vitro olarak primer osteositlerin izole edilmesinden osteosit benzeri hücre hatlarına kadar test etmeyi mümkün kılan yöntemler sayesinde, osteositler şimdi yankılanan bir ilgi ve yapı ve işlev hakkında bilgi artışı yaşamaktadır. Osteosit biyolojisinin birçok yönü ve diğer moleküler bileşenlerle etkileşimi henüz keşfedilmemiştir. Bu protokolde, osteositlerdeki yeşil floresan proteinini eksprese eden dmp1-topaz yenidoğan fare kalvarisinden primer osteositlerin hücre fraksiyonasyonu yoluyla ve daha sonra FACS ile primer osteosit kültürlerinin elde edilmesi yoluyla etkili izolasyonunu ayrıntılı olarak açıklayacağız.
Giriş
Osteositler, salgılanan matriks1'e gömülmüş osteoblastik progenitörlerden terminal olarak farklılaşmış hücrelerdir. Kemik hücresi popülasyonları arasında en bol ve en uzun yaşayan hücrelerdir. Lakunalar içinde bulunurlar ve kanalikül adı verilen kanallar boyunca uzanan dendritlerle karakteristik bir yıldız morfolojisine sahiptirler ve çevrelerindeki çevre ve kemik yüzeyi2 ile geniş bir iletişim ve metabolik değişim ağı oluştururlar. Osteositler hem osteoblastların hem de osteoklastların kemik yeniden şekillenmesindeki rollerini koreografi yaparlar, mekanik yükleme3'e adaptasyon sağlayan birincil m....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan prosedürleri ve hayvan bakımı, Tohoku Üniversitesi kural ve yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Yenidoğan dmp1-topaz fare calvaria'nın diseksiyonu
- Bu protokol için, C57BL / 6-Tg (Dmp1-Topaz) 1Ikal / J farelerinin 6\u20127 günlük yavrularını kullanın. Fareleri% 5 izofluran inhalasyonu ile ötenazi yapın ve daha sonra yavruları% 70 etanol'e aktarın.
- Ötanazi yapılan yavruyu tedavi edilmemiş bir kültür kabına aktarın.
- Makas ve cımbız kullanarak, kafatasının tabanındaki cildi tutun ve bir kesi yapın.
- İlk insizyonu başlangıç noktası olarak kullanarak, kafatasının her iki lateral....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokolün amacı, kalsiyum şelasyonu için kollajen matriksini ve EDTA'yı parçalamak için kollajenaz kullanan bir fraksiyonasyon işlemi yoluyla dmp1-topaz yenidoğan fare kalvarisinden primer osteosit kültürlerinin elde edilmesi sürecini göstermektir, bundan sonra hücreler FACS'ın osteositleri diğer hücre popülasyonlarından ayırması için hazırlanır.
Yenidoğan fare kalvarisinden primer osteositler elde etme yöntemleri genellikle23'ü sıralamak için fraksiyonların (1\u201.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
İlk izole osteosit, (OB7.3) veya PHEX'in kuş düşmanı varyantı kullanılarak izole edilen bir tavuk calvaria 7'dendi; Bununla birlikte, bu yöntem, uygulanabilir antikorların mevcudiyeti ile sınırlıdır, çünkü aynı zamanda türe özgü olan osteosit spesifik antikorların üretilmesi gerekir. Araştırmacılar, fare ve sıçan uzun kemiklerinden osteositler elde etmek için sıralı enzimatik işlemin farklı bir modifikasyonunu kullandılar; Bu kültürlerin bildirilen saflığı yaklaşık% 70 olarak bel.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma kısmen, Japonya Bilimi Geliştirme Derneği'nden bir JSPS KAKENHI hibesi ile desteklenmiştir (No. 19K10397'den H.K.'ye ve No. 18K09862'den I.M.'ye).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| BD FACSDiva yazılımı | BD Biosciences | Veri toplama ve analizi | |
| BD Falcon Tube | BD Biosciences | 352235 | 12 x 75 mm Hücre Süzgeç Kapaklı Tüp, 35 & mu; m naylon ağ. |
| Sığır serum albümini (BSA) | Sigma-Aldrich, MO, ABD | ||
| Kollajenaz | Wako, Osaka, Japonya | 034-22363 | % 0.2 (a/h), C. histolyticum'dan elde edilen ham kollajenaz karışımı. |
| EDTA | Dojindo, Kumamoto, Japonya | %0.1 BSA | |
| FACSAriaTM II | BD Biosciences | ||
| Fetal sığır serumu (FBS) | Biowest, Nuaillé, Fransa | ||
| İzolasyon tamponu | 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, %0.1 (a/h) BSA, %0.5 (a/h) glikoz ve 25 mM HEPES | ||
| Millex Steril Filtre Ünitesi | Merck Millipore, İrlanda | SLGV033RS | 0.22μ m |
| Naylon hücre süzgeci | FALCON, NY, ABD | 40μ m | |
| Tripsin-EDTA | Yaşam Teknolojileri, NY, ABD | %0,5 x10. PBS | |
| &alfa;-MEM | Wako, Osaka, Japonya'da | %10 fetal sığır serumu, 100 IU/ml penisilin G ve 100 &mu içeren; g/ml streptomisin |
Kaynaklar
- Manolagas, S. C. Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis. Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).
- Bonewald, L. F. Osteocy....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
