Tamamlayıcı Pıhtı Karakterizasyonu için Bulanıklık ve Tromboelastografiden Yararlanma

Summary

Fibrin hemostaz ve tromboz sırasında pıhtı oluşumundan sorumludur. Bulanıklık tahlilleri ve tromboelastograhy (TEG) bir pıhtı tamamlayıcı değerlendirme sağlayan sinerjik araçlar olarak kullanılabilir. Bu iki teknik birlikte pıhtılaşma koşulları fibrin pıhtı oluşumunu nasıl etkilediği hakkında daha fazla fikir verebilir.

Abstract

Tromboz dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir. Fibrin(ojen) öncelikle pıhtı oluşumu veya tromboz sorumlu proteindir. Bu nedenle fibrin pıhtı oluşumunu karakterize etmek tromboz çalışmasında faydalıdır. Bulanıklık ve tromboelastografi (TEG) pıhtı oluşumunu izlemek için in vitro tahlillerde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bulanıklık, ışık iletimini bir spektrometre ile fibrin pıhtı yapısı üzerinden dinamik olarak ölçer ve genellikle araştırma laboratuvarlarında kullanılır. TEG, kan pıhtısı mukavemetini doğrudan ölçen ve öncelikle hastaların hemostazlarını değerlendirmek için klinik ortamlarda kullanılan özel bir viskoelastik tekniktir. Bu iki alet yardımıyla, bu çalışmada basitleştirilmiş fibrinojen/trombin pıhtısı modeli kullanılarak in vitro fibrin pıhtısını karakterize etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Her iki teknik genelinde veri eğilimleri çeşitli pıhtılaşma koşulları altında karşılaştırıldı. Bu çalışmada, büyükbaş hayvan pıhtılaşma faktörleri genellikle klinik ve araştırma ortamlarında insan pıhtılaşma faktörlerinin yerine kullanıldığından, insan ve büyükbaş fibrin pıhtıları yan yana oluşmuştur. Sonuçlar, TEG ve bulanıklığın pıhtı oluşumunu iki farklı yöntemle izlediğini ve birlikte kullanıldıklarında farklı pıhtılaşma koşullarında tamamlayıcı pıhtı mukavemeti ve fiber yapısal bilgi sağladığını göstermektedir.

Introduction

Tromboz, vücutta kan dolaşımını engelleyen ve dünya çapında yüksek morbidite ve mortaliteye yol açan bir kan pıhtısının patolojik oluşumudur. Her yıl 1000 kişi başına 1-2 venöz tromboemboli olgusu ve 2-3 tromboza bağlı vasküler hastalıklar olgusu vardır^1,2. Burada çeşitli pıhtılaşma koşullarında pıhtı oluşumunu izlemek için tromboelastografi (TEG) ve bulanıklığı kullanma yöntemi sunulmuştur. Fibrin(ojen) vücutta pıhtı oluşumundan sorumlu birincil proteindir. Pıhtılaşma kaskad son adımlarında, fibrinopeptidler pıhtı geliştikçe çözünmez fibrin monomerlerin polimerizasyon unu başlatan trombin tarafından fibrinojen den ayrılır^3,4. Patolojik trombozda pıhtı oluşumunu anlamak için çeşitli pıhtılaşma koşullarında fibrin oluşumunu karakterize etmek gerekir. İn vitro fibrin pıhtı oluşumunu incelemek için çoklu pıhtı izleme tsays kullanılmıştır. Protrombin zamanı (PT/INR) ve aktive parsiyel tromboplastin zamanı (aPTT) belirli bir pıhtılaşma yolunun bütünlüğünü ölçen iki ortak klinik tahlildir. Ancak, fiziksel pıhtı özellikleri⁵hiçbir belirti veren tek değişken olarak zaman kullanın. Elektron mikroskobu tamamen oluşmuş bir fibrin pıhtısının mikro-yapısının görüntülenmesine izin verir ancak pıhtı oluşturma işlemi hakkında bilgi vermez⁶. Tüm tahliller arasında bulanıklık tahlilleri ve TEG, pıhtı özelliklerini zaman içinde dinamik olarak takip etme olanağı sunar. Bu teknikler kapsamlı pıhtılaşma profillerinin ölçülmesini sağlar ve bu nedenle, diğer fibrin pıhtı karakterizasyon araçları üzerinde bazı yarar sağlar.

Özellikle, bulanıklık tahlilleri (veya pıhtı turbidimetrisi) basit uygulaması ve araştırma laboratuvarlarında spektrometrelerin geniş erişilebilirliği nedeniyle araştırma ve klinik uygulamalar için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu töz, tanımlanmış bir dalga boyunda (en sık 350 – 700 nm aralığında bir dalga boyunda)⁷tek tek tekrarlayan okumalar alarak bir şekillendirme pıhtısı ile ışık iletimi dinamik bir ölçüm sağlar. Okuma odasındaki sıcaklık da ayarlanabilir. Fibrin jel formları gibi, protein ağı üzerinden seyahat ışık miktarı zaman içinde absorbance bir artışa neden azalır. Benzer şekilde, pıhtı ağı bozulduğunda emme azalır. Bulanıklık tahlilleri, hem 96 hem de 384 plakalı yüksek iş elde numune taraması için çok kuyulu plaka biçimi kullanılarak kolayca çok yönlü olarak katlanabilir. Çeşitli pıhtı özellikleri bir bulanıklık izleme eğrisi (zaman ölçümü içinde absorbe) türetilebilir: maksimum bulanıklık, maksimum bulanıklık için zaman, pıhtı başlangıçlı zaman, ve pıhtı oluşum hızı (Vmax). Bir fibrin lif kütlesi / uzunluk oranı da fibrin lif kalınlığı⁸,^9,,10tahmin ham bulanıklık verileri elde edilebilir.

TEG öncelikle hastaların hemostaz ve pıhtı iliklerini değerlendirmek için klinik ortamda kullanılmaktadır. Ayrıca yaygın anti-fibrinolitik ilaçlar veya hemostatik kan ürünleri^,11,12uygulanmalıdır belirlemek için cerrahi uygulamalarda kullanılır. Pıhtı oluşumu, bir TEG bardağının içinde, tözün başlamasından önce tüm pıhtılaşma bileşenlerinin bardağa eklenmesiyle oluşur. Gelişen pıhtıya sahip bardak, fiziksel olarak merkezine yerleştirilen bir iğneye karşı döner ve elektromekanik burulma sensörü pıhtının artan viskoelastik gücünü ölçer. Bu test genellikle 37 °C fizyolojik sıcaklıkta yapılır; ancak, sıcaklık cihaz üzerinde manuel olarak ayarlanabilir. Maksimum genlik (MA), reaksiyon hızı (R), kinetik zaman (K), α-açı (Açı) ve maksimum genlik (TMA) için zaman dinamik TEG izleme DEN TEG yazılımı tarafından ayıklanır. Bu değerler genellikle hastanın pıhtılaşma durumunu değerlendirmek için klinik normal aralıklarla karşılaştırılır. TEG tam olarak bir viskometre birimi olmamakla birlikte, milimetre ünitelerinde pıhtı mukavemetini ölçtürünce, hekimlerin spesifik kan ürünlerini yönetmeye karar vermeleri ve terapötik dozlamayı ayarlamaları için değerli bir klinik karar verme aracı olarak önemli viskoelastik pıhtı verileri ve işlevleri ni sağlar¹³. Hem TEG hem de bulanıklık tahlilleri birlikte kullanıldıklarında, pıhtı mukavemeti ve kinetikte TEG'den kolayca çıkarılabildiği ve fibrin lif kalınlığına optik bulanıklık ölçümleri ile ulaşılabildiği için tamamlayıcı pıhtı karakterizasyonu bilgileri sağlarlar.

Fibrin bir kan pıhtısı kritik bir bileşeni olduğu gibi, farklı pıhtı oluşumu koşulları altında fibrin pıhtı karakterizasyonu belirli bir değişken pıhtı oluşum süreci ve nihai pıhtı özellikleri katkıda nasıl değerli bir fikir sağlayabilir. Bunu anlamak tromboz tanısı ve terapötik gelişimi için rehberlik sağlayabilir. Daha temsili bir fibrin pıhtı karakterizasyonu elde etmek için, plazma basitleştirilmiş fibrinojen/trombin model sisteminden daha yakından in vivo pıhtılaşma koşullarına benzediği için pıhtı oluşumunu izlemek için ikame edilebilir. Ancak, pıhtılaşma kaskad karmaşık doğası nedeniyle, plazma kullanarak pıhtı oluşumu karmaşıklığı ekler, daha zor bireysel faktörlerin etkisini izole etmek için yapım. Basitleştirilmiş bir fibrinojen/trombin modelinin kullanılması, son fibrin oluşum adımının izolasyona izin vererek pıhtılaşma kaskadlarının tamamının başlatılması ihtiyacını önler. İki ana fibrin oluşturan bileşenleri (fibrinojen ve trombin) dahil ederek, bu kurulum son derece kontrollü bir pıhtı oluşumu durumu oluşturur. Basitleştirilmiş pıhtı modeli burada kullanılırken, bu protokolün ek pıhtılaşma faktörleri de dahil edilerek daha karmaşık pıhtıları karakterize etmek için de kullanılabileceğini belirtmek önemlidir. Bu çalışmada, bulanıklık ve TEG kullanılarak fibrin pıhtı karakterizasyonu fibrinojen ve trombin konsantrasyonları, iyonik mukavemet, pH ve pıhtılaşma çözeltisinde toplam protein konsantrasyonu ile farklı in vivo pıhtılaşma durumlarını taklit etmek için¹⁴. Protokoldeki bu varyasyonlarla ilgili ayrıntılar Bölüm 5'te yer almaktadır.

Protocol

1. Fosfat tamponsal salin (PBS) hazırlanması

NOT: PBS bu çalışma boyunca kalsiyum ilavesi gerektirmediği için tanımlanmış tahliller kullanılmıştır. Sitrik kan ürünlerini yeniden kalsifiye etmek için kullanılan kalsiyum eklerken, kalsiyumun fosfat tamponlarında çökeltisi bilindiği için PBS'den kaçınılması gerektiği unutulmamalıdır.

1. 137 mM sodyum klorür, 1,8 mM potasyum fosfat monobasic, 10 mM sodyum fosfat dibazik ve 2,7 mM POTASYUM klorür DI suda karıştırılarak 0,01 M, pH 7,4 PBS tampon yapın.
2. Bir pH probu kullanarak tampon pH'ı doğrulayın ve gerektiğinde sodyum hidroksit veya hidroklorik asit kullanarak pH'ı ayarlayın.
3. Fibrinojen ve pıhtılaşma tahlillerinin hazırlanması için bu PBS'yi kullanın (aksi belirtilmedikçe).
   NOT: Di suyundaki rehidrasyon 37 °C'de bile fibrinojen çöküntüile sonuçlabildiği için tamponun fibrinojen tozunu yeniden oluşturması önerilmektedir.

2. Proteinlerin hazırlanması ve depolanması

NOT: Protokol boyunca protein stok konsantrasyonları, son pıhtılaşma çözeltilerinde tuz, DI suyu, PBS ve diğer artık faktörlerin tutarlı bir şekilde oranını sağlamak için bulanıklık ve TEG için farklı konsantrasyonlarda hazırlanır.

1. Fibrinojenin hazırlanması ve depolanması
   NOT: Ticari olarak mevcut fibrinojende bulunan kirleticiler arasında önemli miktarda faktör XIII, diğer pıhtılaşma faktörleri, depolama tamponu ve tuzlar sayılabilir. Kalsiyum varlığında, faktör XIII fibrin pıhtı ağı çapraz bağlantı bilinmektedir. Bu etki sıkılaştırılmış pıhtı yapısına ve fibrin karakterizasyonunu etkileyen gelişmiş pıhtı gücüne katkıda bulunur. Ticari olarak kullanılabilir etkinlik kitleri aktif faktör XIIIa düzeylerini belirlemek için kullanılabilir. Faktör XIIIa'nın neden olduğu değişkenliği en aza indirmek için, deneyler kalsiyum hariç tutularak tasarlanmalı veya faktör XIIIa'yı ortadan kaldırmak için ek adımlar bu protokole dahil edilmelidir. Buna ek olarak, protein depolama tuzu ve tampon tipi değerlendirilmeli ve gerekirse diyaliz tercih edilen bir tedavi çalışma tampon una aktarılabilir.
   1. 2 mL tüplerde 2 mL tüplerde tüp başına 20 mg protein ve -20 °C'de 6 aya kadar aliquots saklayın ve lyophilized fibrinojen tozu (sığır veya insan) tartın ve aliquots.
   2. Deney günü 10 dakika boyunca RT'ye (oda sıcaklığında) uyum sağlamasına izin verin. Kullanmadan önce aliquot 20 dk'ya 600 μL PBS ekleyerek fibrinojeni yeniden oluşturun.
   3. 10 μL fibrinojen alın ve UV saydam 96-well plaka veya bir cuvette 190 μL PBS ile seyreltin. Ticari bir spektrometre ve yazılımı ile 280 nm'de absorbans alarak fibrinojen konsantrasyonunu belirleyin.
   4. Bira yasasını kullanarak fibrinojen konsantrasyonu (mg/mL) hesaplayın. PBS ile daha fazla seyreltme (aksi belirtilmedikçe) 12 mg/mL (bulanıklık tahlilleri için) ve 3.2 mg/mL (TEG için) fibrinojen stok çözeltileri hazırlayın.
      NOT: Bira kanununa göre fibrinojen konsantrasyontisi tayini (mg/mL) :
      
      Molar tükenme katsayısı: 513.400 L mol^-1 cm^-1 280 nm; Yol uzunluğu (L); Seyreltme faktörü (D); Molekül Ağırlığı (MW) = 340.000 Da. E^0.1% = 1.51 (280 nm) (tedarikçi tarafından verilen yok olma katsayısı) mw ile çarpılarak elde edilir.
2. Trombin hazırlanması ve depolanması
   1. 200 μL deiyonize (DI) suda 200 μL 5000 U/mL trombin stok çözeltisi yapmak için liyofilize trombin (büyükbaş veya insan, 1000 U stok) yeniden oluşturma.
   2. Çözeltinin 5 μL (20 U/tüp) aliquots olun ve −20 °C'de dondurulmuş aliquots tutun.
   3. Deney günü 15 dakika boyunca RT'de trombin aliquots çözülme ve bulanıklık tahlilleri için 20 U/mL ve DI su ile TEG için 18 U/ mL seyrelterek trombin çalışma çözeltisi yapmak (aksi belirtilmedikçe).
      NOT: Erime ve kullanım sırasında buz üzerindeki enzimlerin korunması ile gerçeklenebilen enzim aktivitesini korumak için önlemler alınmalıdır; ancak RT'de erimeden sonra doğrudan kullanıldığında trombin aktivitesinde azalma gözlenmemiştir.

3. Bulanıklık

1. 350 - 700 nm emme aralığına ve zaman içinde pıhtı bulanıklığını izlemek için ilgili bir yazılıma sahip herhangi bir ticari spektrometre kullanın (Bkz. Malzeme Tablosu).
2. Spektrometreyi açın ve ilgili analiz yazılımını açın.
3. Plaka 1'i seçin ve plaka ayarları sekmesini açın. Zaman içinde dinamik bir emici okuma izlemek için ABS modu ve Kinetik'i tıklatın.
4. Dalga boyu sekmesinde 550 nm (veya 350 - 700 nm aralığındaki herhangi bir değer) seçin ve toplam çalışma süresini zamanlama sekmesinde 30 s aralıkla 60 dk olarak ayarlayın. Kuyuları vurgulayarak okumak için ilgi kuyuları seçin. Gerekirse diğer ayarları ayarlayın.
   NOT: Aralığın alt ucunda (yaklaşık 350 nm) bir dalga boyu seçilmesi daha iyi bir hassasiyet getirir ancak absorbans da spektrometrenin algılama sınırını aşabilir. Bulanıklık ölçümü için en sık kullanılan dalga boyu literatürde 405 nm'dir; ancak, bu protokol dinamik bulanıklık değerlerinin tüm denemeler için algılama sınırı içinde olduğundan emin olmak için 550 nm kullanır. Seçilen okuma aralığı, en yüksek düzeyde ki istinat hassasiyetine ulaşmak için mümkün olduğunca kısa olmalıdır. Bu spektrometre ve belirli bir tsurça sırasında okunan kuyuların sayısına bağlıdır.
5. UV şeffaf 96-iyi plaka alın. Pipet 140 μL PBS okumak için seçilen bir kuyuda. Kuyuya 10 μL (20 U/mL) trombin ekleyin ve karıştırın.
   NOT: Kuyu yüzeyine nonspesifik protein bağlanmasını en aza indirmek için yüksek bağlayıcı lı elekt plakaları kullanmayın. Bu çözeltide protein dağılımını etkileyebilir ve yüksek asit değişkenliği ile sonuçlanabilir.
6. Kuyuya 50 μL fibrinojen (12 mg/mL) ekleyerek pıhtılaşmayı hemen başlatArak 3 mg/mL fibrinojen ve 1 U/mL trombin konsantrasyonu olan 200 μL'lik bir pıhtılaşma solüsyonu elde edin. Onlar ışık saçılma tarafından emicietkisi olacak gibi çözeltide kabarcıklar oluşturulmasını önlemek için özen alarak beş kez yukarı ve aşağı boru ile kuyuda içeriğini karıştırın.
   NOT: Aynı plaka üzerinde aynı anda birden fazla pıhtı örneği çalıştırırken çok kanallı bir pipet kullanın. Pıhtılaşma sürelerini dengelemek için kuyular arasındaki zaman farklarını ve enstrümanTarafından ilk okunan zaman dilimini kaydedin.
7. 96 kuyulu plakayı tutucuya yerleştirin ve RT'de bulanıklık okumaya başlamak için yazılımda Başlat'ı tıklatın.
   NOT: Eğer yüksek bir sıcaklıkta titreci gerçekleştiriyorsa, pıhtı başlangıcından önce spektrometre, plaka ve reaktifler istenilen sıcaklıkta muhafaza edilmelidir.
8. Tamamlandıktan sonra, bulanıklık verilerini alın ve bir çizim yazılımında zaman içinde emicilik değişimini çizerek bulanıklık izleme eğrisi elde edin.
9. Turb^Max Türetin (fibrin lif kalınlığı ve fibrin ağ yoğunluğu nun maksimum bulanıklık göstergesi) zaman içinde eğrinin maksimum emici değerini alarak.
   NOT: Fibrin elyaf kütle/uzunluk oranı aşağıdaki^yazı8'de verilen denklem kullanılarak bulanıklık değerlerinden hesaplanabilir.
10. Turb^Max'i
    

3. 
   
5. 
   
8. 
   

Results

Şekil 1'de gösterilen deneyler, farklı fibrinojen düzeylerinde insan ve büyükbaş fibrin pıhtılarının temsili bulanıklık izleme eğrileridir. Farklı fibrinojen düzeylerinde fibrin pıhtı oluşumu için temsilci TEG izleme eğrileri Şekil 2'degösterilmiştir . Her iki izleme eğrisi pıhtı inisiyasyonu ndan sonraki bir gecikme döneminden sonra pıhtı bulanıklığının veya pıhtı genliğinin zamanla arttığını ve pıhtı oluşumunun sonunda ki seviyelerinin arttığını göstermektedir...

Discussion

Bu protokol, basitleştirilmiş bir fibrinojen/trombin pıhtı modelini ticari olarak kullanılabilen bileşenler kullanılarak test eden iki farklı pıhtı karakterizasyon aracının kullanımını göstermektedir. Hem TEG hem de bulanıklık tahlillerinin yapılması kolaydır. Max pıhtı oluşumu (Turb^Max ve TEG^Max)ve pıhtı oluşum süreleri (Turb^Time ve TEG^Time)gibi uç nokta pıhtı muayenelerini sağlamakla kalmıyor, aynı zamanda dinamik pıhtı şekillendirme sürecini de değerlendiriyorlar. Bu da TEG ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Kuyulu Şeffaf Düz Tabanlı UV Şeffaf Mikroplaka	Corning	3635	İşlem görmemiş akrilik kopolimer,
insan serumu	Millipore Sigma	A1653	; % 96, liyofilize toz
Arium Mini Plus Ultra saf Su Sistemi	Sartorius	NA	DI su kaynağı
Sığır serum albümini	Millipore Sigma	A2153	≥ % 96, liyofilize toz
TEG 5000 için Tek Kullanımlık Bardaklar ve Pimler (Şeffaf)	Hematetik	REF 6211
Fibrinojen, Sığır Plazma	Millipore Sigma	341573	%95'ten fazla pıhtılaşabilir protein içerir
Fibrinojen, Pzminojen tükenmiş, İnsan Plazma	Milipor Sigma	341578	%95 pıhtılaşabilir protein içerir&ge.
Fosfat tamponlu tuzlu su	Millipore Sigma	P3813	Toz, pH 7.4, 1 L çözelti hazırlamak için
Potasyum klorür	Millipore Sigma	60130	≥ % 99,5 saflıkta
Potasyum fosfat monobazik	Millipore Sigma	P9791	& ge; %98 saflık
SevenEasy pH Metre	Mettler Toledo	S20
Sodyum klorür	Millipore Sigma	71378	≥ % 99,5 saflıkta
Sodyum fosfat dibazik	Millipore Sigma	71636	& ge; % 99,5 saflıkta
SpectraMax M5 çok algılamalı mikroplaka okuyucu sistemi	Moleküler Cihazlar	M5
TEG 5000 Trombostograf Hemostaz analizör sistemi	Hematetik	07-022
Trombin, Sığır	Millipor Sigma	605157
Trombin, İnsan Plazması, Yüksek Aktiviteli	Millipor Sigma	605195